Name: monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00
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हम अपनी प्रयोगशाला और झोंगशान नेत्र केंद्र के नेत्र पशु प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। हम प्रायोगिक समर्थन के लिए प्रोफेसर चुनकियाओ लियू को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी: 81670872) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; बीजिंग, चीन), गुआंग्डोंग प्रांत, चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2019 ए 1515011347), और झोंगशान नेत्र केंद्र में नेत्र विज्ञान की राज्य कुंजी प्रयोगशाला से उच्च स्तरीय अस्पताल निर्माण परियोजना (अनुदान संख्या 303020103; गुआंगज़ौ, गुआंग्डोंग प्रांत, चीन)।

चूहों के उपयोग से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को झोंगशान नेत्र केंद्र, सन यात-सेन विश्वविद्यालय, चीन (अधिकृत संख्या: 2020-082) की पशु प्रयोगात्मक नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और झोंगशान नेत्र केंद्र...

ओआईआर के लिए चूहों की संवेदनशीलता कई कारकों से प्रभावित होती है। विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और उपभेदों के पिल्लों की तुलना नहीं की जा सकती है। सी अल्बिनो चूहों में, जहाजों को महत्वपूर्ण कम नवसंवहनी ट?...

रेटिना नवसंवहनीकरण (आरएनवी), जिसे एक ऐसी स्थिति के रूप में परिभाषित किया गया है जहां नए पैथोलॉजिकल वाहिकाएं मौजूदा रेटिना नसों से उत्पन्न होती हैं, आमतौर पर रेटिना की आंतरिक सतह के साथ फैली होती हैं और कांच (या कुछ स्थितियों के तहत सबरेटिनल स्पेस) में बढ़ती हैं। यह कई इस्केमिक रेटिनोपैथी की एक पहचान और सामान्य विशेषता है, जिसमें रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमैच्योरिटी (आरओपी), रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ), और प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी (पीडीआर) 2 शामिल हैं।
कई नैदानिक और प्रायोगिक टिप्पणियों ने संकेत दिया है कि इस्किमिया रेटिना नवसंवहनीकरण 3,4 का मुख्य कारण है। आरओपी में, नवजात शिशुओं को जीवित रहने की दर बढ़ाने के लिए बंद इनक्यूबेटरों में उच्च-स्तरीय ऑक्सीजन के संपर्क में लाया जाता है, जो संवहनी विकास की गिरफ्तारी के लिए एक महत्वपूर्ण चालक भी है। उपचार किए जाने के बाद, नवजात शिशुओं के रेटिना अपेक्षाकृत हाइपोक्सिक अवधि का अनुभव करते हैं5. अन्य स्थितियों को आरवीओ में केंद्रीय या शाखा रेटिना नसों के रोड़ा में देखा जाता है और रेटिना केशिकाओं की क्षति भी देखी जाती है जो पीडीआर2 में माइक्रोएंजियोपैथी के कारण होती है। हाइपोक्सिया आगे हाइपोक्सिया-प्रेरित कारक -1α (एचआईएफ -1α) सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) जैसे एंजियोजेनिक कारकों की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है जो बदले में संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को हाइपोक्सिक क्षेत्र में बढ़ने और नए जहाजों 6,7 बनानेके लिए मार्गदर्शन करता है।
आरओपी अपरिपक्व शिशुओं में संवहनी प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी का एक प्रकार है और बचपन के अंधापन 8,9 का एक प्रमुख कारण है, जो रेटिना हाइपोक्सिया, रेटिना नवसंवहनीकरण और रेशेदार हाइपरप्लासिया 10,11,12 की विशेषता है। 1950 के दशक में, शोधकर्ताओं ने पाया कि ऑक्सीजन की उच्च सांद्रता समय से पहले शिशुओं13,14 के श्वसन लक्षणों में काफी सुधार कर सकती है। नतीजतन, उस समय समय के समय के शिशुओं में ऑक्सीजन थेरेपी का तेजी से उपयोग किया गया था15. हालांकि, अपरिपक्व शिशुओं में ऑक्सीजन थेरेपी के व्यापक उपयोग के साथ समवर्ती, आरओपी की घटनाओं में साल-दर-साल वृद्धि हुई। तब से, शोधकर्ताओं ने आरओपी और आरएनवी16 के रोगजनन को समझने के लिए विभिन्न पशु मॉडल की खोज करते हुए ऑक्सीजन को आरओपी से जोड़ा है।
मानव में, अधिकांश रेटिना वास्कुलचर विकास जन्म से पहले पूरा हो जाता है जबकि कृन्तकों में रेटिना वास्कुलचर जन्म के बाद विकसित होता है, रेटिना वास्कुलचर2 में एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक सुलभ मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। अनुसंधान की निरंतर प्रगति के साथ, ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी (ओआईआर) मॉडल इस्किमिया के परिणामस्वरूप पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस की नकल करने के लिए प्रमुख मॉडल बन गए हैं। ओआईआर मॉडल के अध्ययन में कोई विशिष्ट पशु प्रजातियां नहीं हैं और मॉडल को विभिन्न जानवरों की प्रजातियों में विकसित किया गया है, जिसमें बिल्ली का बच्चा17, चूहा18, माउस19, बीगल पिल्ला20 और जेब्राफिश21 शामिल हैं। सभी मॉडल एक ही तंत्र साझा करते हैं जिसके द्वारा वे प्रारंभिक रेटिना विकास के दौरान हाइपरोक्सिया के संपर्क में आते हैं और फिर नॉर्मोक्सिक वातावरण में लौट आते हैं। स्मिथ एट अल ने देखा कि 5 दिनों के लिए पी 7 से हाइपरोक्सिया के लिए माउस पिल्ले को उजागर करने से केंद्रीय रेटिना में पोत प्रतिगमन का एक चरम रूप प्रेरित हुआ और उन्हें पी 12 में कमरे की हवा में वापस लाने से धीरे-धीरे नवसंवहनी टफ्ट्स को ट्रिगर किया गया, जो कांच के शरीर की ओर बढ़ गया19. यह एक मानकीकृत ओआईआर माउस मॉडल था जिसे स्मिथ मॉडल भी कहा जाता था। कॉनर एट अल ने प्रोटोकॉल को और अनुकूलित किया और 2009 में वीओ (वासो-विलोपन) और एनवी (नवसंवहनीकरण) के क्षेत्र को मापने के लिए एक सार्वभौमिक रूप से लागू विधि प्रदान की, जिसने मॉडल22 की स्वीकृति और उपयोग में वृद्धि की। ओआईआर माउस मॉडल अभी भी अपने छोटे आकार, तेजी से प्रजनन, स्पष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि, अच्छी पुनरावृत्ति और उच्च सफलता दर के कारण सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है।
चूहों में, रेटिना संवहनीकरण जन्म के बाद ऑप्टिक तंत्रिका सिर से ओरा सेरेटा की ओर आंतरिक रेटिना में वाहिकाओं की वृद्धि के साथ शुरू होता है। सामान्य रेटिना विकास के दौरान, पहले रेटिना वाहिकाएं जन्म के आसपास ऑप्टिक तंत्रिका सिर से अंकुरित होती हैं, जिससे एक विस्तारनेटवर्क (प्राथमिक जाल) बनता है जो प्रसवोत्तर दिन 7 (पी 7) 23 के आसपास परिधि तक पहुंचता है। फिर जहाजों को रेटिना में एक गहरी परत बनाने, रेटिना में प्रवेश करने और मानव 24 के रूप में आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) के चारों ओर एक लामिना नेटवर्क स्थापित करने के लिए बढ़ना शुरू होजाता है। तीसरे प्रसवोत्तर सप्ताह (पी 21) के अंत तक, गहरा जाल विकास लगभग पूरा हो गया है। ओआईआर माउस मॉडल के लिए, संवहनी रोड़ा हमेशा केंद्रीय रेटिना में दिखाई देता है क्योंकि हाइपरोक्सिया एक्सपोजर के दौरान मध्य क्षेत्र में बड़ी संख्या में अपरिपक्व संवहनी नेटवर्क का तेजी से अध: पतन होता है। तो, पैथोलॉजिकल नवसंवहनीकरण की वृद्धि मध्य-परिधीय रेटिना में भी होती है, जो गैर-छिड़काव क्षेत्र और संवहनी क्षेत्र की सीमा है। हालांकि, मानव रेटिना वाहिकाएं जन्म से पहले लगभग बन गई हैं। समय से पहले शिशुओं के लिए, हाइपरोक्सिया25,26 के संपर्क में आने पर परिधीय रेटिना पूरी तरह से संवहनी नहीं होती है। तो संवहनी रोड़ा और नवसंवहनीकरण मुख्य रूप से परिधीय रेटिना27,28 में दिखाई देते हैं। इन मतभेदों के बावजूद, माउस ओआईआर मॉडल इस्किमिया-प्रेरित नवसंवहनीकरण के दौरान होने वाली पैथोलॉजिकल घटनाओं को बारीकी से दोहराता है।
ओआईआर मॉडल के प्रेरण को दो चरणों में विभाजित किया जा सकता है29: चरण 1 (हाइपरोक्सिया चरण) में, रेटिना संवहनी विकास को वीईजीएफ में गिरावट और एंडोथेलियल कोशिकाओं के एपोप्टोसिस के परिणामस्वरूप रक्त वाहिकाओं के रोड़ा और प्रतिगमन के साथ गिरफ्तार या मंद किया जाता है24,30; चरण 2 (हाइपोक्सिया चरण) में, रेटिना ऑक्सीजन की आपूर्ति कमरे की हवा की स्थिति29 के तहत अपर्याप्त हो जाएगी, जो तंत्रिका विकास और होमियोस्टेसिस19,31 के लिए आवश्यक है। इस्केमिक स्थिति के परिणामस्वरूप आमतौर पर अनियमित, असामान्य नवसंवहनीकरण होता है।
वर्तमान में, आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली मॉडलिंग विधि उच्च / निम्न ऑक्सीजन एक्सपोजर को बारी-बारी से कर रही है: माताओं और उनके पिल्ले पी 7 पर 5 दिनों के लिए 75% ऑक्सीजन के संपर्क में हैं, इसके बाद कमरे की हवा में 5 दिनों तक पी 17 ने तुलनीय परिणाम22 का प्रदर्शन किया, जो ओआईआर माउस मॉडल प्रेरण का समापन बिंदु है। (चित्र 1)। आरओपी का अनुकरण करने के अलावा, इस इस्किमिया-मध्यस्थता वाले पैथोलॉजिकल नियोवास्कुलराइजेशन का उपयोग अन्य इस्केमिक रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इस मॉडल के मुख्य माप में वीओ और एनवी के क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करना शामिल है, जिसका विश्लेषण रेटिना फ्लैट माउंट से इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला या एफआईटीसी-डेक्सट्रान छिड़काव द्वारा किया जाता है। घातक ऑपरेशन के कारण प्रत्येक माउस का केवल एक बार अध्ययन किया जा सकता है। वर्तमान में, संवहनी प्रतिगमन और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस32 की प्रक्रिया के दौरान लगातार रेटिना वास्कुलचर के गतिशील परिवर्तनों का निरीक्षण करने के कुछ तरीके हैं। इस पत्र में, हम ओआईआर मॉडल प्रेरण का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, रेटिना फ्लैट माउंट का विश्लेषण और साथ ही चूहों पर फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) का वर्कफ़्लो जो ओआईआर माउस मॉडल के दो चरणों के दौरान संवहनी गतिशील परिवर्तनों की अधिक व्यापक समझ हासिल करने में सहायक होगा।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0550</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>&#160;FG701-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CC 2019</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td>For labeling nucleus on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td>For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>&#160;0100-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropyl Methylcellulose</td>
			<td>Maya</td>
			<td>89161</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4 594 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57/BL6J</td>
			<td>GemPharmatech of Jiangsu Province</td>
			<td></td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;501978-6</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For monitoring the level of O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyCycler</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>A84XOV</td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>For tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRALIS HRA+OCT</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>HC00500002</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Statistics 22.0</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tansference decloring shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>ZD-2008</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (Low attachment)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3261-20EA</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;SLBW6818</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition and export</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model

ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी (ओआईआर) का व्यापक रूप से इस्कीमिक रेटिना रोगों में असामान्य पोत वृद्धि का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमैच्योरिटी (आरओपी), प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी (पीडीआर), और रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) शामिल हैं। अधिकांश ओआईआर अध्ययन विशिष्ट समय बिंदुओं पर रेटिना नवसंवहनीकरण का निरीक्षण करते हैं; हालांकि, एक समय पाठ्यक्रम के साथ जीवित चूहों में गतिशील पोत वृद्धि, जो ओआईआर से संबंधित पोत रोगों को समझने के लिए आवश्यक है, को कम करके आंका गया है। यहां, हम ओआईआर माउस मॉडल के प्रेरण के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, संभावित नुकसान को उजागर करते हैं, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग करके वासो-विलोपन (वीओ) और नवसंवहनीकरण (एनवी) के क्षेत्रों को जल्दी से मापने के लिए एक बेहतर विधि प्रदान करते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि हमने ओआईआर माउस मॉडल में फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) करके पी 15 से पी 25 तक जीवित चूहों में पोत पुनर्विकास की निगरानी की। ओआईआर माउस मॉडल के लिए एफएफए का आवेदन हमें पोत पुनर्विकास के दौरान रीमॉडेलिंग प्रक्रिया का निरीक्षण करने की अनुमति देता है।

ओआईआर माउस मॉडल में, सबसे महत्वपूर्ण और बुनियादी परिणाम वीओ और एनवी क्षेत्र का परिमाणीकरण है। पी 7 से 5 दिनों के लिए हाइपरोक्सिया वातावरण में रहने के बाद, पिल्ले के केंद्रीय रेटिना ने सबसे बड़ा गैर-छिड़?...

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Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

यह प्रोटोकॉल चूहों रेटिना फ्लैट माउंट और विश्लेषण की तैयारी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है। चूहों के पिल्ले और छवि प्रसंस्करण के लिए फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) के उपयोग का भी विस्तार से वर्णन किया गया है।

ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी माउस मॉडल में रेटिना वाहिकाओं के गतिशील विकास की निगरानी

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को चूहों के रेटिना को आसानी से अलग करने और ओआईआर माउस मॉडल के रेटिना वास्कुलचर में गतिशील परिवर्तनों का निरीक्षण करने में मदद कर सकता है। इस पद्धति के मुख्य फायदे अलग रेटिना की अखंडता का संरक्षण हैं और प्रत्येक माउस को अपने स्वयं के नियंत्रण के रूप में सेवा करने की अनुमति देते हैं, जो परिणामों को अधिक तुलनीय बनाता है। पहली बार इस पद्धति की कोशिश करने वाले शोधकर्ता पांच अभिविन्यास इमेजिंग लेते समय संघर्ष कर सकते हैं क्योंकि पिल्लों को सही स्थिति में रखना थोड़ा मुश्किल है।रेटिना पूरे बढ़ते के लिए ऊतक इकट्ठा करने के लिए, एक इच्छामृत्यु सी 57-ब्लैक / 6 पिल्ला के कक्षीय ऊतक से नेत्रगोलक को डिस्कनेक्ट करने के लिए घुमावदार कैंची का उपयोग करें। फिर, नेत्रगोलक के पीछे के हिस्से में घुमावदार संदंश डालें, ऑप्टिक तंत्रिका को क्लैंप करें और जल्दी से कक्षा से आंख को उठाएं। सतह से किसी भी बाल और रक्त को हटाने के लिए नेत्रगोलक को प्री-कूल्ड पीबीएस में रखें।जब सभी नेत्रगोलक एकत्र किए जाते हैं, तो साफ की गई आंखों को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड युक्त दो-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट और प्रति मिनट 12 से 15 क्रांतियों के लिए सेते हैं। इनक्यूबेशन के अंत में, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक संस्कृति पकवान के केंद्र में पीबीएस की एक बूंद जोड़ें, और ड्रॉप में एक नेत्रगोलक रखें। संदंश की एक जोड़ी के साथ नेत्रगोलक पकड़े हुए, कॉर्नियल लिम्बस पर कॉर्निया को सावधानीपूर्वक पंचर करने के लिए एक मिलीलीटर सिरिंज सुई का उपयोग करें।पंचर में कैंची की एक जोड़ी की नोक डालें, और कॉर्नियल लिम्बस के साथ कॉर्निया को काटें, सावधान रहें कि रेटिना को न काटें। आईरिस और लेंस को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और शेष आईकप को शेकर पर कमरे के तापमान पर 45 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, एक नई संस्कृति पकवान के केंद्र में पीबीएस की एक ताजा बूंद में निश्चित आईकप रखें।संदंश की एक जोड़ी के साथ आंखों के कप पकड़े हुए, रेटिना और श्वेतपटल परतों को धीरे से अलग करने के लिए संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें। रेटिना और श्वेतपटल परतों के बीच कैंची की नोक रखें, और श्वेतपटल को ऑप्टिक तंत्रिका की ओर काटें। रेटिना कप प्राप्त करने के लिए रेटिना से श्वेतपटल को छीलें।संदंश का उपयोग करके, रेडियल हाइलॉइड वाहिकाओं और परिधीय रेटिना के बीच संबंध जारी करें। शेकर पर कमरे के तापमान पीबीएस में तीन पांच मिनट के धोने के लिए रेटिना कप को 48-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करने के लिए टिप कट के साथ दो मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें। आखिरी धोने के बाद, कप को 1% ट्राइटन एक्स -100 और पीबीएस में 5% सामान्य गधे सीरम में चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।आइसोलेक्टिन बी 4 के साथ रेटिना वास्कुलचर को लेबल करने के लिए, रेटिना को 400 माइक्रोलीटर 0.1% सामान्य गधे सीरम में 48-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में सेते हैं, जो एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आइसोलेक्टिन बी 4-594 के साथ पूरक होता है। यदि आवश्यक हो, तो एक ही समय में एक और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ा जा सकता है। अगले दिन, शेकर पर 0.1% पीबीएसटी में तीन 20 मिनट के धोने के साथ रेटिना को धो लें।अंतिम धोने के बाद, 20 से 25 मिनट के लिए डीएपीआई के साथ नमूना लेबल करने से पहले कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए एक उपयुक्त उच्च आत्मीयता माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ रेटिना सेते हैं। इनक्यूबेशन के अंत में, झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 0.1% पीबीएसटी में तीन 30 मिनट के धोने के साथ रेटिना को धो लें। अंतिम धोने के बाद, रेटिना कप को उद्घाटन के साथ एक साफ स्लाइड में स्थानांतरित करें, और ऑप्टिक तंत्रिका सिर से एक से 1.5 मिलीमीटर तक परिधि से केंद्र की ओर तीन, छह, नौ और 12 बजे की स्थिति में रेटिना को रेडियल रूप से काटने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।रेटिना को सूखने और समतल करने के लिए हवा से रखे कागज का उपयोग करने से पहले प्रति धोने पीबीएस की कुछ बूंदों के साथ रेटिना को तीन बार कुल्लाएं। कवरस्लिप के केंद्र में बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें जब तक कि छोटी बूंद का व्यास कवरस्लिप के आधे हिस्से को कवर न करे। फिर जल्दी से कवरस्लिप बढ़ते मध्यम पक्ष को आउटस्प्रेड रेटिना पर रखें।एक बार जब सभी रेटिना फ्लैट माउंट तैयार हो जाते हैं, तो नमूनों को कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया जा सकता है। विवो इमेजिंग के लिए, लंबे समय तक चलने वाले पुतली फैलाव को प्राप्त करने के लिए मायड्रियाटिक आंखों की बूंदों के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच मिनट के बाद, पिल्ले को इमेजिंग डिवाइस के सामने एक छोटे हीटिंग पैड पर एक स्थिर स्थिति में रखें।कॉर्निया में नमी बनाए रखने के लिए, नियमित रूप से इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान कृत्रिम आँसू जोड़ें। अगला, स्क्रीन के केंद्र में ऑप्टिक तंत्रिका सिर को समायोजित करने के लिए डिवाइस पर इन्फ्रारेड फंडस इमेजिंग पर क्लिक करें। इंट्रापेरिटोनियल रूप से 0.5% फ्लोरोसिन सोडियम नमक समाधान के 150 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें, और टाइमर शुरू करने के लिए इमेजिंग डिवाइस के टच पैनल पर तुरंत एफए और इंजेक्शन बटन पर क्लिक करें।तीन मिनट के बाद, जब रेटिना का रक्त परिसंचरण शिरापरक चरण में प्रवेश कर गया है, तो केंद्रीय रेटिना की पहली छवि प्राप्त करें। इमेजिंग डिवाइस के लेंस को क्षैतिज रूप से आंख के नाक की तरफ ले जाएं जब तक कि ऑप्टिक तंत्रिका सिर छवि अधिग्रहण क्षेत्र के एक तरफ के मध्य बिंदु पर स्थित न हो, और दूसरी छवि लें। लेंस को स्थानांतरित करना जारी रखें और उसी तरह से अस्थायी, श्रेष्ठ और अवर रेटिना की छवियों को प्राप्त करें।एक उपयुक्त इमेजिंग प्रोसेसिंग प्रोग्राम में रेटिना छवियों को संसाधित करने के लिए, फ़ाइल मेनू खोलें और एक काली पृष्ठभूमि के साथ एक नया कैनवास बनाने के लिए नया क्लिक करें। केंद्रीय रेटिना की छवि खोलें। फिर दूसरी छवि जोड़ने के लिए फ़ाइल पर क्लिक करें।दूसरी छवि की अपारदर्शिता को 60% तक समायोजित करें और दो छवियों के ओवरलैप होने तक छवि को स्थानांतरित और आकार बदलें। फ्री ट्रांसफ़ॉर्म और ताना मोड के बीच स्विच करें पर क्लिक करें, और यदि आवश्यक हो तो जहाजों में सूक्ष्म समायोजन करें। फिर दूसरी छवि की अपारदर्शिता को 100% पर वापस सेट करें दोनों छवियों का चयन करें, और ऑटो-ब्लेंड लेयर्स पर क्लिक करें।मिश्रण विधि के रूप में पैनोरमा की जाँच करें, और निर्बाध टोन और रंग और सामग्री जागरूक भरण पारदर्शी क्षेत्रों के लिए बक्से की भी जाँच करें। पहले दो छवियों की सिलाई को पूरा करने के लिए ठीक क्लिक करें। अगला, तीसरी छवि जोड़ें, और इस छवि को पहली दो छवियों में सिलाई करें जैसा कि एक रेटिना से सभी पांच छवियों को सिलाई नहीं किया जाता है।जब विश्लेषण से सभी छवियों को संसाधित किया गया है, तो विभिन्न विकास समय बिंदुओं पर रेटिना वास्कुलचर गतिशीलता में परिवर्तन के अवलोकन की सुविधा के लिए एफएफए छवियों को एक समान आकार में क्रॉप करने के लिए क्रॉप टूल का उपयोग करें। हाइपरोक्सिया के संपर्क में आने के पांच दिनों के बाद, प्रसवोत्तर दिन 12 पिल्ले के केंद्रीय रेटिना एक बड़े गैर-छिड़काव क्षेत्र का प्रदर्शन करते हैं। हाइपोक्सिक स्थितियों के पांच दिनों में स्थानांतरित होने पर, रेटिना धीरे-धीरे नवसंवहनीकरण करते हैं, जो आसपास के सामान्य जहाजों में देखे गए प्रतिदीप्ति संकेत में वृद्धि को प्रदर्शित करते हैं।प्रसवोत्तर दिन 17 के बाद, पैथोलॉजिकल नवसंवहनीकरण तेजी से पीछे हट जाता है और रेटिना प्रसवोत्तर दिन 25 तक पूरी तरह से सामान्य उपस्थिति प्रदर्शित करता है। ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी मॉडल की एक अच्छी पुनरावृत्ति और स्थिरता पिल्ले के कूड़े के आकार और प्रसवोत्तर वजन को नियंत्रित करके प्राप्त की जा सकती है। जैसा कि देखा गया है, वासो-विलोपन आमतौर पर प्रसवोत्तर दिन 12 पर चोटियों और प्रसवोत्तर दिन 25 पर गायब हो जाता है जबकि नवसंवहनीकरण प्रसवोत्तर दिन 17 पर चोटियों और प्रसवोत्तर दिन 25 तक प्रतिगमन होता है।प्रसवोत्तर दिन 15 से 25 ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी चूहों में, रेटिना रक्त वाहिका व्यास बढ़ जाता है और सामान्य चूहों के रेटिना के लिए देखे जाने की तुलना में अत्यधिक यातनापूर्ण हो जाता है। बाएं हाथ में संदंश मुख्य रूप से एक सहायक भूमिका में खेलते हैं। ध्यान रखें कि नेत्रगोलक को निचोड़ना न हो, जो इसे विकृत या तोड़ सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

लाइट ठीक चिकित्सकीय चिपकने वाला राल के बढ़ते जीर्ण प्रयोगों में इलेक्ट्रोड या microdialysis जांच के लिए आवेदन

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

लाइट के पूरे सेल रिकॉर्डिंग रेटिना स्लाइस में उत्तेजक Synaptic धाराओं पैदा

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Vivo इमेजिंग और डिम्बग्रंथि के कैंसर के एक Orthotopic माउस मॉडल में चिकित्सीय उपचार में

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

माउस आँखों से रेटिना स्टेम सेल के अलगाव

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

निगरानी Apoptosis के दौरान Mitochondrial कैल्शियम स्तर में गतिशील परिवर्तन एक आनुवंशिक एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर का उपयोग

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Crustacean साथ लंबी अवधि के घातक विषाक्तता टेस्ट Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

एक माउस मॉडल के मान्यकरण एक सेल विशेष तरीके में LINC परिसर बाधित करने के लिए

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

माउस ब्लड वेसल्स का एन फेस तैयार करना

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

डायनामिक सेलुलर प्रोट्र्रेशन में प्रोटीन एकाग्रता के सॉफ़्टवेयर-सहायता प्राप्त ट्रैकिंग के लिए एक ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

ट्रांस-इनर सेल भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन उच्च Chimerism दरों की ओर जाता है

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...