Name: monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00
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Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio e del laboratorio oftalmico per animali del Centro oftalmico di Zhongshan per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Prof. Chunqiao Liu per il supporto sperimentale. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Pechino, Cina), la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong, Cina (Grant No.2019A1515011347) e il progetto di costruzione di ospedali di alto livello dello State Key Laboratory of Ophthalmology presso il Centro oftalmico di Zhongshan (Grant No. 303020103; Guangzhou, provincia del Guangdong, Cina).

Tutte le procedure che prevedono l'uso di topi sono state approvate dal comitato etico sperimentale sugli animali del Centro oftalmico di Zhongshan, Sun Yat-sen University, Cina (numero autorizzato: 2020-082) e in conformità con le linee guida approvate del Comitato per la cura e l'uso degli animali del Centro oftalmico di Zhongshan e la dichiarazione dell'Associazione di ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Induzione del modello OIR...

La suscettibilità dei topi all'OIR è influenzata da molti fattori. I cuccioli di diverso background genetico e ceppi non possono essere confrontati. Nei topi albini BALB/c, i vasi ricrescono rapidamente nell'area VO con ciuffi neovascolari significativamente ridotti38, che portano alcune difficoltà alla ricerca. Nei topi C57BL/6, c'è un aumento del danno ai fotorecettori rispetto al ceppo murino BALB/cJ39,40. Lo stesso vale per diversi...

La neovascolarizzazione retinica (RNV), definita come uno stato in cui nuovi vasi patologici hanno origine da vene retiniche esistenti, di solito si estende lungo la superficie interna della retina e cresce nello spazio vitreo (o sottoretinico in alcune condizioni)1. È un segno distintivo e una caratteristica comune di molte retinopatie ischemiche, tra cui la retinopatia del prematuro (ROP), l'occlusione venosa retinica (RVO) e la retinopatia diabetica proliferativa (PDR)2.
Numerose osservazioni cliniche e sperimentali hanno indicato che l'ischemia è la causa principale della neovascolarizzazione retinica 3,4. Nella ROP, i neonati sono esposti ad ossigeno ad alto livello in incubatori chiusi per aumentare i tassi di sopravvivenza, che è anche un importante fattore per l'arresto della crescita vascolare. Dopo il trattamento, le retine dei neonati sperimentano un periodo relativamente ipossico5. Altre situazioni sono osservate nell'occlusione delle vene retiniche centrali o ramificate nella RVO e si osserva anche un danno dei capillari retinici causato dalla microangiopatia nella PDR2. L'ipossia aumenta ulteriormente l'espressione di fattori angiogenici come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) attraverso la via di segnalazione del fattore 1α indotto dall'ipossia (HIF-1α) che a sua volta guida le cellule endoteliali vascolari a crescere nell'area ipossica e formare nuovi vasi 6,7.
La ROP è una sorta di retinopatia proliferativa vascolare nei neonati pretermine e una delle principali cause di cecità infantile 8,9, che è caratterizzata da ipossia retinica, neovascolarizzazione retinica e iperplasia fibrosa10,11,12. Nel 1950, i ricercatori hanno scoperto che un'alta concentrazione di ossigeno può migliorare significativamente i sintomi respiratori dei neonati prematuri13,14. Di conseguenza, l'ossigenoterapia è stata sempre più utilizzata nei neonati prematuri in quel momento15. Tuttavia, in concomitanza con l'uso diffuso dell'ossigenoterapia nei neonati pretermine, l'incidenza della ROP è aumentata di anno in anno. Da allora, i ricercatori hanno collegato l'ossigeno alla ROP, esplorando vari modelli animali per comprendere la patogenesi di ROP e RNV16.
Nell'uomo, la maggior parte dello sviluppo vascolare retinico è completato prima della nascita, mentre nei roditori la vascolarizzazione retinica si sviluppa dopo la nascita, fornendo un sistema modello accessibile per studiare l'angiogenesi nella vascolarizzazione retinica2. Con il continuo progresso della ricerca, i modelli di retinopatia indotta da ossigeno (OIR) sono diventati modelli importanti per imitare l'angiogenesi patologica derivante dall'ischemia. Non ci sono specie animali specifiche nello studio del modello OIR e il modello è stato sviluppato in varie specie animali, tra cui gattino 17, ratto18, topo19, cucciolo di beagle 20 e zebrafish21. Tutti i modelli condividono lo stesso meccanismo con cui sono esposti all'iperossia durante lo sviluppo precoce della retina e poi restituiti all'ambiente normossico. Smith et al. hanno osservato che l'esposizione di cuccioli di topo all'iperossia da P7 per 5 giorni ha indotto una forma estrema di regressione dei vasi nella retina centrale e riportandoli all'aria della stanza a P12 ha gradualmente innescato ciuffi neovascolari, che sono cresciuti verso il corpo vitreo19. Questo era un modello di topo OIR standardizzato chiamato anche modello di Smith. Connor et al. hanno ulteriormente ottimizzato il protocollo e fornito un metodo universalmente applicabile per quantificare l'area di VO (vaso-obliterazione) e NV (neovascolarizzazione) nel 2009, che ha aumentato l'accettazione e l'utilizzo del modello22. Il modello murino OIR è ancora il modello più utilizzato ora a causa delle sue piccole dimensioni, della riproduzione veloce, del chiaro background genetico, della buona ripetibilità e dell'alto tasso di successo.
Nei topi, la vascolarizzazione retinica inizia dopo la nascita con la crescita dei vasi dalla testa del nervo ottico nella retina interna verso l'ora serrata. Durante il normale sviluppo retinico, i primi vasi retinici spuntano dalla testa del nervo ottico intorno alla nascita, formando una rete in espansione (il plesso primario) che raggiunge la periferia intorno al giorno postnatale 7 (P7) 23. Quindi i vasi iniziano a crescere nella retina per formare uno strato profondo, penetrare nella retina e stabilire una rete laminare attorno allo strato nucleare interno (INL) come nell'uomo24. Entro la fine della terza settimana postnatale (P21), lo sviluppo del plesso più profondo è quasi completato. Per il modello murino OIR, l'occlusione vascolare appare sempre nella retina centrale a causa della rapida degenerazione di un gran numero di reti vascolari immature nella regione centrale durante l'esposizione all'iperossia. Quindi, la crescita della neovascolarizzazione patologica si verifica anche nella retina medio-periferica, che è il confine dell'area di non perfusione e dell'area vascolare. Tuttavia, i vasi retinici umani si sono quasi formati prima della nascita. Per quanto riguarda i neonati prematuri, la retina periferica non è completamente vascolarizzata quando esposta all'iperossia25,26. Quindi l'occlusione vascolare e la neovascolarizzazione compaiono principalmente nella retina periferica27,28. Nonostante queste differenze, il modello OIR murino ricapitola da vicino gli eventi patologici che si verificano durante la neovascolarizzazione indotta da ischemia.
L'induzione del modello OIR può essere suddivisa in due fasi29: nella fase 1 (fase iperoxia), lo sviluppo vascolare retinico viene arrestato o ritardato con occlusione e regressione dei vasi sanguigni a seguito del declino del VEGF e dell'apoptosi delle cellule endoteliali 24,30; Nella fase 2 (fase ipossia), l'apporto di ossigeno retinico diventerà insufficiente in condizioni di aria ambiente29, che è essenziale per lo sviluppo neurale e l'omeostasi 19,31. Questa situazione ischemica di solito si traduce in neovascolarizzazione anomala non regolata.
Attualmente, il metodo di modellazione comunemente usato è l'alternanza di esposizione all'ossigeno alto/basso: le madri e i loro cuccioli sono esposti al 75% di ossigeno per 5 giorni a P7 seguiti da 5 giorni in aria ambiente fino a quando P17 ha dimostrato risultati comparabili22, che è il punto finale dell'induzione del modello murino OIR. (Figura 1). Oltre a simulare la ROP, questa neovascolarizzazione patologica mediata da ischemia può essere utilizzata anche per studiare altre malattie ischemiche della retina. Le principali misurazioni di questo modello includono la quantificazione dell'area di VO e NV, che vengono analizzate da supporti piatti retinici mediante colorazione con immunofluorescenza o perfusione FITC-destrano. Ogni topo può essere studiato solo una volta a causa dell'operazione letale. Allo stato attuale, ci sono pochi metodi per osservare continuamente i cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica durante il processo di regressione vascolare e angiogenesi patologica32. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato di induzione del modello OIR, analisi di supporti piatti retinici e un flusso di lavoro di angiografia del fondo oculare (FFA) con fluoresceina sui topi che sarebbe utile per ottenere una comprensione più completa dei cambiamenti dinamici vascolari durante due fasi del modello murino OIR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0550</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>&#160;FG701-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CC 2019</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td>For labeling nucleus on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td>For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>&#160;0100-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropyl Methylcellulose</td>
			<td>Maya</td>
			<td>89161</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4 594 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57/BL6J</td>
			<td>GemPharmatech of Jiangsu Province</td>
			<td></td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;501978-6</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For monitoring the level of O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyCycler</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>A84XOV</td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>For tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRALIS HRA+OCT</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>HC00500002</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Statistics 22.0</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tansference decloring shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>ZD-2008</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (Low attachment)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3261-20EA</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;SLBW6818</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition and export</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model

La retinopatia indotta da ossigeno (OIR) è ampiamente utilizzata per studiare la crescita anormale dei vasi nelle malattie ischemiche della retina, tra cui la retinopatia della prematurità (ROP), la retinopatia diabetica proliferativa (PDR) e l'occlusione venosa retinica (RVO). La maggior parte degli studi OIR osserva la neovascolarizzazione retinica in punti temporali specifici; tuttavia, la crescita dinamica dei vasi nei topi vivi lungo un corso temporale, che è essenziale per comprendere le malattie dei vasi correlate all'OIR, è stata poco studiata. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo per l'induzione del modello murino OIR, evidenziando le potenziali insidie e fornendo un metodo migliorato per quantificare rapidamente le aree di vaso-obliterazione (VO) e neovascolarizzazione (NV) utilizzando la colorazione con immunofluorescenza. Ancora più importante, abbiamo monitorato la ricrescita dei vasi in topi vivi da P15 a P25 eseguendo l'angiografia del fondo oculare con fluoresceina (FFA) nel modello murino OIR. L'applicazione di FFA al modello murino OIR ci consente di osservare il processo di rimodellamento durante la ricrescita dei vasi.

Nel modello murino OIR, il risultato più importante e basilare è la quantificazione dell'area VO e NV. Dopo aver vissuto nell'ambiente iperossia per 5 giorni da P7, la retina centrale dei cuccioli ha mostrato la più grande area di non perfusione. Sotto la stimolazione dell'ipossia in altri 5 giorni, è stata gradualmente prodotta la neovascolarizzazione retinica che ha fluorescenza più intensamente rispetto ai vasi normali circostanti. Dopo P17, il segnale di fluorescenza della neovascolarizzazione patologica è regr...

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Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l'analisi. Anche l'uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l'elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.

Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Questo protocollo può aiutare i ricercatori a separare facilmente le retine dei topi e osservare i cambiamenti dinamici nella vascolarizzazione retinica del modello murino OIR. I principali vantaggi di questo metodo sono la conservazione dell'integrità delle retine separate e la possibilità che ogni topo funga da controllo proprio, il che rende i risultati più comparabili. I ricercatori che provano questo metodo per la prima volta potrebbero avere difficoltà durante l'acquisizione delle cinque immagini di orientamento perché è un po 'difficile posizionare i cuccioli nella posizione corretta.Per raccogliere il tessuto per l'intero montaggio della retina, utilizzare forbici curve per scollegare i bulbi oculari dal tessuto orbitale di un cucciolo di C57-Black / 6 eutanasia. Quindi, inserire una pinza curva nella parte posteriore del bulbo oculare, bloccando il nervo ottico e sollevando rapidamente l'occhio dall'orbita. Posizionare i bulbi oculari in PBS pre-raffreddato per rimuovere eventuali peli e sangue dalla superficie.Quando tutti i bulbi oculari sono stati raccolti, trasferire i bulbi oculari puliti in un tubo di microcentrifuga da due millilitri contenente il 4% di paraformaldeide e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente e da 12 a 15 giri al minuto. Alla fine dell'incubazione, aggiungere una goccia di PBS al centro di un piatto di coltura al microscopio da dissezione e posizionare un bulbo oculare nella goccia. Tenendo il bulbo oculare con un paio di pinze, utilizzare un ago da siringa da un millilitro per perforare accuratamente la cornea al limbus corneale.Inserire la punta di un paio di forbici nella puntura e tagliare la cornea lungo il limbus corneale, facendo attenzione a non tagliare la retina. Utilizzare una pinza per rimuovere l'iride e la lente e posizionare la concia oculare rimanente in paraformaldeide al 4% per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente sullo shaker. Alla fine dell'incubazione, posizionare la coppa oculare fissa in una goccia fresca di PBS al centro di un nuovo piatto di coltura.Tenendo la concia oculare con un paio di pinze, utilizzare un secondo paio di pinze per separare delicatamente gli strati di retina e sclera. Posizionare la punta delle forbici tra gli strati di retina e sclera e tagliare la sclera verso il nervo ottico. Staccare la sclera dalla retina per ottenere la coppa retinica.Utilizzando una pinza, rilasciare la connessione tra i vasi ialoidi radiali e la retina periferica. Utilizzare una pipetta da due millilitri con la punta tagliata per trasferire la coppa retinica in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti per tre lavaggi di cinque minuti in PBS a temperatura ambiente sullo shaker. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la tazza in 1% Triton X-100 e 5% siero d'asino normale in PBS durante la notte a quattro gradi Celsius.Per etichettare la vascolarizzazione retinica con isolectina B4, incubare la retina in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti in 400 microlitri 0,1% siero normale d'asina integrato con isolectina B4-594 durante la notte a 4 gradi Celsius su uno shaker. Se necessario, è possibile aggiungere contemporaneamente un altro anticorpo primario. Il giorno seguente, lavare la retina con tre lavaggi di 20 minuti in 0,1% PBST sullo shaker.Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la retina con un anticorpo secondario appropriato ad alta affinità per un'ora a temperatura ambiente prima di marcare il campione con DAPI per 20-25 minuti. Alla fine dell'incubazione, lavare la retina con tre lavaggi di 30 minuti in 0,1% PBST a temperatura ambiente con agitazione. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la coppa retinica su un vetrino pulito con l'apertura rivolta verso l'alto e utilizzare il microscopio per tagliare la retina radialmente nelle posizioni a tre, sei, nove e 12 ore dalla periferia verso il centro, fino a uno a 1,5 millimetri dalla testa del nervo ottico.Risciacquare la retina tre volte con alcune gocce di PBS per lavaggio prima di utilizzare carta posata all'aria per asciugare e appiattire la retina. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio al centro del coprislip fino a quando il diametro della goccia copre metà del coprifoglio. Quindi posizionare rapidamente il lato medio di montaggio del coprislip verso il basso sulla retina diffusa.Una volta che tutti i supporti piatti retinici sono stati preparati, i campioni possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza confocale. Per l'imaging in vivo, aggiungere 20 microlitri di collirio midriatico per ottenere una dilatazione della pupilla di lunga durata. Dopo cinque minuti, posizionare i cuccioli in una posizione stabile su una piccola piastra elettrica davanti al dispositivo di imaging.Per mantenere l'umidità nelle cornee, aggiungere regolarmente lacrime artificiali durante la procedura di imaging. Quindi, fare clic su Infrared Fundus Imaging sul dispositivo per regolare la testa del nervo ottico al centro dello schermo. Iniettare per via intraperitoneale 150 microlitri di soluzione di sale sodico di fluoresceina allo 0,5% e fare immediatamente clic sui pulsanti FA e Iniezione sul pannello a sfioramento del dispositivo di imaging per avviare il timer.Dopo tre minuti, quando la circolazione sanguigna della retina è entrata nella fase venosa, acquisire la prima immagine della retina centrale. Spostare la lente del dispositivo di imaging orizzontalmente sul lato nasale dell'occhio fino a quando la testa del nervo ottico si trova nel punto medio di un lato dell'area di acquisizione dell'immagine e scattare la seconda immagine. Continua a muovere l'obiettivo e acquisisci immagini della retina temporale, superiore e inferiore allo stesso modo.Per elaborare le immagini retiniche in un programma di elaborazione delle immagini appropriato, aprire il menu File e fare clic su Nuovo per creare una nuova area di disegno con uno sfondo nero. Apri l'immagine della retina centrale. Quindi fare clic su File per aggiungere una seconda immagine.Regola l'opacità della seconda immagine al 60% e sposta e ridimensiona l'immagine fino a quando le due immagini non si sovrappongono. Fate clic su Passa tra le modalità Trasformazione libera (Free Transform) e alterazione (Warp Mode) e, se necessario, apportate lievi regolazioni ai recipienti. Quindi impostate nuovamente l'opacità della seconda immagine su 100%Selezionare entrambe le immagini e fare clic su Livelli di fusione automatica.Selezionare Panorama come metodo di fusione, quindi selezionare le caselle Toni e colori senza soluzione di continuità e Aree trasparenti di riempimento sensibili al contenuto. Fare clic su OK per completare l'unione delle prime due immagini. Quindi, aggiungi la terza immagine e unisci questa immagine alle prime due immagini come dimostrato fino a quando tutte e cinque le immagini di una singola retina sono state cucite.Quando tutte le immagini dell'analisi sono state elaborate, utilizzare lo strumento di ritaglio per ritagliare le immagini FFA a una dimensione uniforme per facilitare l'osservazione dei cambiamenti nelle dinamiche vascolarizzanti retiniche in diversi punti temporali dello sviluppo. Dopo cinque giorni di esposizione all'iperossia, le retine centrali dei cuccioli postnatali del giorno 12 mostrano un'ampia area di non perfusione. Dopo il trasferimento a cinque giorni di condizioni ipossiche, le retine gradualmente neovascolarizzano, mostrando un aumento del segnale di fluorescenza più forte di quello osservato nei vasi normali circostanti.Dopo il giorno 17 postnatale, la neovascolarizzazione patologica regredisce rapidamente e la retina mostra un aspetto completamente normale entro il giorno 25 postnatale. Una buona ripetibilità e stabilità del modello di retinopatia indotta dall'ossigeno può essere ottenuta controllando le dimensioni della cucciolata e l'aumento di peso postnatale dei cuccioli. Come osservato, la vaso-obliterazione raggiunge tipicamente il picco al giorno postnatale 12 e scompare al giorno postnatale 25, mentre la neovascolarizzazione raggiunge il picco al giorno postnatale 17 e regredisce entro il giorno postnatale 25.Nel giorno postnatale da 15 a 25 topi con retinopatia indotta da ossigeno, il diametro dei vasi sanguigni retinici aumenta e diventa altamente tortuoso rispetto a quello osservato per le retine dei topi normali. Le pinze della mano sinistra svolgono principalmente un ruolo di supporto. Fare attenzione a non spremere il bulbo oculare, che può deformarlo o romperlo.

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