Name: monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00
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中山眼科センターの研究室と眼科動物研究所のすべてのメンバーの技術支援に感謝します。また、実験的支援をしてくださった劉春橋教授にも感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC:81670872;中国北京)、中国広東省自然科学財団(助成金番号2019A1515011347)、および中山眼科センターの眼科国家重点研究所からの高レベル病院建設プロジェクト(助成金番号303020103;広州、広東省、中国)。

マウスの使用を含むすべての手順は、中国中山大学中山眼科センターの動物実験倫理委員会(許可番号:2020-082)によって承認され、中山眼科センターの動物管理および使用委員会の承認されたガイドラインおよび眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科研究協会(ARVO)の声明に従って承認されました。
1. マウスOIRモデルの誘導
<ol><li>C57BL/6Jマウスなど、眼?...

マウスのOIRに対する感受性は、多くの要因の影響を受けます。異なる遺伝的背景と系統の子犬を比較することはできません。BALB/cアルビノマウスでは、血管は血管新生房を大幅に減少させながらVO領域に急速に再成長し38、研究にいくつかの困難をもたらします。C57BL/6マウスでは、BALB/cJマウス系統39,40と比較して視体損傷が増加す...

網膜新生血管(RNV)は、既存の網膜静脈から新しい病理学的血管が始まり、通常、網膜の内面に沿って伸び、硝子体(または場合によっては網膜下腔)に成長する状態として定義されます1。これは、未熟児網膜症(ROP)、網膜静脈閉塞症(RVO)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)2など、多くの虚血性網膜症の特徴であり、共通の特徴です。
多くの臨床的および実験的観察は、虚血が網膜新生血管形成の主な原因であることを示しています3,4。ROPでは、新生児は密閉型インキュベーター内で高レベルの酸素にさらされて生存率を高め、これも血管の成長を停止させる重要な推進力です。治療が行われた後、新生児の網膜は比較的低酸素期間5を経験します。RVOの網膜中心静脈または分枝静脈の閉塞に他の状況が見られ、PDR2の細小血管症によって引き起こされる網膜毛細血管の損傷も観察されます。低酸素症はさらに、低酸素誘導因子-1α(HIF-1α)シグナル伝達経路を介して血管内皮増殖因子(VEGF)などの血管新生因子の発現を増加させ、血管内皮細胞を低酸素領域に成長させ、新しい血管を形成するように導きます6,7。
ROPは、早産児の血管増殖性網膜症の一種であり、小児失明の主な原因8,9であり、網膜低酸素症、網膜新生血管、線維性過形成を特徴とする10,11,12。1950年代に、研究者は高濃度の酸素が未熟児の呼吸器症状を大幅に改善できることを発見しました13,14。その結果、酸素療法は当時の未熟児にますます使用されていました15。しかし、早産児における酸素療法の普及と同時に、ROPの発生率は年々増加した。それ以来、研究者は酸素をROPに関連付け、ROPとRNV16の病因を理解するためにさまざまな動物モデルを探索してきました。
ヒトでは、ほとんどの網膜血管系の発達は出生前に完了しますが、げっ歯類では網膜血管系は出生後に発達し、網膜血管系の血管新生を研究するためのアクセス可能なモデルシステムを提供します2。研究の継続的な進歩に伴い、酸素誘発網膜症(OIR)モデルは、虚血に起因する病理学的血管新生を模倣するための主要なモデルになりました。OIRモデルの研究には特定の動物種はなく、子猫17、ラット18、マウス19、ビーグル子犬20、ゼブラフィッシュ21など、さまざまな動物種でモデルが開発されています。すべてのモデルは、初期の網膜発達中に高酸素症にさらされ、その後正常酸素環境に戻るという同じメカニズムを共有しています。Smithらは、マウスの子犬をP7からの高酸素症に5日間さらすと、網膜中心に極端な形態の血管退行が誘発され、P12の室内空気に戻すと、徐々に血管新生房が引き起こされ、硝子体に向かって成長することを観察しました19。これは、スミスモデルとも呼ばれる標準化されたOIRマウスモデルでした。Connorらはプロトコルをさらに最適化し、2009年にVO(血管閉塞)とNV(血管新生)の面積を定量化するための普遍的に適用可能な方法を提供し、モデル22の受け入れと利用を増やしました。OIRマウスモデルは、サイズが小さく、繁殖が速く、遺伝的背景が明確で、再現性が高く、成功率が高いため、現在でも最も広く使用されているモデルです。
マウスでは、網膜血管新生は出生後に視神経頭から内網膜に向かって大口鋸歯状突起に向かって血管が内向きに成長することから始まります。正常な網膜の発達中、最初の網膜血管は出生前後に視神経乳頭から発芽し、生後7日目頃に末梢に到達する拡大ネットワーク(一次神経叢)を形成します(P7)23。その後、血管は網膜に成長し始めて深層を形成し、網膜を貫通し、ヒト24のように内顆粒層(INL)の周りに層流ネットワークを確立します。生後3週目(P21)の終わりまでに、より深い神経叢の発達はほぼ完了します。OIRマウスモデルでは、高酸素曝露中に中央領域の多数の未熟な血管網が急速に変性するため、血管閉塞は常に中央網膜に現れます。したがって、病理学的新生血管の成長は、非灌流領域と血管領域の境界である中末梢網膜でも発生します。しかし、人間の網膜血管は出生前にほとんど形成されています。未熟児に関しては、末梢網膜は高酸素症にさらされたときに完全に血管新生していません25,26。そのため血管閉塞や血管新生は主に末梢網膜27,28に現れる。これらの違いにもかかわらず、マウスOIRモデルは、虚血誘発性新生血管の間に起こる病理学的事象を厳密に再現する。
OIRモデルの誘導は、2つの相29に分けることができる:第1相(高酸素相)では、VEGFの低下および内皮細胞のアポトーシスの結果として、網膜血管の発達が血管の閉塞および退行によって停止または遅延される24,30;フェーズ2(低酸素フェーズ)では、神経発達と恒常性に不可欠な室内空気条件29の下で網膜酸素供給が不十分になります19,31。この虚血状態は通常、調節されていない異常な新生血管を引き起こします。
現在、一般的に使用されているモデリング方法は、高酸素/低酸素曝露を交互に行うことです:母親とその子犬は、P7で5日間75%酸素にさらされ、その後、P17が同等の結果を示すまで室内空気中で5日間曝露されます22、これはOIRマウスモデル誘導のエンドポイントです。(図1)。ROPのシミュレーションに加えて、この虚血媒介性病理学的新生血管は、他の虚血性網膜疾患の研究にも使用できます。このモデルの主な測定値には、免疫蛍光染色またはFITCデキストラン灌流によって網膜フラットマウントから分析されるVOおよびNVの面積の定量化が含まれます。各マウスは致命的な操作のために一度だけ研究することができます。現在、血管退縮および病理学的血管新生の過程で網膜血管系の動的変化を継続的に観察する方法はほとんどありません32。この論文では、OIRモデル誘導の詳細なプロトコル、網膜フラットマウントの分析、およびマウスでのフルオレセイン眼底血管造影(FFA)のワークフローを提供し、OIRマウスモデルの2つのフェーズ中の血管動態変化をより包括的に理解するのに役立ちます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0550</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>&#160;FG701-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CC 2019</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td>For labeling nucleus on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td>For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>&#160;0100-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropyl Methylcellulose</td>
			<td>Maya</td>
			<td>89161</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4 594 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57/BL6J</td>
			<td>GemPharmatech of Jiangsu Province</td>
			<td></td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;501978-6</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For monitoring the level of O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyCycler</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>A84XOV</td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>For tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRALIS HRA+OCT</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>HC00500002</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Statistics 22.0</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tansference decloring shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>ZD-2008</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (Low attachment)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3261-20EA</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;SLBW6818</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition and export</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model

酸素誘発網膜症(OIR)は、未熟児網膜症(ROP)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、網膜静脈閉塞症(RVO)などの虚血性網膜疾患における異常な血管成長の研究に広く使用されています。ほとんどのOIR研究は、特定の時点で網膜新生血管を観察します。しかし、生きたマウスの時間経過に沿った動的な血管成長は、OIR関連血管疾患の理解に不可欠であり、研究が進められてきました。ここでは、OIRマウスモデルの誘導のための段階的なプロトコルについて説明し、潜在的な落とし穴を強調し、免疫蛍光染色を使用して血管閉塞(VO)および新生血管(NV)の領域を迅速に定量するための改善された方法を提供します。さらに重要なことに、OIRマウスモデルでフルオレセイン眼底造影(FFA)を行うことにより、生きたマウスのP15からP25までの血管再成長を監視しました。OIRマウスモデルにFFAを適用することで、血管再成長中のリモデリング過程を観察することができます。

OIRマウスモデルにおいて、最も重要かつ基本的な結果は、VOおよびNV領域の定量化である。P7から5日間高酸素環境で生活した後、仔の中心網膜は最大の非灌流領域を示した。さらに5日間の低酸素の刺激下で、網膜新生血管が徐々に生成され、周囲の正常血管よりも強く蛍光を発しました。P17以降、病的新生血管の蛍光シグナルは網膜のリモデリングとして急速に退縮した(図5A</...

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Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

このプロトコルは、マウス網膜フラットマウントの調製および免疫蛍光染色および分析のための詳細な方法を記載する。マウスの仔に対するフルオレセイン眼底造影(FFA)の使用および画像処理についても詳細に説明されている。

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

このプロトコルは、研究者がマウスの網膜を簡単に分離し、OIRマウスモデルの網膜血管系の動的変化を観察するのに役立ちます。この方法の主な利点は、分離された網膜の完全性を維持し、各マウスがそれ自身のコントロールとして機能することを可能にし、その結果、結果をより比較可能にすることである。この方法を初めて試す研究者は、子犬を正しい位置に配置するのが少し難しいため、5つの向きのイメージングを行う際に苦労する可能性があります。網膜全体の取り付けのために組織を収集するには、湾曲したはさみを使用して、安楽死させたC57-Black / 6子犬の眼窩組織から眼球を外します。次に、湾曲した鉗子を眼球の後部に挿入し、視神経を固定し、眼窩から目を素早く持ち上げます。眼球を予冷したPBSに入れて、表面から髪の毛や血液を取り除きます。すべての眼球を採取したら、洗浄した眼球を4%パラホルムアルデヒドを含む2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、室温で15分間、毎分12〜15回転インキュベートします。インキュベーションの最後に、解剖顕微鏡下で培養皿の中心にPBSを1滴加え、片方の眼球を滴に入れます。一対の鉗子で眼球を持ち、1ミリリットルの注射針を使用して角膜辺縁部の角膜を慎重に穿刺します。はさみの先端を穿刺に挿入し、網膜を切らないように注意しながら角膜辺縁に沿って角膜を切ります。鉗子を使用して虹彩と水晶体を取り除き、残りのアイカップを4%パラホルムアルデヒドに入れて、シェーカーで室温で45分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、固定アイカップを新しい培養皿の中央にあるPBSの新鮮な滴に入れます。1対の鉗子でアイカップを保持し、2対目の鉗子を使用して網膜層と強膜層を穏やかに分離します。網膜層と強膜層の間にハサミの先端を置き、強膜を視神経に向かって切断します。網膜から強膜をはがして網膜カップを取得します。鉗子を使用して、橈骨硝子体血管と末梢網膜との間の接続を解放します。先端を切り落とした2ミリリットルのピペットを使用して、網膜カップを48ウェルプレートの1ウェルに移し、シェーカーの室温PBSで5分間3回洗浄します。最後の洗浄後、カップを1%Triton X-100と5%通常のロバ血清でPBSで摂氏4度で一晩インキュベートします。網膜血管系をイソレクチンB4で標識するには、48ウェルプレートの1ウェルで、イソレクチンB4-594を添加した400マイクロリットルの0.1%正常ロバ血清の1ウェルで、シェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。必要に応じて、別の一次抗体を同時に添加することができます。翌日、シェーカーで0.1%PBSTで20分間3回洗浄して網膜を洗浄します。最後の洗浄後、網膜を適切な高親和性二次抗体で室温で1時間インキュベートしてから、DAPIでサンプルを20〜25分間標識します。インキュベーションの終わりに、振とうしながら室温で0.1%PBSTで3回の30分間洗浄で網膜を洗浄する。最後の洗浄後、網膜カップを開口部を上に向けてきれいなスライドに移し、顕微鏡を使用して、視神経乳頭から最大1〜1.5ミリメートルの周辺から中心に向かって3、6、9、および12時の位置で網膜を放射状に切断します。レチナを洗浄ごとに数滴のPBSで3回すすぎ、エアレイドペーパーを使用して網膜を乾燥させて平らにします。液滴の直径がカバーガラスの半分を覆うまで、カバーガラスの中央に封入剤を一滴加えます。次に、カバーガラス取り付け媒体側を下にして、広げた網膜にすばやく置きます。すべての網膜フラットマウントが準備されたら、サンプルを共焦点蛍光顕微鏡でイメージングできます。in vivoイメージングの場合は、散瞳点眼薬を20マイクロリットル加えて、瞳孔拡張を長期間持続させます。5分後、イメージングデバイスの前の小さな加熱パッドの安定した位置に子犬を置きます。角膜の水分を維持するために、イメージング手順全体を通して定期的に人工涙液を追加します。次に、デバイスの赤外線眼底イメージングをクリックして、視神経乳頭を画面の中央に調整します。150マイクロリットルの0.5%フルオレセインナトリウム塩溶液を腹腔内注射し、すぐにイメージングデバイスのタッチパネルにあるFAボタンと注入ボタンをクリックしてタイマーを開始します。3分後、網膜の血液循環が静脈相に入ったら、中心網膜の最初の画像を取得します。視神経乳頭が画像取得領域の片側の中点に位置するまで、撮像装置のレンズを眼の鼻側に水平に動かし、第2の画像を撮影する。レンズを動かし続け、側頭網膜、上網膜、下網膜の画像を同じように取得します。適切な画像処理プログラムで網膜画像を処理するには、[ファイル] メニューを開き、[新規作成] をクリックして、背景が黒の新しいキャンバスを作成します。網膜中心の画像を開きます。次に、[ファイル]をクリックして2番目の画像を追加します。2番目の画像の不透明度を60%に調整し、2つの画像が重なるまで画像を移動およびサイズ変更します。自由変形モードとワープモードの切り替えをクリックし、必要に応じて船舶を微調整します。次に、2番目の画像の不透明度を100%両方の画像を選択し、[レイヤーの自動ブレンド]をクリックします。ブレンド方法としてパノラマをチェックし、[シームレスなトーンと色]および[コンテンツ対応の塗りつぶし透明領域]のチェックボックスもオンにします。「OK」をクリックして、最初の 2 つの画像のスティッチングを完了します。次に、3 番目の画像を追加し、1 つの網膜からの 5 つの画像すべてがステッチされるまで、この画像を最初の 2 つの画像にステッチします。分析からのすべての画像が処理されたら、切り抜きツールを使用してFFA画像を均一なサイズにトリミングし、さまざまな発生時点での網膜血管系動態の変化の観察を容易にします。高酸素症への5日間の曝露後、生後12日目の子犬の中心網膜は大きな非灌流領域を示します。5日間の低酸素状態に移行すると、網膜は徐々に新生血管になり、周囲の正常血管で観察されたものよりも強い蛍光シグナルの増加を示します。生後17日目以降、病的新生血管は急速に退行し、網膜は生後25日目までに完全に正常な外観を示します。酸素誘発性網膜症モデルの良好な再現性と安定性は、子犬の同腹児サイズと出生後の体重増加を制御することによって達成できます。観察されたように、血管閉塞は通常、生後12日目にピークに達し、出生後25日目に消失しますが、新生血管形成は出生後17日目にピークに達し、出生後25日目までに退行します。生後15〜25日目の酸素誘発網膜症マウスでは、網膜血管径が正常マウスの網膜で観察されたものと比較して増加し、非常に拷問的になります。左手の鉗子は主に補助的な役割を果たします。眼球を変形させたり破裂させたりする可能性のある眼球を絞らないように注意してください。

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