Name: monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model at JoVE.com

Laboratuvarımızdan ve Zhongshan Oftalmik Merkezi Oftalmik Hayvan Laboratuvarından tüm üyelere teknik yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca deneysel destek için Prof. Chunqiao Liu'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NSFC: 81670872; Pekin, Çin), Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (Hibe No.2019A1515011347) ve Zhongshan Oftalmik Merkezi'ndeki Devlet Anahtar Oftalmoloji Laboratuvarı'ndan Yüksek Düzey hastane inşaatı projesi (Hibe No. 303020103; Guangzhou, Guangdong Eyaleti, Çin).

Farelerin kullanımını içeren tüm prosedürler, Zhongshan Oftalmik Merkezi, Sun Yat-sen Üniversitesi, Çin'in hayvan deney etik komitesi (yetkili numara: 2020-082) tarafından ve Zhongshan Oftalmik Merkezi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onaylanmış kılavuzlarına ve Görme ve Oftalmolojide Araştırma Derneği (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı'na uygun olarak onaylanmıştır.
1. Fare OIR modelinin indüksiyonu
<ol><li>Gözleri...

Farelerin OIR'ye duyarlılığı birçok faktörden etkilenir. Farklı genetik geçmişe ve suşlara sahip yavrular karşılaştırılamaz. BALB / c albino farelerde, damarlar VO bölgesine hızla yeniden büyür ve önemli ölçüde azalmış neovasküler tutamlar38 ile araştırmaya bazı zorluklar getirir. C57BL/6 farelerde, BALB/cJ fare suşu39,40 ile karşılaştırıldığında fotoreseptör hasarı artmıştır. Aynı şey farklı t...

Yeni patolojik damarların mevcut retinal damarlardan kaynaklandığı bir durum olarak tanımlanan retinal neovaskülarizasyon (RNV), genellikle retinanın iç yüzeyi boyunca uzanır ve vitreusa (veya bazı koşullar altında subretinal boşluğa) doğru büyür1. Prematüre retinopatisi (ROP), retinal ven tıkanıklığı (RVO) ve proliferatif diyabetik retinopati (PDR)2 dahil olmak üzere birçok iskemik retinopatinin ayırt edici özelliği ve ortak özelliğidir.
Çok sayıda klinik ve deneysel gözlem iskeminin retinal neovaskülarizasyonun ana nedeni olduğunu göstermiştir 3,4. ROP'ta, yenidoğanlar hayatta kalma oranlarını arttırmak için kapalı inkübatörlerde yüksek seviyeli oksijene maruz kalırlar ve bu da vasküler büyümenin durması için önemli bir itici güçtür. Tedavi yapıldıktan sonra, yenidoğanların retinaları nispeten hipoksik bir dönemyaşar 5. RVO'da santral veya dal retinal venlerin tıkanmasında başka durumlar da görülmekte ve PDR2'de mikroanjiyopatinin neden olduğu retinal kılcal damarların hasarı da gözlenmektedir. Hipoksi, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) gibi anjiyojenik faktörlerin, hipoksiye bağlı faktör-1α (HIF-1α) sinyal yolu aracılığıyla ekspresyonunu arttırır ve bu da vasküler endotel hücrelerini hipoksik alana büyümeye ve yeni damarlar oluşturmaya yönlendirir 6,7.
ROP, preterm bebeklerde bir tür vasküler proliferatif retinopatidir ve retina hipoksisi, retinal neovaskülarizasyon ve fibröz hiperplazi10,11,12 ile karakterize çocukluk çağı körlüğünün önde gelen bir nedeni 8,9'dur. 1950'lerde araştırmacılar, yüksek oksijen konsantrasyonunun prematüre bebeklerin solunum semptomlarını önemli ölçüde iyileştirebileceğini bulmuşlardır13,14. Sonuç olarak, oksijen tedavisi o zamanlar prematüre bebeklerde giderek daha fazla kullanılmaya başlandı15. Bununla birlikte, preterm bebeklerde oksijen tedavisinin yaygın kullanımı ile eş zamanlı olarak, ROP insidansı yıldan yıla artmıştır. O zamandan beri, araştırmacılar oksijeni ROP'a bağladılar ve ROP ve RNV16'nın patogenezini anlamak için çeşitli hayvan modellerini araştırdılar.
İnsanlarda, retinal vaskülatür gelişiminin çoğu doğumdan önce tamamlanırken, kemirgenlerde retinal vaskülatür doğumdan sonra gelişir ve retinal vaskülatürdeki anjiyogenezi incelemek için erişilebilir bir model sistemi sağlar2. Araştırmanın sürekli ilerlemesiyle birlikte, oksijene bağlı retinopati (OIR) modelleri, iskemiye bağlı patolojik anjiyogenezi taklit etmek için önemli modeller haline gelmiştir. OIR modelinin çalışmasında belirli bir hayvan türü yoktur ve model, yavru kedi17, sıçan18, fare19, beagle köpek yavrusu 20 ve zebra balığı21 dahil olmak üzere çeşitli hayvan türlerinde geliştirilmiştir. Tüm modeller, erken retinal gelişim sırasında hiperoksiye maruz kaldıkları ve daha sonra normoksik ortama geri döndükleri aynı mekanizmayı paylaşırlar. Smith ve ark., fare yavrularını 5 gün boyunca P7'den hiperoksiye maruz bırakmanın, merkezi retinada aşırı bir damar regresyonu formuna neden olduğunu ve onları P12'deki oda havasına geri getirmenin, yavaş yavaş vitreus gövdesine doğru büyüyen neovasküler tutamları tetiklediğini gözlemlemiştir19. Bu, Smith modeli olarak da adlandırılan standartlaştırılmış bir OIR fare modeliydi. Connor ve ark. protokolü daha da optimize etti ve 2009 yılında VO (vazo-obliterasyon) ve NV (neovaskülarizasyon) alanını ölçmek için evrensel olarak uygulanabilir bir yöntem sağladı ve bu da model22'nin kabulünü ve kullanımını artırdı. OIR fare modeli, küçük boyutu, hızlı üremesi, net genetik arka planı, iyi tekrarlanabilirliği ve yüksek başarı oranı nedeniyle şu anda hala en yaygın kullanılan modeldir.
Farelerde, retinal vaskülarizasyon doğumdan sonra damarların optik sinir kafasından iç retinaya ora serrata'ya doğru büyümesiyle başlar. Normal retinal gelişim sırasında, ilk retinal damarlar doğum sırasında optik sinir başından filizlenir ve doğum sonrası 7 (P7) 23 civarında çevreye ulaşan genişleyen bir ağ (primer pleksus) oluşturur. Daha sonra damarlar derin bir tabaka oluşturmak, retinaya nüfuz etmek ve insan24'te olduğu gibi iç nükleer tabakanın (INL) etrafında laminer bir ağ oluşturmak için retinaya doğru büyümeye başlar. Üçüncü doğum sonrası haftanın (P21) sonunda, daha derin pleksus gelişimi neredeyse tamamlanır. OIR fare modeli için, hiperoksiye maruz kalma sırasında merkezi bölgedeki çok sayıda olgunlaşmamış vasküler ağın hızlı dejenerasyonu nedeniyle vasküler tıkanıklık her zaman merkezi retinada görülür. Bu nedenle, patolojik neovaskülarizasyonun büyümesi, perfüzyon dışı alanın ve vasküler alanın sınırı olan orta periferik retinada da meydana gelir. Bununla birlikte, insan retina damarları neredeyse doğumdan önce oluşmuştur. Prematüre bebeklere gelince, periferik retina hiperoksiye maruz kaldığında tamamen vaskülarize değildir25,26. Bu nedenle vasküler oklüzyon ve neovaskülarizasyon esas olarak periferik retinada görülür27,28. Bu farklılıklara rağmen, fare OIR modeli, iskemiye bağlı neovaskülarizasyon sırasında ortaya çıkan patolojik olayları yakından özetlemektedir.
OIR modelinin indüksiyonu iki faza ayrılabilir29: faz 1'de (hiperoksi faz), retinal vasküler gelişim, VEGF'deki düşüş ve endotel hücrelerinin apoptozu 24,30'un bir sonucu olarak kan damarlarının tıkanması ve gerilemesi ile durdurulur veya geciktirilir; faz 2'de (hipoksi faz), retinal oksijen kaynağı, nöral gelişim ve homeostaz19,31 için gerekli olan oda hava koşulları29 altında yetersiz kalacaktır. Bu iskemik durum genellikle düzenlenmemiş, anormal neovaskülarizasyon ile sonuçlanır.
Şu anda, yaygın olarak kullanılan modelleme yöntemi alternatif olarak yüksek / düşük oksijene maruz kalmaktadır: Anneler ve yavruları P7'de 5 gün boyunca% 75 oksijene maruz kalmaktadır, ardından P17, OIR fare modeli indüksiyonunun son noktası olankarşılaştırılabilir sonuçlar 22'yi gösterene kadar oda havasında 5 gün beklemektedir. (Şekil 1). ROP'u simüle etmenin yanı sıra, bu iskemi aracılı patolojik neovaskülarizasyon, diğer iskemik retina hastalıklarını incelemek için de kullanılabilir. Bu modelin ana ölçümleri, immünofloresan boyama veya FITC-dekstran perfüzyonu ile retinal düz montajlardan analiz edilen VO ve NV alanının ölçülmesini içerir. Her fare, ölümcül operasyon nedeniyle sadece bir kez incelenebilir. Günümüzde, vasküler regresyon ve patolojik anjiyogenez sürecinde retinal vaskülatürün dinamik değişikliklerini sürekli olarak gözlemlemek için birkaç yöntem vardır32. Bu yazıda, OIR model indüksiyonunun ayrıntılı bir protokolünü, retinal düz montajların analizini ve fareler üzerinde floresein fundus anjiyografi (FFA) iş akışını sunuyoruz ve bu da OIR fare modelinin iki aşamasında vasküler dinamik değişikliklerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0550</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>&#160;FG701-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CC 2019</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td>For labeling nucleus on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td>For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>&#160;0100-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropyl Methylcellulose</td>
			<td>Maya</td>
			<td>89161</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4 594 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57/BL6J</td>
			<td>GemPharmatech of Jiangsu Province</td>
			<td></td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;501978-6</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For monitoring the level of O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyCycler</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>A84XOV</td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>For tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRALIS HRA+OCT</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>HC00500002</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Statistics 22.0</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tansference decloring shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>ZD-2008</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (Low attachment)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3261-20EA</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;SLBW6818</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition and export</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model

Oksijene bağlı retinopati (OIR), prematüre retinopatisi (ROP), proliferatif diyabetik retinopati (PDR) ve retinal ven tıkanıklığı (RVO) dahil olmak üzere iskemik retina hastalıklarında anormal damar büyümesini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Çoğu OIR çalışması retinal neovaskülarizasyonu belirli zaman noktalarında gözlemler; Bununla birlikte, OIR ile ilişkili damar hastalıklarını anlamak için gerekli olan bir zaman seyri boyunca canlı farelerde dinamik damar büyümesi yeterince çalışılmamıştır. Burada, OIR fare modelinin indüksiyonu için adım adım bir protokol açıklıyoruz, potansiyel tuzakları vurguluyoruz ve immünofloresan boyama kullanarak vazo-obliterasyon (VO) ve neovaskülarizasyon (NV) alanlarını hızlı bir şekilde ölçmek için geliştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Daha da önemlisi, OIR fare modelinde floresein fundus anjiyografi (FFA) yaparak P15'ten P25'e canlı farelerde damar büyümesini izledik. FFA'nın OIR fare modeline uygulanması, damar yeniden büyümesi sırasında yeniden şekillendirme sürecini gözlemlememizi sağlar.

OIR fare modelinde, en önemli ve temel sonuç, VO ve NV alanının nicelleştirilmesidir. P7'den 5 gün boyunca hiperoksi ortamında yaşadıktan sonra, yavruların merkezi retinası en büyük perfüzyon dışı alanı gösterdi. 5 gün içinde hipoksinin uyarılması altında, retinal neovaskülarizasyon yavaş yavaş üretildi ve bu da normal damarları çevreleyen normal damarlardan daha yoğun bir şekilde floresan oldu. P17'den sonra, patolojik neovaskülarizasyonun floresan sinyali, retinanın yeniden şekillenme...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model at JoVE.com

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Bu protokol, farelerin retinal düz montajlarının hazırlanması ve immünofloresan boyanması ve analizi için ayrıntılı bir yöntemi açıklamaktadır. Floresein fundus anjiyografinin (FFA) fare yavruları ve görüntü işleme için kullanımı da ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Oksijene Bağlı Retinopati Fare Modelinde Retina Damarlarının Dinamik Büyümesinin İzlenmesi

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Bu protokol, araştırmacıların farelerin retinalarını kolayca ayırmalarına ve OIR fare modelinin retina vaskülatüründeki dinamik değişiklikleri gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajları, ayrılmış retinaların bütünlüğünün korunması ve her farenin kendi kontrolü olarak hizmet etmesine izin vermektir, bu da sonuçları daha karşılaştırılabilir hale getirir. Bu yöntemi ilk kez deneyen araştırmacılar, beş oryantasyon görüntülemesini yaparken zorlanabilirler, çünkü yavruları doğru pozisyona yerleştirmek biraz zordur.Retinal tam montaj için dokuyu toplamak üzere, göz kürelerini ötenazi C57-Black / 6 yavrusunun yörünge dokusundan ayırmak için kavisli makas kullanın. Ardından, kavisli forsepsleri göz küresinin arka kısmına yerleştirin, optik siniri sıkıştırın ve gözü yörüngeden hızla kaldırın. Yüzeydeki kılları ve kanı çıkarmak için göz kürelerini önceden soğutulmuş PBS'ye yerleştirin.Tüm göz küreleri toplandığında, temizlenen göz kürelerini% 4 paraformaldehit içeren iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika ve dakikada 12 ila 15 devir boyunca inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, diseksiyon mikroskobu altında bir kültür kabının ortasına bir damla PBS ekleyin ve damlaya bir göz küresi yerleştirin. Göz küresini bir çift forseps ile tutarak, kornea limbusunda korneayı dikkatlice delmek için bir mililitrelik bir şırınga iğnesi kullanın.Bir çift makasın ucunu delinmeye yerleştirin ve retinayı kesmemeye dikkat ederek korneayı kornea limbus boyunca kesin. İris ve lensi çıkarmak için forseps kullanın ve kalan vizör adaptörünü, çalkalayıcı üzerindeki oda sıcaklığında 45 dakikalık bir inkübasyon için% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, sabit vizör adaptörünü yeni bir kültür kabının ortasındaki taze bir PBS damlasına yerleştirin.Vizör adaptörünü bir çift forseps ile tutarak, retina ve sklera tabakalarını nazikçe ayırmak için ikinci bir çift forseps kullanın. Makasın ucunu retina ve sklera tabakaları arasına yerleştirin ve sklerayı optik sinire doğru kesin. Retina kabını elde etmek için sklerayı retinadan soyun.Forseps kullanarak, radyal hyaloid damarlar ve periferik retina arasındaki bağlantıyı serbest bırakın. Retinal kabı, çalkalayıcı üzerindeki oda sıcaklığında PBS'de beş dakikalık üç yıkama için 48 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarmak için ucu kesilmiş iki mililitrelik bir pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, bardağı% 1 Triton X-100 ve% 5 normal eşek serumunda PBS'de gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Retinal vaskülatürü izolektin B4 ile etiketlemek için, retinayı 48 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda, 400 mikrolitrede% 0.1 normal eşek serumunda, bir çalkalayıcı üzerinde 4 santigrat derecede gece boyunca izolektin B4-594 ile desteklenmiş normal eşek serumunda inkübe edin. Gerekirse, aynı anda başka bir birincil antikor eklenebilir. Ertesi gün, retinayı çalkalayıcıda% 0.1 PBST'de üç adet 20 dakikalık yıkama ile yıkayın.Son yıkamadan sonra, numuneyi 20 ila 25 dakika boyunca DAPI ile etiketlemeden önce retinayı oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir yüksek afiniteli ikincil antikor ile inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, retinayı oda sıcaklığında% 0.1 PBST'de% 30 dakikalık üç yıkamayla çalkalayarak yıkayın. Son yıkamadan sonra, retina kabını açıklığı yukarı bakacak şekilde temiz bir slayta aktarın ve retinayı optik sinir kafasından bir ila 1,5 milimetreye kadar çevreden merkeze doğru saat üç, altı, dokuz ve 12 pozisyonlarında radyal olarak kesmek için mikroskopu kullanın.Retinayı kurutmak ve düzleştirmek için hava yoluyla serilmiş kağıt kullanmadan önce retinayı yıkama başına birkaç damla PBS ile üç kez durulayın. Damlacığın çapı kapak kaymasının yarısını kaplayana kadar kapak kaymasının ortasına bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, kapak kayması montajını orta taraftan aşağıya doğru hızla yayılmış retinanın üzerine yerleştirin.Tüm retinal düz montajlar hazırlandıktan sonra, örnekler konfokal floresan mikroskopi ile görüntülenebilir. İn vivo görüntüleme için, uzun süreli göz bebeği genişlemesi elde etmek için 20 mikrolitre midriatik göz damlası ekleyin. Beş dakika sonra, yavruları görüntüleme cihazının önündeki küçük bir ısıtma yastığı üzerinde sabit bir konuma getirin.Kornealardaki nemi korumak için, görüntüleme prosedürü boyunca düzenli olarak yapay gözyaşları ekleyin. Ardından, optik sinir kafasını ekranın ortasına ayarlamak için cihazdaki Kızılötesi Fundus Görüntüleme'ye tıklayın. İntraperitoneal olarak 150 mikrolitre% 0.5 floresein sodyum tuzu çözeltisi enjekte edin ve zamanlayıcıyı başlatmak için görüntüleme cihazının dokunmatik panelindeki FA ve Enjeksiyon düğmelerini hemen tıklayın.Üç dakika sonra, retinanın kan dolaşımı venöz faza girdiğinde, merkezi retinanın ilk görüntüsünü elde edin. Optik sinir kafası görüntü alma alanının bir tarafının orta noktasına yerleştirilene kadar görüntüleme cihazının lensini yatay olarak gözün burun tarafına doğru hareket ettirin ve ikinci görüntüyü alın. Lensi hareket ettirmeye devam edin ve aynı şekilde zamansal, üst ve alt retinanın görüntülerini alın.Retinal görüntüleri uygun bir görüntüleme işleme programında işlemek için, Dosya menüsünü açın ve siyah arka plana sahip yeni bir tuval oluşturmak için Yeni'yi tıklatın. Merkezi retinanın görüntüsünü açın. Ardından, ikinci bir görüntü eklemek için Dosya'yı tıklayın.İkinci görüntünün opaklığını %60 olarak ayarlayın ve iki görüntü üst üste binene kadar görüntüyü taşıyın ve yeniden boyutlandırın. Serbest Dönüştürme ve Çarpıtma Modları Arasında Geçiş Yap'a tıklayın ve gerekirse gemilerde ince ayarlamalar yapın. Ardından ikinci görüntünün opaklığını tekrar %100'e ayarlayınHer iki görüntüyü de seçin ve Katmanları Otomatik Karıştır'ı tıklatın.Karışım yöntemi olarak Panorama'yı işaretleyin ve ayrıca Kesintisiz Tonlar ve Renkler ve İçeriğe Duyarlı Dolgu Şeffaf Alanlar için kutuları işaretleyin. İlk iki görüntünün dikişini tamamlamak için Tamam'ı tıklatın. Ardından, üçüncü görüntüyü ekleyin ve tek bir retinadan gelen görüntülerin beşi de dikilinceye kadar gösterildiği gibi bu görüntüyü ilk iki görüntüye dikin.Analizden elde edilen tüm görüntüler işlendiğinde, farklı gelişimsel zaman noktalarında retinal vaskülatür dinamiklerindeki değişikliklerin gözlemlenmesini kolaylaştırmak için FFA görüntülerini eşit bir boyuta kırpmak için Kırpma Aracı'nı kullanın. Hiperoksiye beş gün maruz kaldıktan sonra, doğum sonrası gün 12 yavrularının merkezi retinaları büyük bir perfüzyon dışı alan gösterir. Beş günlük hipoksik koşullara transfer edildikten sonra, retinalar yavaş yavaş neovaskülarize olur ve çevredeki normal damarlarda gözlenenden daha güçlü floresan sinyalinde bir artış gösterir.Postnatal 17. günden sonra patolojik neovaskülarizasyon hızla geriler ve retina postnatal 25. güne kadar tamamen normal bir görünüm gösterir. Oksijen kaynaklı retinopati modelinin iyi bir tekrarlanabilirliği ve stabilitesi, yavruların çöp boyutunu ve doğum sonrası kilo alımını kontrol ederek elde edilebilir. Gözlemlendiği gibi, vazo-obliterasyon tipik olarak doğum sonrası 12. günde zirveye ulaşır ve doğum sonrası 25. günde kaybolurken, neovaskülarizasyon doğum sonrası 17. günde zirveye ulaşır ve doğum sonrası 25. günde geriler.Doğum sonrası 15 ila 25 oksijene bağlı retinopati faresinde, retinal kan damarı çapı artar ve normal farelerin retinaları için gözlenenlere kıyasla oldukça işkenceci hale gelir. Sol eldeki forsepsler esas olarak destekleyici bir rol oynar. Göz küresini sıkmamaya dikkat edin, bu da onu deforme edebilir veya yırtabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

Kronik Deneyleri Montaj Elektrotlar veya mikrodiyaliz Problar Işık tedavi Diş Yapıştırıcı Reçine Uygulama

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Fare Kan Gemilerinin Yüz Yüzey Hazırlığı

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...