Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل iNEXT-Discovery (منحة 871037) الممولة من برنامج أفق 2020 للمفوضية الأوروبية. يتم تمويل J B. R. White من قبل صندوق ويلكوم الاستئماني (215064/Z/18/Z). تم تمويل مجاهر FEI Titan Krios من قبل جامعة ليدز (جائزة UoL ABSL) و Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). نشكر M Iadanza على استخدام نص تحليله ميكروجراف. نحن نعترف بمصدر ضوء الماس للوصول إلى مرافق cryo-EM ودعمها في مركز التصوير الحيوي الإلكتروني الوطني في المملكة المتحدة (eBIC) الممول من صندوق ويلكوم الاستئماني وMRC وBBRSC.

ولا يبلغ عن أي تضارب في المصالح.

في هذا البروتوكول وصفنا خط أنابيب الأساسية المطبقة على العينات قابلة للروتين SPA. في حين أن هذه الطريقة ورقة تصفية النشاف من تشكيل فيلم رقيقة وتزجيج هو بلا شك ناجحة نظرا لاستخدامه في الغالبية العظمى من مشاريع SPA حتى الآن، فإنه يأتي مع عدد من العيوب. وتشمل هذه الهدر عينة، والجداول الزمنية بطيئة (ثانية) المطلوبة لتشكيل فيلم رقيقة وتجميد العينة، وذكرت عدم الحماية27 والآثار السلبية المبلغ عنها من استخدام ورقة تصفية لمسح بعيدا liquid50 الزائدة. وقد تم مؤخرا تطوير تكنولوجيات جديدة لتحسين إمكانية استنساخ إنتاج الأفلام الرقيقة51,52. وقد تم تطوير تكنولوجيات أخرى تقلل من الوقت بين تطبيق العينة والتزجيج53,54,55. في حين أن الأساليب الورقية المرشحة لتشكيل الأفلام الرقيقة لا تزال أكثر الطرق انتشارا لإعداد عينة CRYOEM SPA وقت كتابة هذا التقرير ، فإن هذه التقنيات الجديدة قد تجلب مجموعة من الفوائد من حيث الكفاءة وقابلية استنساخ تزجيج الشبكة ، بالإضافة إلى خلق فرص جديدة لجلب أبعاد تجريبية إضافية ، مثل حل الوقت والاختلاط السريع قبل التزجيج.
وعملية فحص الشبكة بالنسبة لمعظم المستعملين هي في الوقت الحاضر عملية نوعية تنطوي على اقتناء أطالس منخفضة التكبير يعقبها التقاط صور عالية التكبير عبر الشبكة لتقييم توزيع الجسيمات. في حين أن هذا هو نهج قوي بما فيه الكفاية لبعض أنواع العينة، يمكن أن يكون من الصعب تقييم بالعين إذا كانت العينة هي في الواقع ما يأمل الباحث في تصوير أو لديه اتجاه مفضل، على سبيل المثال مع عينات صغيرة (<200 kDa) أو حيث مورفولوجيا منخفضة الدقة يجعل من الصعب تحديد بالعين إذا كانت هناك مجموعة من توزيعات الجسيمات. وفيما يتعلق ببعض المشاريع، يستحيل تحديد ما إذا كانت العينة على النحو المطلوب، مثلا عندما يكون الرباط ملزما أو المكان الذي يجري فيه فحص العينة لتقييم ما إذا كانت وحدة فرعية صغيرة (مثل 10 كيلودا) لا تزال موجودة بالاقتران مع مجمع. بالنسبة لهذه المشاريع ، فإن خطوط الأنابيب المؤتمتة بالكامل لتحليل البيانات إلى جانب مجموعات "قصيرة" 0.5 - 1 ساعة ، يمكن أن تمضي قدما من خلال خطوات معالجة الصور إلى تصنيف 2D أو حتى التصنيف 3D والصقل من شأنه أن يساعد على تحديد ما إذا كان هناك ما يبرر جمع أطول. ولا تزال خطوط الأنابيب هذه قيد التطوير ولا تنفذ على نطاق واسع في الوقت الحاضر، ولكن لديها القدرة على تحسين كفاءة فحص شبكة التبريد، ولا سيما بالنسبة للعينات الصعبة.
وقد أدت التحسينات في أجهزة الكشف المباشر عن الإلكترونات، فضلا عن التعديلات في المجهر إلى جانب التقدم في معالجة الصور مثل جمع بيانات تحول الصور، إلى زيادة إنتاجية وجودة الصور التي يتم إنتاجها أثناء الحصول على البيانات. وهذه الزيادة في معدل البيانات التي يجري جمعها تسلط الضوء على الحاجة إلى إجراء فحص شامل لشبكات التبريد قبل الحصول على العديد من السل من البيانات.
أصبح CryoEM SPA تقنية بيولوجية هيكلية سائدة حقا ، وفي كثير من الحالات نهج "الذهاب إلى" لبعض فئات العينات ، مثل المجمعات الجزيئية الكلية غير المتجانسة والكبرية. في حين أن البروتوكول هنا يصف نظرة عامة أساسية على خط أنابيب SPA ، فإن كل قسم مغطى هنا (تزجيج الشبكة وفحصها ، cryoEM ومعالجة الصور) هو موضوع في حد ذاته ويستحق الاستكشاف أثناء تطوير مشروع SPA. ومع تقدم تقنيات إعداد العينات والفحص المجهري، وحداثة خوارزميات ونهج جديدة لمعالجة الصور، ستواصل وكالة الأنباء السعودية تطويرها كخطوط أنابيب، مما يساعد الباحثين في اكتساب نظرة ثاقبة على النظم البيولوجية المعقدة.

جسيم واحد كريويم للتحقيق في الحياة على المستوى الجزيئي يجب أن نفهم الهيكل. تتوفر العديد من التقنيات للتحقيق في بنية البروتين، مثل NMR، والتصوير البلوري بالأشعة السينية، وقياس الطيف الكتلي، والمجهر الإلكتروني (EM). حتى الآن، تم حل معظم الهياكل المودعة في بنك بيانات البروتين (PDB) باستخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية. ومع ذلك ، من ~ 2012 فصاعدا ، أصبح المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) تقنية سائدة لتحديد بنية البروتين وزاد استخدامه بشكل كبير. بلغ إجمالي عدد خرائط EM المودعة في بنك بيانات المجهر الإلكتروني (EMDB) (حتى ديسمبر 2020) 13,421 مقارنة ب 1,566 في عام 2012 (الشكل 1، www.ebi.co.uk). وفي عام 2012، كان عدد الإحداثيات الذرية على غرار خرائط كثافة التبريد، المودعة في مصرف التنمية للبلدان الأمريكية 67 فقط، ولكن حتى كانون الأول/ديسمبر 2020، تم إيداع 309 2 هياكل حتى الآن، بزيادة قدرها 35 ضعفا. وكان سبب هذا النمو الأساسي في نوعية وكمية خرائط كثافة التبريد المنتجة، والتي يشار إليها أحيانا باسم "ثورة القرار"1، هو تجمع التقدم في مجالات متعددة: تطوير كاميرات جديدة للتصوير تعرف باسم كاشفات الإلكترونات المباشرة؛ وسرعة استخدام الأجهزة في مجال التصوير؛ وسرعة استخدام الأجهزة ذات الأجهزة التي يمكن استخدامها في استخدام الأجهزة الكشفية المباشرة؛ وسرعة استخدام الأجهزة التي تستخدم في استخدام الأجهزة؛ وسرعة استخدام الأجهزة التي تستخدم في استخدام الأجهزة التي تستخدم في استخدام الإلكترونات؛ وسرعة استخدام الأجهزة التي تستخدم في استخدام الأجهزة الإلكترونية؛ وسرعة استخدام ال برنامج جديد؛ والمجاهر أكثر استقرارا2،3،4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> الشكل 1: الطلبات التراكمية إلى EMDB من عام 2012 إلى ديسمبر 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تحليل الجسيمات واحد (SPA) هو أداة قوية لتوليد البصيرة البيولوجية في مجموعة واسعة من أنواع العينات من خلال توضيح هياكل عالية الدقة من complexes5،6 معزولة بما في ذلك viruses7،8، membrane proteins9،10، التجميعات حلية11 وغيرها من المجمعات الجزيئية الكلية الديناميكية وغير المتجانسة12،13، أحجامها تختلف حسب أوامر الحجم (من 39 kDa 14,15 إلى عشرات من الميغادالتونات). هنا، يتم وصف بروتوكول لخط أنابيب قياسية للحصول على CRYOEM SPA من عينة إلى بنية.
قبل الشروع في خط الأنابيب هذا، ينبغي إخضاع عينة منقى للتحليل الكيميائي الحيوي لتقييم فرص نجاح المصب. يمكن القول إن إعداد عينة مناسبة هو أكبر عائق أمام SPA ، خاصة بالنسبة للمجمعات العابرة وغير المتجانسة (التركيبية والتكوينية). وينبغي أن يحتوي الإعداد المعقد الجزيئي الكلي على أقل عدد ممكن من الملوثات، بتركيز كاف ليسفر عن العديد من الجسيمات في كل ميكروجراف بالتبريد، وفي تركيبة عازلة مناسبة تماما لتحليل التبريد. بعض المكونات العازلة، بما في ذلك السكروز والجلسرين وعالية (~ > تركيزات 350 mM من الأملاح، اعتمادا على حجم العينة والخصائص وغيرها من المكونات العازلة) يمكن أن تتداخل مع عملية التزجيج أو تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الصور، مما يعوق تحديد الهيكل16.
عادة ، كحد أدنى ، يجب استخدام تحليل الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) و SDS- PAGE gel لتقييم نقاء العينة17،18 ، ولكن dichroism دائرية ، المقايسات الوظيفية ، SEC مقرونة بتشتت الضوء متعدد الزوايا ، ومقايسات الاستقرار الحراري كلها أدوات مفيدة للتحليل النوعي للاستعدادات المعقدة الجزيئية الكلية قبل تحليل cryoEM. ومع ذلك، فإن نتائج هذه التحليلات الكيميائية الحيوية قد تسفر عن القليل من البصيرة في التغاير الهيكلي للعينة وسلوكها على شبكة cryoEM. لهذا السبب، يتم استخدام وصمة عار سلبية EM بشكل روتيني كأداة سريعة ورخيصة وقوية لتقييم التغايرية التركيبية والتكوينية، وبالتالي طريقة جيدة للتأكد من أي جزء elution من تنقية واعدة للغاية، أو فحص التراكيب العازلة المختلفة19،20. بمجرد تحديد عينة واعدة ، يمكننا المضي قدما في خط أنابيب CRYOEM SPA. وصمة عار سلبية لا تتماشى دائما مع النتائج اللاحقة ينظر في cryoEM; في بعض الأحيان عينة تبدو فقيرة من قبل وصمة عار سلبية ولكن يتحسن عندما ينظر إليها في الجليد الزجاجي في cryoEM. في المقابل ، تبدو العينات في بعض الأحيان ممتازة أثناء خطوات البقع السلبية ولكنها تتطلب المزيد من التحسين عند التقدم إلى cryoEM. ومع ذلك، في معظم الحالات بقعة سلبية يوفر خطوة مفيدة لمراقبة الجودة.
التزجيج البيئة القاسية داخل نظام فراغ المجهر الإلكتروني يسبب كل من الجفاف والأضرار الإشعاعية للعينات البيولوجية غير المثبتة21. لذلك ، لتصوير العينة في حالة تشبه الأم ، يجب الحفاظ على العينة البيولوجية قبل التصوير. بالنسبة للاستعدادات المنقى للمجمعات الجزيئية الكلية ، فإن التزجيج هو الطريقة المفضلة لتمكين تصورها عن طريق cryoEM مع الحفاظ على التفاصيل الذرية للمجمع. كان اكتشاف التزجيج كطريقة لإعداد العينات تقدما أساسيا في المجهر الإلكتروني للعينات البيولوجية ، والذي تم الاعتراف به في جائزة نوبل للكيمياء لعام 2017. عينة التزجيج ينطوي على خلق طبقة رقيقة من الحل الذي يحتوي على عينة من الفائدة، وعادة ما تكون عشرات نانومتر سميكة، علقت على دعم شبكة cryoEM. ثم يتم تجميد الفيلم رقيقة بسرعة كبيرة في cryogen مثل الإيثان السائل في ~ -175 درجة مئوية. معدل التجمد هو ~ 106 درجة مئوية / ثانية ، بسرعة كافية أن أشكال الجليد غير متبلور ، أو الزجاجية ، وتعليق العينة في رقيقة ، film22 الصلبة.
المتغير الأولي للنظر هو دعم شبكة cryoEM المختار23. شبكة EM يتكون عادة من فيلم الكربون غير متبلور مع ثقوب (إما العادية أو غير النظامية)، على هيكل الدعم. هيكل الدعم هو عادة شبكة معدنية دائرية قطرها 3.05 ملم ، وعادة ما تكون مصنوعة من النحاس ، ولكن يمكن استخدام معادن أخرى مثل الذهب ، أو الموليبدينوم (الذي يفضل خصائص التوسع الحراري24). في بعض الأحيان ، يتم تطبيق دعم إضافي رقيق ومستمر عبر الشبكة ، مثل الجرافين أو أكسيد الجرافين أو طبقة كربون رقيقة (~ 1-2 نانومتر) غير متبلورة. في حين أن شبكات cryoEM القياسية (الأكثر شيوعا 400-200 شبكة النحاس مع ثقب (1.2 ميكرومتر ثقوب مستديرة مفصولة 1.3 ميكرومتر (r1.2/2 1.3) ، أو 2 ميكرومتر مفصولة 2 ميكرومتر من الكربون (r2/2)) دعم الكربون ، على الرغم من وجود العديد من الأنماط المختلفة المتاحة) وقد استخدمت في الغالبية العظمى من الهياكل المبلغ عنها حتى الآن ، وقد تم الإبلاغ عن تقنيات الشبكة الجديدة مع تحسين الموصلية وانخفاض حركة العينة25 . تتعرض شبكات مختارة لعلاج تنظيف توهج التفريغ / البلازما لجعلها هيدروفيلي وقابلة لعينة application26.
بعد توهج التفريغ، والمرحلة التالية هي تشكيل فيلم رقيقة. يتم تشكيل هذا الفيلم رقيقة الأكثر شيوعا باستخدام ورقة تصفية لإزالة السائل الزائد من الشبكة. في حين أن هذا يمكن القيام به يدويا، وعدد من أجهزة تجميد يغرق متاحة تجاريا، بما في ذلك Vitrobot Mk IV (الحرارية فيشر العلمية)، EM GP الثاني (لايكا) وCP3 (جاتان). مع هذه الأجهزة ، يتم تطبيق ~ 3-5 ميكرولتر من العينة في الحل على شبكة EM ، تليها النشاف بعيدا الحل الزائد باستخدام ورق التصفية. الشبكة، مع فيلم رقيقة علقت عبرها، ثم سقطت في الإيثان السائل تبريدها بالنيتروجين السائل (LN2) إلى ~-175 درجة مئوية. بمجرد تجميد الشبكة، يتم الحفاظ عليها عند درجة حرارة أقل من نقطة الإزالة (-137 درجة مئوية) قبل وأثناء التصوير.
فحص العينات وجمع البيانات بعد تزجيج شبكة cryoEM ، فإن المرحلة التالية هي فحص الشبكة لتقييم جودتها وتحديد ما إذا كانت الشبكة مناسبة للشروع في جمع البيانات عالية الدقة. شبكة التبريد المثالية لديها الجليد الزجاجي (على عكس الجليد البلوري) مع سمك الجليد كافية فقط لاستيعاب أطول بعد للعينة، وضمان الجليد المحيطة يساهم أقل قدر ممكن من الضوضاء إلى الصورة الناتجة. يجب أن يكون للجسيمات داخل الجليد حجم وشكل (إذا كان معروفا) بما يتفق مع الكيمياء الحيوية ، ومن الناحية المثالية يجب أن تكون أحادية التشتت مع توزيع عشوائي لاتجاهات الجسيمات. وأخيرا، ينبغي أن يكون للشبكة ما يكفي من المجالات ذات الجودة الكافية لتلبية طول جمع البيانات المطلوب. اعتمادا على العينة، وهذا قد يستغرق العديد من التكرار من التزجيج والفحص حتى يتم إنتاج الشبكات المثلى. لحسن الحظ ولسوء الحظ ، هناك مجموعة كبيرة من المتغيرات التي يمكن اختبارها تجريبيا لتغيير توزيع الجسيمات على شبكات cryoEM (تمت مراجعتها في 16،27). في هذه المخطوطة، تظهر النتائج التمثيلية لمشروع بروتين الغشاء10 .
وبمجرد تحديد شبكة مناسبة، يمكن المضي قدما في جمع البيانات. تم تحسين العديد من نماذج المجاهر الإلكترونية لنقل التبريد للعينات البيولوجية لجمع بيانات عالية الدقة بطريقة آلية. عادة، يتم جمع البيانات على 300 كيلو فولت أو 200 كيلو فولت. يمكن تحقيق جمع البيانات الآلي باستخدام البرمجيات بما في ذلك EPU (الحرارية فيشر العلمية)28، Leginon29، JADAS30 و SerialEM31،32. وعادة ما ينتج عن جمع البيانات الآلي باستخدام أجهزة الكشف الحديثة تيرابايت من البيانات الأولية في فترة 24 ساعة (يبلغ متوسط حجم مجموعات البيانات ~ 4 تيرابايت).
بسبب القيود المفروضة على COVID-19 في معظم أنحاء العالم (وقت كتابة ديسمبر 2020) ، انتقلت العديد من مرافق الفحص المجهري إلى توفير الوصول عن بعد. بمجرد تحميل الشبكات في التحميل التلقائي للمجهر ، يمكن إجراء الحصول على البيانات عن بعد.
معالجة الصور وبناء النموذج عندما تكون جلسة جمع البيانات عادة 0.5-4 أيام، قد تستغرق معالجة الصور اللاحقة عدة أسابيع وأشهر، اعتمادا على توفر موارد الحوسبة. ومن المعايير الأولية لمعالجة الصور الخطوات ، وهي تصحيح الحركة ونقل التباين وظيفة (CTF) تقدير أن تجري 'على الطاير' 33344. للمعالجة المصب، وهناك عدد كبير من مجموعات البرمجيات المتاحة. يتم "انتقاؤها" الجسيمات واستخراجها من micrographs35,36. وبمجرد استخراج الجسيمات، سيكون البروتوكول القياسي هو معالجة الجسيمات من خلال عدة جولات من التصنيف (في كلا البعدين (ثنائي الأبعاد) وثلاثة أبعاد (ثلاثية الأبعاد) و/أو التركيز على مناطق محددة ذات أهمية) للوصول إلى مجموعة فرعية متجانسة من الجسيمات. ثم يتم متوسط هذه المجموعة الفرعية المتجانسة من الجسيمات معا لإنتاج إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. عند هذه النقطة غالبا ما يتم تصحيح البيانات أكثر لإنتاج خريطة أعلى جودة ممكنة، على سبيل المثال من خلال صقل CTF، وتصحيحات التشويه37 وتلميع بايزي38 . نتيجة معالجة هذه الصورة هي خريطة cryoEM ثلاثية الأبعاد للعينة البيولوجية ذات الاهتمام. نطاق القرار التي تم التوصل إليها في تجربة "قياسية" الجسيمات الفردية الآلي من شبكة ذات جودة كافية، مع البيانات التي تم جمعها على نظام المجهر 300 كيلو فولت عادة ما يكون بين 10 Å و 2 Å اعتمادا على حجم ومرونة مجمع البروتين. مع عينة مثالية، تم الآن التوصل إلى قرارات ~1.2 Å باستخدام سير العمل SPA5. في حين أن هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات نحو الحصول على خريطة كثافة EM، مرة واحدة وهذا هو في متناول اليد يمكن تفسيرها من خلال تركيب وصقل نموذج البروتين (إذا كان القرار هو < 3.5 Å) أو بناء دي novo39. يمكن إيداع البيانات المرتبطة بتجارب تحديد الهيكل في المستودعات العامة عبر الإنترنت، بما في ذلك خرائط الكثافة EM (بنك بيانات المجهر الإلكتروني)40، والإحداثيات الذرية الناتجة (بنك بيانات البروتين)41 ومجموعات البيانات الخام (أرشيف الصور العامة المجهر الإلكتروني)42.
في هذا البروتوكول، يتم استخدام مجمع البروتين الخارجي RagAB (~ 340 كيلودا) من بورفيروموناس جينجيفاليس كمثال مجمع الجزيئات الكلية10 (EMPIAR-10543). بالنسبة لأولئك الجدد ل cryoEM ، يتوفر دعم للعينات من خلال خط الأنابيب هذا من عينة إلى بنية ، رهنا بمراجعة الأقران ، من خلال مخططات الوصول الممولة مثل iNEXT Discovery و Instruct.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

المجهر الإلكترونى (cryoEM) هو تقنية قوية لتحديد هيكل المجمعات الجزيئية الكلية، عن طريق تحليل الجسيمات واحد (SPA). وتنطوي العملية الشاملة على 1) تزجيج العينة في فيلم رقيق مدعوم على شبكة cryoEM؛ '2' فحص العينة لتقييم توزيع الجسيمات وجودة الجليد؛ 3) إذا كانت الشبكة مناسبة، وجمع مجموعة بيانات جسيم واحد للتحليل؛ و4) معالجة الصور لتسفر عن خريطة الكثافة EM. في هذا البروتوكول، يتم توفير نظرة عامة لكل خطوة من هذه الخطوات، مع التركيز على المتغيرات التي يمكن للمستخدم تعديلها أثناء سير العمل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للقضايا الشائعة. مع تشغيل المجهر عن بعد تصبح قياسية في العديد من المرافق، سيتم وصف الاختلافات على بروتوكولات التصوير لمساعدة المستخدمين في التشغيل الفعال والتصوير عندما يكون الوصول المادي إلى المجهر محدودة.

وعند الفحص، يمكن التخلص من الشبكات في مرحلة الأطلس، حيث تشير الميزات التي يتم حلها عند التكبير المنخفض إلى أن الشبكة غير مناسبة للحصول على البيانات. على سبيل المثال، إذا تعرضت الشبكة لأضرار ميكانيكية كبيرة مع كسر معظم مربعات الشبكة (الشكل 2A)، أو حيث تبدو الشبكة "جافة"، بدون جليد حيوي (الشكل 2B). يمكن تعريف هذه الشبكات عادة حيث تظهر حواف مربعات الشبكة حادة ومتميزة. عبر معظم الشبكات المصنوعة باستخدام جهاز تجميد الهبوط ، لوحظ تدرج من الجليد (الشكل 2C ، D). توزيع الجسيمات، اعتمادا على عينة من الفائدة، يمكن أن تختلف بشكل كبير مع سمك الجليد، وبالتالي يوصى بفحص مجموعة من المربعات الشبكة لتقييم توزيع الجسيمات. وقد نفذت أدوات في إطار برنامج الاتحاد البرلماني الدولي خلال خطوة فحص أطلس لمساعدة المستخدم على تحديد مربعات الشبكة ذات سمك الجليد المماثل أو المختلف، والتي يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص للمستخدمين الجدد في فحص شبكات cryoEM (الشكل 2E، F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> الشكل 2: مثال على المونتاج "أطلس" التكبير المنخفض من جلسات الفحص. أ) الشبكة التي عانت من أضرار كبيرة مع معظم المربعات الشبكة مكسورة - غير مناسبة لجمع. ب) شبكة جافة مع عدم وجود الجليد الزجاجي - غير مناسب لجمع. ج) شبكة تظهر تدرج الجليد مع ~ 50٪ من الشبكة صالحة للاستخدام. د) تدرج الجليد مع ~ 33٪ من الشبكة صالحة للاستعمال. كل من C و D، هي مناسبة لجمع البيانات إذا كانت مربعات الشبكة قابلة للاستخدام لديها سمك الجليد المناسبة لجمع، وهناك ما يكفي من مناطق الاستحواذ لتلبية الحد الأدنى لمدة جمع (على سبيل المثال، 24 ح) E) أطلس مثال مع مجموعة من سمك الجليد. F) نفس الأطلس المقدم في E ولكن مع، المربعات الشبكة تصنيفها والملونة من قبل برنامج EPU وفقا لسمك الجليد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
عند فحص توزيع الجسيمات، تأكد من أن معلمات التصوير، مثل التكبير والجرعة الإلكترون الكلية، مماثلة لتلك المتوقع استخدامها أثناء الحصول على البيانات من أجل تقديم صورة دقيقة عن النتائج المتوقعة. أثناء الفحص ، يكون توزيع الجسيمات المثالي أحادي التشتت مع مجموعة من اتجاهات الجسيمات المرئية (اعتمادا على العينة والمعرفة الحالية مورفولوجيا الجسيمات ، قد يكون من الصعب التأكد من ذلك) (الشكل 3A). يجب أن يكون الجليد رقيقا قدر الإمكان مع استيعاب الجسيمات أكبر بعد ، إذا كان الجليد رقيقا جدا ، فيمكن أن يذوب عندما يضيء بشعاع الإلكترون. وهذا يسبب الحركة المفرطة في ميكروجراف، وينبغي تجنب المناطق التي تعرض هذه الخاصية (الشكل 3B). من التجربة الجماعية ، لوحظ هذا التأثير الأكثر شيوعا عندما يكون هناك المنظفات في المخزن المؤقت. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الجليد رقيقة جدا في وسط الحفرة وحتى الجسيمات يمكن استبعادها جسديا وإجبارها نحو الحافة. ويلاحظ هذا التأثير في الشكل 3C، ولكنه في هذه الحالة ليس مثالا متطرفا، وستظل هذه الصور تسهم بشكل مفيد في مجموعة البيانات. وأخيرا، يجب أن يكون الجليد زكيا؛ استبعاد أي مناطق من الشبكة (أو الشبكات) حيث تظهر معظم أو كل الصور الملتقطة الجليد البلوري (الشكل 3D) من الحصول على البيانات. في كثير من الأحيان ، لوحظ الجليد غير الزجاجي على حافة مربعات الشبكة. تتم إحالة القراء إلى مراجعات مفصلة للمتغيرات التي يمكن تغييرها أثناء تزجيج الشبكة16 وأوصاف سلوك الجسيمات في بيئة الفيلم الرقيق4647 لمزيد من المعلومات.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> الشكل 3: صور دقيقة تمثيلية تبين توزيعات مختلفة للجسيمات. أ) توزيع "مثالي" للجسيمات أحادية التشتت التي تعتمد مجموعة من التوجهات. ب) الجليد رقيقة بشكل مفرط في منتصف الحفرة التي تشوه عند التعرض لشعاع الإلكترون مما تسبب في الحركة المفرطة في المجهر. ويلاحظ هذا التأثير في معظم الأحيان عندما المنظفات موجودة في العازلة C) حيث الجليد هو أرق في وسط الحفرة، وهذا يستبعد جسديا الجسيمات من المركز، مما تسبب في ازدحام الجسيمات نحو حافة الثقب. في هذه الحالة ، ليس متطرفا بما يكفي لمنع هذه الصور من أن تكون مفيدة ، ولكنها تشير إلى أنه يستحق الفحص مناطق أكثر سمكا قليلا. د) الجليد ليس الزجاجية، لا ينبغي جمع البيانات على المناطق التي تبدو مثل هذا المثال ميكروجراف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يمكن أن تساعد معالجة الصور على الفور في التقاط الأخطاء والمشاكل المتعلقة بالحصول على البيانات ، لذا يوصى دائما حيثما أمكن ذلك. على سبيل المثال، قد تشير الحركة المفرطة داخل الصور الدقيقة إلى أن مضخة توربو التحميل التلقائي نشطة، أو يتم جمع البيانات على مربع شبكة متصدع حيث يتحرك الجليد بشكل كبير في شعاع الإلكترون، مما يشير إلى أنه يجب تخطي مربع الشبكة. على الطاير يمكن تقدير CTF تكشف عن الظروف التي يتم فيها تطبيق نقطة تركيز إيجابية (بدلا من defocus) (حيث يتم استخدام برامج تقدير CTF والمعلمات للعثور على هذه النقاط)، وتحديد التحول المرحلة حيث يتم استخدام لوحة مرحلة فولتا48. على خطوط أنابيب معالجة الصور تطير غالبا ما تشمل ملخص رسومية للبيانات (الشكل 4A) لتسهيل على المستخدمين لتقييم جودة micrograph بسرعة وتقرر ما إذا كانت هناك حاجة إلى تعديلات جمع البيانات.
اختيار الجسيمات من micrographs، في حين تجنب "إيجابيات كاذبة" مثل التلوث أو فيلم دعم الشبكة يمكن أن تتطلب التحسين. ومع ذلك ، فإن جامعي الجسيمات مثل crYOLO غالبا ما يعملون بشكل جيد بما فيه الكفاية باستخدام المعلمات الافتراضية ل "أول تمريرة" من البيانات (الشكل 4B) ، مما يتيح التقدم إلى متوسط الفئة 2D حيث يمكن أن يكون من الأسهل تقييم جودة البيانات واحتمال نجاح المصب. بالنسبة لمعظم المشاريع ، يجب أن يبدأ التصنيف 2D لجسيمات 10k > ~ في الكشف عن الفئات التي تحتوي على تفاصيل البنية الثانوية. للشروع في 3D، ينبغي أن تكشف مرحلة التصنيف 2D عادة الطبقات التي تمثل مجموعة من التوجهات الجسيمات. إذا تم الكشف عن اتجاه مفضل، قد يلزم إجراء المزيد من التكرارات لإعداد العينة16 أو الحصول على مزيد من البيانات مع إمالة العينة49. يجب اختيار جميع الفئات التي تظهر تفاصيل البنية الثانوية للمضي قدما في التحليل ثلاثي الأبعاد ، في حين يتم التخلص من الجسيمات "غير المرغوب فيها" (الشكل 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> الشكل 4: خطوات معالجة الصور الأولية. أ) الإخراج من 'على الطاير' صورة معالجة السيناريو. ب) مثال ميكروجراف (يسار) مع الجسيمات التي تم انتقاؤها تلقائيا بشكل مناسب التي تم تحديدها باستخدام نموذج crYOLO العام (يمين، مع الجسيمات التي تحدها المربعات الحمراء) قضبان المقياس (أبيض) هي 50 نانومتر. ج) نتائج التصنيف 2D تبين الطبقات التي تم التخلص منها في المربع الأحمر، والفئات التي تم اختيار الجسيمات لمزيد من المعالجة باللون الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
ويمكن استخدام مجموعة فرعية صغيرة من الجسيمات لتوليد نموذج أولي (الشكل 5A). ويمكن بعد ذلك استخدام هذا النموذج الأولي كنموذج بداية في التصنيف 3D والصقل. وفي حالة RagAB، تضمنت مجموعة البيانات ثلاثة مطابقين متميزين يمكن فصلهم أثناء التصنيف ثلاثي الأبعاد (الشكل 5B). ويمكن بعد ذلك معالجة الجسيمات المساهمة في كل فئة من هذه الفئات بشكل مستقل واستخدامها لصقل خريطة كثافة EM التي يمكن أن تخضع بعد ذلك لمزيد من التفسير وبناء النموذج.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> الشكل 5: إنشاء خريطة كثافة 3D EM. أ) نموذج نموذجي الأولية التي تم إنشاؤها باستخدام RELION. ب) تصنيف ثلاثي الأبعاد على 5 فئات تظهر فصل الجسيمات إلى ثلاث حالات تشكيلية متميزة: مفتوحة مفتوحة (خضراء)، مفتوحة مغلقة (زرقاء)، مغلقة مغلقة (أرجواني). ج) عملية إنشاء قناع. الخريطة من الصقل 3D (يسار) ينبغي تصور في الوهم. يمكن استخدام عارض الصوت بعد ذلك لتحديد الحد الأدنى الذي تكون الخريطة فيه خالية من الكثافة المفككة الصاخبة (في الوسط). يتم إدخال قيمة العتبة هذه ك عتبة ثنائية أولية في وظيفة إنشاء قناع RELION. يظهر إخراج قناع مثال باللون الرمادي (يمين). D) خريطة الكثافة EM عالية الدقة لحالة RagAB المفتوحة الإغلاق (EMD-10245)، التي تمت تصفيتها وتلوينها بالدقة المحلية (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

أصبح تحديد هيكل المجمعات الجزيئية الكبيرة باستخدام cryoEM روتينيا لفئات معينة من البروتينات والمجمعات. هنا، يتم تلخيص هذا الخط (إعداد العينات، والفحص، والحصول على البيانات ومعالجتها) ويتم توجيه القراء نحو المزيد من الموارد التفصيلية والمتغيرات التي يمكن تغييرها في حالة العينات الأكثر تحديا.

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

أصبح تحليل التبريد-EM أحادي الجسيمات تقنية روتينية في صندوق أدوات عالم الأحياء الهيكلي المطبق على مجموعة واسعة من العينات بما في ذلك بروتينات الأغشية والفيبريلات الأميلويد والبروتينات والفيروسات الملزمة لحمض النوى. وبمجرد الانتهاء من إعداد العينات وتحميل الشبكات في المجهر، يمكن جمع البيانات عن بعد في العديد من مرافق التبريد و EM مثل مختبر أستبري للهياكل الحيوية وeBIC. غالبا ما تكمن الحواجز الرئيسية أمام تحديد الهيكل الناجح في مراحل إعداد العينة وفحص الشبكة مع تكرارات متعددة مطلوبة أحيانا من خلال هذه العملية.هنا، سوف نظهر فحص الشبكة عن بعد والحصول على بيانات جسيم واحد. في علامة التبويب محمل تلقائي من واجهة مستخدم المجهر، قم بعلامة التبويب خارج مربع حوار الخيارات باستخدام السهم واضغط على زر المخزون. سيؤدي ذلك إلى التحقق من كل موضع في الكاسيت بشكل تسلسلي لتحديد ما إذا كانت خرطوشة موجودة.سيتم تشغيل المخزون على كل فتحة بشكل تسلسلي. عند تعيين كافة الفتحات المحتلة، سيتوقف المخزون. قم بتمييز الشبكة التي سيتم نقلها إلى عمود المجهر وانقر فوق الحمل.ستتحول تسمية الفتحة من اللون الأزرق إلى الأصفر بمجرد تحميل الشبكة بنجاح على المسرح. لفحص الشبكات، افتح برنامج EPU. في صفحة الإعداد، حدد بصريات وإعدادات الاقتناء، ثم حدد إعداد أطلس مسبقا من القائمة المنسدلة.اختر إعدادات إعداد الحزمة المناسبة واضغط على مجموعة لدفع المعلمات إلى المجهر. اضغط لفتح صمامات العمود وإدخال شاشة الإنفلونزا. تأكد من أن شعاع مرئية وتنتشر بما فيه الكفاية وتركزت لتغطية الكاشف.إذا لزم الأمر، انتقل إلى منطقة أرق من الشبكة باستخدام عصا التحكم أو لوحات اليد الظاهرية للتحكم في حركات المرحلة في X و Y.Lift شاشة الإنفلونزا وأخذ صورة باستخدام زر المعاينة في وحدة معالجة الرسومات. في وحدة معالجة الرسومات، انتقل إلى صفحة أطلس واضغط على جلسة جديدة. حدد تنسيق صورة MRC وأدخل اسم مجلد وموقع مناسب لحفظ جلسة الفحص، ثم انقر فوق تطبيق.حدد الفحص من القائمة على اليسار. ضع علامة على مربعات الاختيار بجوار كل شبكة للحصول على مونتاج أطلس ، ثم ابدأ جلسة الفحص في EPU. يتم الحصول على أطلس لكل شبكة تم فحصها ويتم سرد مربعات الشبكة المتاحة عند الانتهاء.ويمكن الاطلاع على كل أطلس من خلال تسليط الضوء عليه على صفحة الفحص. عند الانتهاء، قم بمراجعة الأطالس المجمعة وحدد الشبكات المناسبة لتقييم جودة العينة في التكبيرات الأعلى. قم بتمييز الشبكة المختارة في قائمة فحص وحدة معالجة الرسومات وانقر فوق عينة التحميل.من قائمة فحص أطلس، حدد الشبكة المحملة حاليا ونقل المرحلة إلى مربع الشبكة التي تحتوي على ثقوب مملوءة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوق الموقع المطلوب على صورة الشبكة واختيار مرحلة التحرك هنا. العودة إلى صفحة إعداد وحدة معالجة الرسومات وحدد الإعداد المسبق لمربع الشبكة. افتح صفحة الوظائف التلقائية ل EPU واركض تلقائيا إلى مركز التكون عن طريق إمالة المرحلة مع إعداد مربع الشبكة مسبقا لنقل العينة إلى الارتفاع متحد المركز.في إعداد وحدة معالجة الرسومات ، خذ صورة معاينة مربعة جديدة للشبكة. لاحظ القيم الرمادية عبر ثقوب مختلفة تشير إلى اختلاف سمك الجليد. نقل المرحلة فوق حفرة باستخدام انقر بزر الماوس الأيمن ونقل المرحلة هنا.حدد الفتحة أو الإعداد المسبق للارتفاع متحد المركز، ثم انقر فوق معاينة. حدد مسبقا الحصول على البيانات وتعيين التكبير الذي يسمح بسهولة تحديد الجسيمات. تعيين إزاحة defocus إلى سالب ثلاثة إلى خمسة ميكرومترات.يكرر من خلال خطوات لإعادة تقييم مجموعة من سمك الجليد لتوزيع الجسيمات، والتوجه، والتلوث عبر الشبكة. اعتمادا على توافر المجهر، والاستمرار مباشرة إلى جمع البيانات أو يمكن إزالة الشبكات من المجهر لجمع المستقبل بما في ذلك في مواقع أخرى. جمع أطلس إذا كان أحد غير متوفر من الفحص عن طريق إعداد إعدادات أطلس واختيار الشبكة للحصول على أطلس.الحصول على أطلس وانقر على موقع الشبكة لمعرفة الإخراج. وبمجرد اكتمال الأطلس، حدد كل إعداد من إعدادات الحزم المسبقة وفقا للاحتياجات التجريبية للمشروع. إجراء معايرة إزاحة الصورة.قم بإعداد جلسة عمل EPU عن طريق تحديد إعداد جلسة عمل صفحة EPU ثم تحديد جلسة عمل جديدة أو جديدة من التفضيلات. بعد تحديد جلسة عمل جديدة، ستظهر نافذة منبثقة توفر خيارا لاستخدام الإعدادات السابقة. سيتم تحميل الإعدادات تلقائيا من جلسة العمل السابقة إلى الحالية وحدة معالجة الرسومات.بدلا من ذلك، حدد جديدا من التفضيلات واختر ملفا مع التفضيلات المحفوظة للتحميل المسبق لهذه المعلومات في وحدة معالجة الرسومات الحالية. ملء اسم الجلسة مع شيء مفيد. في النوع، حدد يدوي.لوضع الامتلاك، حدد توسيط الثقب الدقيق أو اكتساب أسرع إذا كانت مجموعة التحولات الحرة للصورة متوفرة وممتهة. حدد تنسيق الصورة المطلوب، ثم حدد مجلد التخزين وستنشئ EPU دليلا باسم الجلسة. حدد الشبكة المناسبة وفقا لتباعد فتحة الشبكة الذي يتم استخدامه واضغط على تطبيق.حدد مربع شبكة أولية ثم قم بتعيين قالب اكتساب. انتقل إلى التحديد المربع. إذا كانت كافة المربعات خضراء، فانقر فوق إلغاء تحديد الكل في أعلى اليسار.افتح الإطارات المتجانبة بالنقر بزر الماوس الأيمن ثم حدد الإطار المتجانب المفتوح. إضافة مربع شبكة أو اختياره بالنقر فوق تحديد، ثم النقر بزر الماوس الأيمن وتحديد مرحلة النقل إلى مربع الشبكة. انتقل إلى اختيار حفرة واضغط لصناعة السيارات في eucentric.انتظر حتى يتم التقاط صورة مربعة للشبكة. إذا فشل الوظيفة التلقائية، قد يكون هذا بسبب ارتفاع بشكل ملحوظ إيقاف. ويمكن تعديلها يدويا باستخدام شاشة الانفلونزا في التكبير مربع الشبكة.لقياس حجم الثقب، قم بتحريك وضبط الدوائر الصفراء بحيث تكون فوق الثقوب مع الحجم الصحيح والتباعد. اضغط على البحث عن ثقوب. تأكد من أن الثقوب قد تم العثور عليها بشكل صحيح.إذا لم يكن كذلك، تغيير حجم الثقب واضغط العثور على ثقوب مرة أخرى. إذا فشلت هذه العملية باستمرار، ففكر في الانتقال إلى رقم أقل أو حجم نقطة أكثر سطوعا عند تكبير مربع الشبكة. استخدم مخطط تخطيطي جودة الثلج على اليمين لضبط تحديد الثقب.وهذا يمكن أن يكون مفيدا لاستبعاد المناطق ذات الجليد السميك والجليد الرقيق. سيتم تذكر هذا المربعات الشبكة المستقبلية المحددة أثناء جلسة العمل. تحسين تحديد الفتحة باستخدام الأدوات الموجودة في القائمة المحددة في الأعلى.على سبيل المثال، انقر فوق إزالة الثقوب القريبة من شريط الشبكة. انتقل إلى تعريف القالب واضغط على اكتساب. انقر فوق البحث وثقب المركز.تغيير التأخير بعد مرحلة التحول والتأخير بعد نقل الصورة مرات إلى 1-5 ثوان، ثم إذا كان متوفرا، تحقق من الحد الأقصى لقيمة التحول الصورة كما هو مطلوب. انقر فوق إضافة منطقة الاستحواذ وانقر فوق أي مكان على الصورة. نقل منطقة الاستحواذ إلى الموقع المطلوب.إضافة نطاق defocus على أعلى اليمين. قائمة ديفوكوس نموذجية لمشروع بروتين الغشاء هو سلبي 0.8 إلى سلبي ثلاثة ميكرومتر ديفوكوس، ثم إضافة مناطق الاستحواذ الأخرى، وترتيبها بحيث لا تتعرض مناطق الاستحواذ بشكل مضاعف مع شعاع. انقر فوق إضافة منطقة التركيز التلقائي وانقر فوق أي مكان على الصورة.نقل منطقة التركيز التلقائي إلى الكربون المحيطة حفرة. الممارسة القياسية هي التركيز التلقائي بعد التوسيط عند استخدام AFIS أو كل خمسة إلى 15 ميكرومتر اعتمادا على تباين ارتفاع Z عبر المربع. انقر فوق إضافة منطقة قياس الانجراف.تم إجراء قياس الانجراف مرة واحدة لكل مربع شبكة مع عتبة محددة قدرها 0.05 نانومتر في الثانية كإعداد قياسي. يمكن أن تتداخل منطقة قياس الانجراف مباشرة مع منطقة التركيز التلقائي. تأكد من عدم تداخل منطقة الانحراف أو التركيز التلقائي مع منطقة الاستحواذ.العودة إلى مربع التحديد وتحديد المربعات لاكتساب على الشبكة. استخدم عدد مناطق الاستحواذ ومعدل الحصول المتوقع على البيانات للتنبؤ بعدد مناطق الاستحواذ المطلوبة. عند تحديد كافة المربعات المطلوبة، اضغط على إعداد كافة المربعات.بمجرد جمع كل مربع، انتقل بين مربعات الشبكة وصقل الثقوب باستخدام فرشاة التحديد. الانتقال إلى موقع مرحلة فوق العينة واستخدام وظائف السيارات لتعيين ارتفاع eucentric. قم بإجراء محاذاة مجهرية باستخدام برنامج المجهر كما هو موضح سابقا وفي النص.قم بإجراء محاذاة خالية من الغيبوبة داخل الوظائف التلقائية قبل إعادة إدراج وتوسيط الفتحة الموضوعية وتصحيح الاستجماتيزم البؤري للعدسة الهدف مع وحدة معالجة الرسومات. تأكد من أن كلا المحاذاتين تتلاقى على القيم المناسبة. قبل بدء تشغيل الاستحواذ التلقائي، تأكد من إيقاف تشغيل مضخة توربو محمل السيارات ويتم إدراج الفتحة الهدف إذا لزم الأمر.في الاستحواذ الآلي، اضغط على بدء التشغيل لبدء الحصول الآلي على البيانات. وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن فحص الشبكات المقطوعة أو الجافة والتخلص منها في مرحلة الأطلس. لوحظ تدرج من الجليد عبر معظم الشبكات.أثناء الفحص ، يتم مونوين توزيع الجسيمات المثالي مع مجموعة من التوجهات الجسيمات مرئية. إذا كان الجليد رقيقا جدا ، فيمكن أن يذوب عندما يضيء بشعاع الإلكترون ، مما يسبب حركة مفرطة في المجهر. ويلاحظ هذا الأكثر شيوعا عندما يكون هناك المنظفات في المخزن المؤقت.الجليد يحتاج إلى أن يكون الزجاجي حتى مناطق من الشبكة حيث غالبية الصور تظهر الجليد البلوري استبعدت. وقد أدرج موجز بياني للبيانات لتقييم جودة الميكروستوغرافيا وتقرير ما إذا كانت هناك حاجة إلى إدخال تعديلات على جمع البيانات. جامعي الجسيمات مثل crYOLO تعمل بشكل جيد بما فيه الكفاية لتمريرة الأولى من البيانات، وتمكين التقدم إلى متوسط فئة 2D.وينبغي اختيار الفئات التي تظهر تفاصيل البنية الثانوية للتحليل ثلاثي الأبعاد في حين ينبغي التخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها. ويمكن استخدام مجموعة فرعية من الجسيمات لتوليد نموذج أولي للتصنيف 3D والصقل. وفي حالة RagAB، تضمنت مجموعة البيانات ثلاثة مطابقين متميزين يمكن فصلهم أثناء التصنيف ثلاثي الأبعاد.من المهم أن نتذكر أن النجاح في الحصول على البيانات والخطوات اللاحقة لتحليل الصور تعتمد على الحصول على وتحديد الشبكات المحسنة بشكل جيد خلال مرحلة الفحص. بمجرد الحصول على خريطة كثافة 3D EM ، يمكن تفسيرها بشكل أكبر من خلال تركيب وتكرير نموذج البروتين أو بناء نموذج ذري de novo. يتيح تحليل الجسيمات المفردة Cryo-EM التحديد المنظم للعديد من الأهداف التي لم تكن ممكنة من قبل.وتجدر الإشارة إلى أن مهام سير العمل هذه قد استخدمت مؤخرا لحل هياكل الجزيئات الكلية ذات الصلة COVID-19.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

تحضير جسيمات النواة النيوكليوسوم المعقدة مع عوامل إصلاح الحمض النووي للتحديد الهيكلي للمجهر الإلكتروني بالتبريد

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

استخراج الأنابيب الدقيقة المعدلة من خلايا الثدييات لدراسة معقدات بروتين الأنابيب الدقيقة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...