Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
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这项工作得到了欧盟委员会地平线2020计划资助的iNEXT-Discovery（赠款871037）的支持。J B. R. White由Wellcome Trust（215064/ Z / 18 / Z）资助。FEI Titan Krios显微镜由利兹大学（UoL ABSL奖）和Wellcome Trust（108466 / Z / 15 / Z）资助。我们感谢M Iadanza使用他的显微照片分析脚本。我们感谢Diamond Light Source访问和支持由Wellcome Trust，MRC和BBRSC资助的英国国家电子生物成像中心（eBIC）的冷冻电镜设施。

没有报告任何利益冲突。

在该协议中，我们描述了一种适用于常规SPA的标本的基本管道。虽然这种薄膜形成和玻璃化的滤纸印迹方法无疑是成功的，因为它在迄今为止的绝大多数SPA项目中都有使用，但它有许多缺点。这些因素包括样品浪费、形成薄膜和冷冻样品所需的慢速时间尺度（秒）、报告的不可重复性27 以及使用滤纸吸走多余液体的负面影响50。最近，已经开发了新技术来提高薄膜生产的再现性51，52。已经开发了其他技术，可以减少样品应用和玻璃化之间的时间53，54，55。虽然在撰写本文时，基于滤纸的薄膜形成方法仍然是SPA冷冻EM样品制备中最普遍的方法，但这些新技术可能会在网格玻璃化的效率和再现性方面带来一系列好处，并创造新的机会，带来额外的实验维度，如时间分辨率和玻璃化前的快速混合。
对于大多数用户来说，网格筛选过程目前是一个定性过程，涉及获取低倍率图集，然后在整个网格中拍摄高倍率图像以评估颗粒分布。虽然对于某些类型的标本来说，这是一种足够强大的方法，但很难用眼睛来评估标本是否确实是研究人员希望成像的东西，或者具有首选的方向，例如对于小（<200 kDa）样品，或者低分辨率形态使得如果存在一系列颗粒分布，则很难用眼睛识别。对于某些项目，无法确定标本是否如预期的那样，例如配体结合的地方或正在筛选样品以评估小（例如，10 kDa）亚基是否仍然与复合物相关。对于这些项目，用于数据分析的全自动管道与"短"的0.5 - 1小时集合相结合，可以通过图像处理步骤进行2D分类甚至3D分类和细化，这将有助于有效地确定是否需要更长的集合。这些管道仍在开发中，目前尚未广泛实施，但它们有可能提高cryoEM网格筛选的效率，特别是对于具有挑战性的标本。
直接电子探测器的改进，以及显微镜的修改，加上图像处理的进步，如图像偏移数据收集，提高了数据采集过程中产生的图像的吞吐量和质量。数据收集速率的这种增加凸显了在获取许多TB数据之前对冷冻电镜网格进行彻底筛选的必要性。
CryoEM SPA已成为一种真正主流的结构生物学技术，在许多情况下，这是某些类别标本的"去"方法，例如异质性和不稳定的大分子复合物。虽然这里的协议描述了SPA管道的基本概述，但这里涵盖的每个部分（网格玻璃化和筛选，cryoEM和图像处理）本身就是一个主题，值得在SPA项目的开发过程中进行探索。随着样品制备和显微镜技术的进步，以及新的图像处理算法和方法的上线，SPA将继续作为管道开发，帮助研究人员深入了解复杂的生物系统。

单颗粒冷冻机电镜 为了在分子水平上研究生命，我们必须了解结构。有许多技术可用于探测蛋白质结构，例如NMR，X射线晶体学，质谱法和电子显微镜（EM）。迄今为止，沉积到蛋白质数据库（PDB）的大多数结构已经使用X射线晶体学进行了解析。然而，从2012年左右开始，冷冻电子显微镜（cryoEM）成为蛋白质结构测定的主流技术，其使用量急剧增加。存入电子显微镜数据库（EMDB）的EM图谱总数（截至2020年12月）为13，421张，而2012年为1，566张（图1，www.ebi.co.uk）。2012年，沉积到PDB的冷冻EM密度图中建模的原子坐标数量仅为67个，但截至2020年12月，到目前为止，已经沉积了2，309个结构，增加了35倍。所生产的冷冻EM密度图的质量和数量的潜在增长，有时被称为"分辨率革命"1，是由多个领域的进步共同引起的：开发称为直接电子探测器的新型成像相机;新软件;和更稳定的显微镜2，3，4。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> 图 1：从 2012 年到 2020 年 12 月向 EMDB 提交的累计申请。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的大图。</a>
单颗粒分析（SPA）是一种强大的工具，通过阐明分离复合物的高分辨率结构5，6（包括病毒7，8，膜蛋白9，10，螺旋组装体11和其他动态和异质大分子复合物12，13）来生成各种样品类型的生物学见解，其大小因数量级而异（从39 kDa开始）14，15到数十兆达尔顿）。这里描述了从样品到结构的冷冻EM SPA标准管道的协议。
在开始使用该管道之前，应对纯化的样品进行生化分析，以评估其下游成功的机会。制备合适的样品可以说是SPA的最大障碍，特别是对于瞬态和非均质（组合和构象）复合物。大分子复合物制备应包含尽可能少的污染物，浓度足以在每个冷冻EM显微照片中产生许多颗粒，并且非常适合冷冻EM分析的缓冲液成分。某些缓冲液成分，包括蔗糖、甘油和高（~>350 mM浓度的盐，取决于样品大小、性质和其他缓冲液成分）会干扰玻璃化过程或降低图像中的信噪比，阻碍结构测定16。
通常，作为最小尺寸排阻色谱（SEC）和SDS-PAGE凝胶分析，应用于评估样品纯度17，18，但圆二色性，功能测定，SEC结合多角度光散射和热稳定性测定都是在冷冻EM分析之前对大分子复合物制剂进行定性分析的有用工具。然而，这些生化分析的结果可能无法深入了解样品的结构异质性及其在冷冻电磁网格上的行为。因此，阴性染色剂EM通常被用作评估成分和构象异质性的快速，廉价和强大的工具，因此是确定纯化中哪种洗脱部分最有希望或筛选不同缓冲液成分的好方法19，20。一旦确定了有希望的样品，我们就可以进入SPA冷冻EM管道。阴性染色并不总是与冷冻EM中看到的后续结果一致;有时样品的阴性染色看起来很差，但在冷冻EM的玻璃体冰中看到时会有所改善。相比之下，有时样品在阴性染色步骤中看起来非常出色，但在进入冷冻EM时需要进一步优化。然而，在大多数情况下，阴性染色提供了一个有用的质量控制步骤。
玻璃化 电子显微镜真空系统内的恶劣环境会对未固定的生物标本造成脱水和辐射损伤21。因此，要以类似天然的状态对样品进行成像，必须在成像之前保存生物标本。对于大分子复合物的纯化制备，玻璃化是首选的方法，可以通过冷冻电镜进行可视化，同时保留复合物的原子细节。玻璃化作为样品制备方法的发现是生物标本电子显微镜的根本进步，Dubochet因此获得了2017年诺贝尔化学奖。样品玻璃化涉及创建一层薄薄的溶液，其中包含目标样品，通常为数十nm厚，悬浮在冷冻EM网格支撑上。然后将薄膜在~-175°C的冷冻剂（如液体乙烷）中极快地冷冻。 冷冻速率约为106 °C / s，足够快，形成无定形或玻璃体冰，将试样悬浮在薄的固体薄膜中22。
要考虑的初始变量是选择的 cryoEM 网格支持23。EM网格通常由支撑结构上带有穿孔（规则或不规则）的无定形碳膜组成。支撑结构通常是直径为3.05 mm的圆形金属网格，通常由铜制成，但可以使用其他金属，例如金或钼（具有优选的热膨胀性能24）。有时，在网格上施加额外的薄，连续支撑，例如石墨烯，氧化石墨烯或薄（~1-2nm）无定形碳层。虽然标准冷冻EM网格（最常见的是400-200目铜，穿孔（1.2μm圆孔，间隔1.3μm（r1.2 / 1.3），或2μm，由2μm碳（r2 / 2））碳载体隔开 - 尽管迄今为止有许多不同的模式可用）已被用于绝大多数结构中，但据报道，具有改进的导电性和减少试样运动的新型网格技术25.选定的网格经过辉光放电/等离子体清洗处理，使其具有亲水性并适合样品应用26。
在辉光放电之后，下一阶段是薄膜形成。这种薄膜通常使用滤纸从网格中去除多余的液体而形成。虽然这可以手动进行，但市面上有许多小型冷冻设备，包括Vitrobot Mk IV（赛默飞世尔科技），EM GP II（徕卡）和CP3（Gatan）。使用这些设备，将约3-5μL溶液中的样品施加到EM网格上，然后使用滤纸吸走多余的溶液。网格上悬挂着一层薄膜，然后插入液态乙烷中，由液氮（LN2）冷却至~-175°C。 一旦冻结，网格在成像之前和成像期间保持在低于失活点（-137°C）的温度。
标本筛选和数据收集 在冷冻EM网格的玻璃化之后，下一阶段是筛选网格以评估其质量并确定网格是否适合进行高分辨率数据收集。理想的冷冻EM网格具有玻璃体冰（与结晶冰相反），其冰厚度刚好足以容纳样品的最长尺寸，确保周围的冰对生成的图像产生尽可能少的噪声。冰中的颗粒应具有与生物化学一致的大小和（如果已知）形状，理想情况下是单分散的，具有随机分布的颗粒取向。最后，网格应具有足够质量的面积，以满足所需的数据收集长度。根据样品的不同，这可能需要多次玻璃化和筛选，直到产生最佳网格。幸运的是，不幸的是，有一大范围的变量可以通过经验测试来改变冷冻EM网格上的粒子分布（在16，27中回顾）。在这份手稿中，显示了膜蛋白项目10 的代表性结果。
一旦确定了合适的网格，就可以继续进行数据收集。用于生物标本的几种型号的低温透射电子显微镜经过优化，可以自动收集高分辨率数据。通常，数据在 300 kV 或 200 kV 系统上收集。使用包括EPU（赛默飞世尔科技）28、Leginon29、JADAS30和SerialEM31，32在内的软件可以实现自动数据收集。使用现代探测器自动收集数据通常会在 24 小时内产生 TB 的原始数据（平均数据集大小约为 4 TB）。
由于世界大部分地区（撰写本文的时间为2020年12月）实施了COVID-19限制，许多显微镜设施已转向提供远程访问。一旦网格被加载到显微镜的自动加载器中，就可以远程进行数据采集。
图像处理和模型构建 如果数据收集会话通常为 0.5-4 天，则后续图像处理可能需要数周和数月，具体取决于计算资源的可用性。它是初始图像处理步骤的标准，即运动校正和对比度传递函数（CTF）估计"动态"进行33，34。对于下游处理，有大量的软件套件可用。颗粒被"拾取"并从显微照片中提取35，36。一旦颗粒被提取，标准协议将是通过几轮分类（在二维（2D）和三维（3D）和/或专注于感兴趣的特定区域）来处理颗粒，以达到均匀的颗粒子集。然后将这些均匀的粒子子集平均在一起以产生3D重建。此时，通常会进一步校正数据以生成最高质量的地图，例如通过CTF细化，失真校正37和贝叶斯抛光38。该图像处理的结果是感兴趣生物标本的3D冷冻EM图。在"标准"自动单颗粒实验中，从足够质量的网格中达到的分辨率范围，在300 kV显微镜系统上收集的数据通常在10 Å和2 Å之间，具体取决于蛋白质复合物的大小和灵活性。对于理想的试样，使用SPA工作流程，现在已经达到了~1.2 Å的分辨率5。虽然该协议详细介绍了获得EM密度图的步骤，但一旦掌握了这些步骤，就可以通过拟合和优化蛋白质模型（如果分辨率为<3.5 Å）或构建de novo39来进一步解释。与结构测定实验相关的数据可以存入在线公共存储库，包括EM密度图（电子显微镜数据库）40，由此产生的原子坐标（蛋白质数据库）41和原始数据集（电子显微镜公共图像档案）42。
在该协议中，来自牙 龈卟啉单胞菌的 外膜蛋白复合物RagAB（~340 kDa）被用作大分子复合物10 （EMPIAR-10543）的示例。对于那些刚接触 cryoEM 的人来说，可以通过 iNEXT Discovery 和 Instruct 等资助访问计划，通过这种管道从样品到结构来支持样品，但需经过同行评审。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

冷冻电子显微镜（cryoEM）是一种通过单颗粒分析（SPA）测定大分子复合物结构的强大技术。整个过程包括i）在冷冻EM网格上支撑的薄膜中对标本进行玻璃化;ii）筛选标本以评估颗粒分布和冰质;iii）如果网格合适，收集单个粒子数据集进行分析;和iv）图像处理以产生EM密度图。在此协议中，提供了每个步骤的概述，重点介绍了用户可以在工作流期间修改的变量以及常见问题的故障排除。随着远程显微镜操作成为许多设施的标准，将描述成像方案的变化，以帮助用户在物理访问显微镜受到限制时进行高效操作和成像。

在筛选时，可以在图集阶段丢弃网格，其中以低放大倍率解析的特征将网格标记为不适合数据采集。例如，如果网格受到重大机械损坏，大多数网格方块被破坏（图2A），或者网格看起来是"干燥的"，没有玻璃体冰（图2B）。此类网格通常可识别，因为网格正方形的边缘看起来清晰而清晰。在使用沉降冷冻装置制作的大多数网格中，观察到冰的梯度（图2C，D）。根据感兴趣的标本，颗粒分布可能会随冰层厚度而有很大差异，因此建议筛选一系列网格正方形以评估颗粒分布。在图集筛选步骤期间，EPU软件中已经实施了工具，以帮助用户识别相似或不同冰厚的网格正方形，这对于刚接触检查冷冻EM网格的用户特别有用（图2E，F）。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> 图2：放映过程中的低倍率"图谱"蒙太奇示例。A）遭受严重损坏的网格，大多数网格方块损坏 - 不适合收集。B）没有玻璃体冰的干燥网格 - 不适合收集。C）显示冰梯度的网格，其中约50%的网格可用。D） 具有~33%的网格的冰梯度可用。如果可用网格正方形具有适合收集的冰厚度，并且有足够的采集区域来满足收集的最短持续时间（例如，24 小时）E，则 C 和 D 都适合于数据收集 具有冰厚度范围的示例图集。F）与E中呈现的地图集相同，但具有由EPU软件根据冰层厚度分类和着色的网格正方形。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
在筛选颗粒分布时，请确保成像参数（如放大倍率和总电子剂量）与数据采集期间预期使用的参数相似，以便提供预期结果的准确图像。在筛选过程中，理想的颗粒分布是单分散的，可以看到一系列颗粒取向（取决于标本和颗粒形态的现有知识，这可能很难确定）（图3A）。冰应尽可能薄，同时容纳粒子的最大尺寸，如果冰太薄，当用电子束照射时会融化。这会导致显微照片过度运动，应避免显示此特性的区域（图3B）。从集体经验来看，当缓冲液中有洗涤剂时，这种效应最常被观察到。这可能导致在孔的中心产生非常薄的冰，因此颗粒可以被物理排除并被迫朝向边缘。这种效应在 图3C中观察到，但在这种情况下，它不是一个极端的例子，这些图像仍然有助于数据集。最后，冰需要是玻璃体的;排除网格（或多个网格）的任何区域，其中拍摄的大部分或全部图像显示数据采集中的结晶冰（图3D）。通常，在网格正方形的边缘观察到非玻璃体冰。读者可以参考网格玻璃化过程中可以改变的变量的详细评论16 ，以及薄膜环境中颗粒行为的描述46，47以获取更多信息。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> 图3：显示不同颗粒分布的代表性显微照片。A）采用一系列取向的单分散颗粒的"理想"分布。 B）空穴中间的冰层过薄，暴露在电子束中时变形，导致显微照片过度运动。当缓冲液中存在洗涤剂时，最常观察到这种效应 C）当孔中心冰较薄时，这在物理上将颗粒从中心排除，导致颗粒向孔边缘拥挤。在这种情况下，它不足以阻止这些图像有用，但它表明值得筛选稍微厚的区域。 D）冰不是玻璃体，不应收集看起来像本例显微照片的区域的数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
动态图像处理可以帮助发现数据采集的错误和问题，因此在可能的情况下始终建议使用。例如，显微照片中的过度运动可能表明自动加载器涡轮泵处于活动状态，或者正在破裂的网格方块上收集数据，其中冰在电子束中显着移动，表明应跳过网格方块。动态 CTF 估计可以揭示应用正焦点（而不是散焦）的情况（使用 CTF 估计程序和参数来查找这些点），并确定使用 Volta 相板48 的相移。动态图像处理管道通常包括数据的图形摘要（图4A），使用户更容易快速评估显微照片质量并决定是否需要对数据收集进行修改。
从显微照片中选择颗粒，同时避免"假阳性"，如污染或网格支撑膜，可能需要优化。然而，诸如crYOLO之类的粒子拾取器通常使用默认参数进行数据的"首次传递"（图4B），可以很好地工作，从而可以进展到2D类平均，从而更容易评估数据的质量和下游成功的可能性。对于大多数项目，约>10k粒子的2D分类应该开始显示具有二级结构细节的类。要继续进行3D，2D分类阶段通常应显示表示一系列粒子方向的类。如果揭示了首选方向，则可能需要对样品制备进行更多次迭代16 或在样品倾斜的情况下进行进一步的数据采集49。应选择所有显示二级结构细节的类以进行3D分析，同时丢弃"垃圾"颗粒（图4C）。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> 图 4：初始图像处理步骤。A） 从"动态"图像处理脚本输出。 B）使用crYOLO通用模型识别适当自动拾取的颗粒的示例显微照片（左图）比例尺（白色）为50nm。 C）2D分类的结果显示红色方块中丢弃的类，以及从中选择粒子以绿色进一步处理的类。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
一小部分粒子可用于生成初始模型（图5A）。然后，此初始模型可用作 3D 分类和细化中的起始模型。在RagAB的情况下，数据集包含三个不同的符合性，可以在3D分类过程中分离（图5B）。然后，可以独立处理对每个类做出贡献的粒子，并用于优化EM密度图，然后可以对其进行进一步的解释和模型构建。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> 图 5：生成 3D EM 密度图。A） 使用 RELION 生成的典型初始模型。 B）5类3D分类显示颗粒分离成三种不同的构象状态：开-开（绿色），开-闭（蓝色），闭合-闭合（紫色）。 C）面具创建过程。3D细化（左）的地图应以嵌合体形式可视化。然后，可以使用体积查看器来识别地图没有脱节噪声密度（中间）的最低阈值。此阈值作为 RELION 掩码创建作业中的初始二值化阈值输入。示例掩码输出以灰色显示（右）。 D） RagAB （EMD-10245） 开闭状态的高分辨率 EM 密度图，通过局部分辨率 （Å） 进行过滤和着色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

使用冷冻电镜测定大分子复合物的结构已成为某些类别的蛋白质和复合物的常规。在这里，总结了该管道（样品制备，筛选，数据采集和处理），并将读者引导到更多详细的资源和变量，这些资源和变量在更具挑战性的标本的情况下可能会被改变。

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

单颗粒冷冻电镜分析已成为结构生物学家工具箱中的常规技术，适用于各种标本，包括膜蛋白、淀粉样原纤维、核酸结合蛋白和病毒。一旦样品制备完成并将网格加载到显微镜中，就可以在许多冷冻电镜设施（如Astbury生物结构实验室和eBIC）中远程进行数据收集。成功确定结构的主要障碍通常在于样品制备和网格筛选阶段，有时需要通过该过程进行多次迭代。在这里，我们将演示远程网格筛选和单粒子数据采集。在显微镜用户界面的自动加载器选项卡中，使用箭头显示选项对话框，然后按下库存按钮。这将依次检查磁带中的每个位置，以确定是否存在墨盒。库存将按顺序在每个插槽上运行。映射所有已占用的插槽后，库存将停止。突出显示要传输到显微镜柱的网格并单击加载。一旦网格成功加载到舞台上，插槽标签将从蓝色变为黄色。要筛选网格，请打开 EPU 软件。在准备页面上，选择采集光学元件和设置，然后从下拉菜单中选择图集预设。选择适当的光束设置预设，然后按下设置将参数推送到显微镜。按下以打开柱阀并插入流感屏幕。检查光束是否可见，并且是否充分扩散和居中以覆盖探测器。如有必要，请使用操纵杆或虚拟手面板导航到网格的较薄区域，以控制 X 和 Y 中的舞台移动。抬起流感屏幕并使用 EPU 中的预览按钮拍摄图像。在 EPU 中，转到地图集页面并按新会话。选择 MRC 图像格式并输入合适的文件夹名称和位置以保存筛查会话，然后单击应用。从左侧菜单中选择筛选。勾选每个网格旁边的复选框以获取地图集蒙太奇，然后在EPU中开始放映会话。为每个检查的格网获取一个地图集，并在完成后列出可用的格网方块。每个地图集都可以通过在筛选页面上突出显示来查看。完成后，查看收集的图集，并确定适合在较高放大倍率下评估样品质量的网格。在 EPU 筛选菜单上突出显示所选网格，然后单击加载样本。从地图集筛选菜单中，选择当前加载的网格，并通过右键单击网格图像上的所需位置并在此处选择移动舞台，将舞台移动到包含填充孔的网格正方形。返回到 EPU 准备页面，然后选择网格方形预设。打开EPU自动功能页面，并使用网格方形预设运行按阶段倾斜自动真心，将样品移动到真心高度。在 EPU 准备中，拍摄新的网格正方形预览图像。请注意不同孔的灰度值，表示不同的冰厚度。使用右键单击将舞台移动到孔上，并将舞台移动到此处。选择孔或真心高度预设，然后单击预览。选择数据采集预设并设置放大倍率，以便轻松识别颗粒。将散焦偏移设置为负三到五微米。迭代步骤以重新评估整个网格中颗粒分布，方向和污染的冰厚度范围。根据显微镜的可用性，继续直接进行数据收集，或者可以从显微镜中取出网格，以便将来收集，包括在其他地点。如果筛选中无法使用地图集，请通过设置地图集设置并选择网格来获取地图集，以收集地图集。获取地图集并单击网格位置以查看输出。地图集完成后，根据项目的实验需求定义每个光束设置预设。执行图像偏移校准。通过选择 EPU 页面会话设置，然后从首选项中选择新会话或新会话来设置 EPU 会话。选择新会话后，将出现一个弹出窗口，提供使用以前设置的选项。这些设置将自动从上一个 EPU 会话加载到当前 EPU 会话。或者，从首选项中选择"新建"，然后选取具有已保存首选项的文件，以将此信息预加载到当前 EPU 中。在会话名称中填写信息丰富的内容。在类型中，选择手动。对于采集模式，如果可用且需要无像差图像偏移采集，请选择精确的孔对中或更快的采集。选择所需的映像格式，然后选择存储文件夹，EPU 将创建一个具有会话名称的目录。根据使用的栅格孔间距选择适当的栅格，然后按 Apply 键。选择初始网格方块并设置采集模板。转到正方形选择。如果所有方块均为绿色，请单击左上角的"全部取消选择"。通过右键单击并选择"打开磁贴"来打开磁贴。添加或选择网格正方形，方法是单击"选择"，然后右键单击并选择"将舞台移动到网格正方形"。转至孔选择，然后按自动右心键。等到拍摄出网格正方形图像。如果自动功能失败，这可能是因为高度明显偏离。它可以使用网格方形放大倍率的流感屏幕手动调整。要测量孔的大小，请移动并调整黄色圆圈，使它们以正确的大小和间距覆盖孔。按查找孔。检查是否正确找到孔。如果没有，请更改孔的大小，然后再次按"查找孔"。如果此过程始终失败，请考虑在网格方形放大倍率下移动到较小的数字或更亮的光斑大小。使用右侧的过滤器冰质量直方图来调整孔的选择。这可用于排除厚冰和薄冰的区域。对于在会议期间选择的未来网格方块，将记住这一点。使用顶部选择菜单中的工具优化孔选择。例如，单击"移除靠近栅格栏的孔"。转到模板定义，然后按"获取"。单击"查找"和"居中孔"。将阶段移位后的延迟和图像移位后的延迟时间更改为一到五秒，然后，如果可用，请根据需要检查最大图像移位值。单击添加采集区域，然后单击图像上的任意位置。将采集区域移动到所需位置。在右上角添加散焦范围。膜蛋白项目的典型散焦列表是负0.8到负三微米散焦，然后添加其他采集区域，使它们的采集区域不会与光束一起双重暴露。单击添加自动对焦区域，然后单击图像上的任意位置。将自动对焦区域移动到孔周围的碳纤维上。标准做法是在使用AFIS或每5至15微米对中后自动对焦，具体取决于整个正方形的Z高度变化。单击添加漂移测量区域。每个网格方块执行一次漂移测量，设定阈值为每秒0.05纳米作为标准设置。漂移测量区域可以直接与自动对焦区域重叠。确保漂移和自动对焦区域均不与采集区域重叠。返回到正方形选择，然后在网格上选择要采集的正方形。使用采集区域的数量和预期的数据采集速率来预测需要多少个采集区域。选择所有所需的方块后，按"准备所有方块"。收集每个正方形后，在网格正方形之间导航并使用选择画笔微调孔。移动到试样上方的载物台位置，并使用自动功能设置真心高度。使用显微镜软件执行显微镜对准，如前所述和文本中所述。在重新插入物镜光圈并将其居中并使用EPU校正物镜散光之前，在自动功能中执行无昏迷对齐。确保两种对齐方式都收敛于合适的值。在开始自动采集运行之前，请确保关闭自动装载机涡轮泵，并在需要时插入物镜孔径。在自动采集中，按"开始运行"以开始自动数据采集。使用该协议，可以在图集阶段筛选和丢弃损坏或干燥的网格。在大多数网格上观察到冰的梯度。在筛选过程中，理想的颗粒分布是单分散的，可以看到一系列颗粒取向。如果冰太薄，当用电子束照射时会融化，导致显微照片中的过度运动。当缓冲液中有洗涤剂时，最常观察到这种情况。冰必须是玻璃体的，因此排除了网格中大多数图像显示结晶冰的区域。包括数据的图形摘要，以评估显微照片质量并决定是否需要对数据收集进行修改。诸如crYOLO之类的粒子拾取器对于数据的首次传递效果足够好，从而可以进展到2D类平均。应选择显示二级结构细节的类进行 3D 分析，而应丢弃垃圾颗粒。粒子子集可用于生成用于 3D 分类和细化的初始模型。在RagAB的情况下，数据集包含三个不同的符合性，可以在3D分类过程中分离。重要的是要记住，数据采集和后续图像分析步骤的成功取决于在筛选阶段获得和识别优化良好的网格。获得3D EM密度图后，可以通过拟合和细化蛋白质模型或从头开始构建原子模型来进一步解释它。Cryo-EM单颗粒分析能够对许多目标进行结构化测定，这在以前是不可能的。值得注意的是，这些工作流程最近已被用于解决COVID-19相关大分子的结构。

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