Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af iNEXT-Discovery (Grant 871037), der blev finansieret af Horizon 2020-programmet fra Europa-Kommissionen. J B. R. White er finansieret af Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). FEI Titan Krios mikroskoper blev finansieret af University of Leeds (UoL ABSL award) og Wellcome Trust (108466 / Z / 15 / Z). Vi takker M Iadanza for brugen af hans mikrograf analyse script. Vi anerkender Diamond Light Source for adgang til og støtte af cryo-EM faciliteter på Storbritanniens nationale Electron Bio-imaging Center (eBIC) finansieret af Wellcome Trust, MRC og BBRSC.

Der rapporteres ingen interessekonflikter.

I denne protokol har vi beskrevet en grundlæggende rørledning, der gælder for prøver, der kan bruges til rutinemæssige SBO'er. Mens dette filter papir blotting metode til tynd film dannelse og vitrification er utvivlsomt en succes i betragtning af dens anvendelse i langt de fleste SPA-projekter til dato, det kommer med en række ulemper. Disse omfatter prøvespild, de langsomme tidsskalaer (sekunder), der kræves for at danne den tynde film og fryse prøven, rapporterede uudholdelighed27 og rapporterede negative virkninger af at bruge filterpapir til at fjerne overskydende væske50. For nylig er der udviklet nye teknologier for at forbedre reproducerbarheden af tyndfilmsproduktion51,52. Der er udviklet andre teknologier, som reducerer tiden mellem prøveudbringning og vitrificering53,54,55. Mens filter papir-baserede metoder til tynd film dannelse fortsat mest allestedsnærværende metode til SPA cryoEM prøve forberedelse i skrivende stund, kan disse nye teknologier bringe en række fordele med hensyn til effektivitet og reproducerbarhed af nettet vitrification, samt skabe nye muligheder for at bringe i yderligere eksperimentelle dimensioner, såsom tidsopløsning og hurtig blanding forud for vitrification.
Processen med netscreening for de fleste brugere er i øjeblikket en kvalitativ proces, der indebærer erhvervelse af lave forstørrelsesatlaser efterfulgt af at tage billeder med høj forstørrelse på tværs af nettet for at vurdere partikelfordelingen. Selv om dette er en tilstrækkelig robust tilgang til nogle typer af prøve, kan det være svært at vurdere med øjet, hvis prøven er faktisk, hvad forskeren håber at billede eller har en foretrukken orientering, for eksempel med små (<200 kDa) prøver, eller hvor lav opløsning morfologi gør det svært at identificere ved øjet, hvis en række partikelfordelinger er til stede. For nogle projekter er det umuligt at afgøre, om prøven er som ønsket, f.eks. når en ligand er bundet, eller hvor prøven screenes for at vurdere, om en lille (f.eks. 10 kDa) underenhed stadig er til stede i forbindelse med et kompleks. For disse projekter vil fuldautomatiske pipelines til dataanalyse kombineret med en "kort" 0,5 - 1-h samlinger, der kan fortsætte gennem billedbehandling trin til 2D-klassificering eller endda 3D-klassificering og raffinement hjælpe effektivt med at afgøre, om en længere samling er berettiget. Disse rørledninger er stadig under udvikling og er ikke almindeligt implementeret i øjeblikket, men de har potentiale til at forbedre effektiviteten af cryoEM-netscreening, især for udfordrende prøver.
Forbedringer i direkte elektrondetektorer samt ændringer i mikroskopi kombineret med fremskridt inden for billedbehandling såsom indsamling af billedskiftdata har øget gennemløbet og kvaliteten af billeder, der produceres under dataindsamling. Denne stigning i antallet af data, der indsamles, understreger behovet for en grundig screening af kryoEM-net forud for mange TB data, der indsamles.
CryoEM SPA er blevet en virkelig mainstream strukturel biologi teknik, og i mange tilfælde 'gå til' tilgang for nogle klasser af prøver, såsom heterogene og labile makromolekylær komplekser. Mens protokollen her beskriver en grundlæggende oversigt over SPA-rørledningen, er hvert afsnit, der er dækket her (gittervitrificering og screening, cryoEM og billedbehandling) et emne i sig selv og værd at udforske under udviklingen af et SPA-projekt. Efterhånden som prøveforberedelses- og mikroskopiteknologier skrider frem, og nye algoritmer og tilgange til billedbehandling kommer online, vil SPA fortsætte med at udvikle sig som en pipeline, der hjælper forskere med at få indsigt i komplekse biologiske systemer.

Enkelt partikel CryoEM For at undersøge livet på molekylært niveau må vi forstå struktur. Mange teknikker til sondeproteinstruktur er tilgængelige, såsom NMR, røntgenkrystallografi, massespektrometri og elektronmikroskopi (EM). Til dato er de fleste strukturer deponeret til Protein Databank (FBF) blevet løst ved hjælp af røntgenkrystallografi. Men fra ~ 2012 og fremefter blev kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) en mainstream-teknik til bestemmelse af proteinstruktur, og brugen af den steg dramatisk. Det samlede antal EM-kort, der blev deponeret i Electron Microscopy Databank (EMDB) (pr. december 2020), var 13.421 sammenlignet med 1.566 i 2012 (figur 1, www.ebi.co.uk). I 2012 var antallet af atomkoordinater modelleret i kryoEM-tæthedskort, deponeret til FBF, kun 67, men fra december 2020 er der indtil videre deponeret 2.309 strukturer, en 35-dobling. Denne underliggende vækst i kvaliteten og kvantiteten af de producerede kryoEM-tæthedskort, undertiden benævnt »resolutionsrevolutionen«1, skyldtes en sammenkrødning af fremskridt på flere områder: udvikling af nye kameraer til billedbehandling, såkaldte direkte elektrondetektorer; ny software; og mere stabile mikroskoper2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Figur 1: Kumulative indsendelser til EMDB fra 2012 til december 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Enkelt partikelanalyse (SPA) er et kraftfuldt værktøj til at generere biologisk indsigt i en lang række prøvetyper ved at belyse strukturer med høj opløsning af isolerede komplekser5,6, herunder vira7,8, membranproteiner9,10, spiralformede samlinger11 og andre dynamiske og heterogene makromolekskulære komplekser12,13, hvis størrelser varierer efter størrelsesordener (fra 39 kDa 14,15 til snesevis af megadaltons). Her beskrives en protokol for en standardrørledning til cryoEM SPA fra prøve til struktur.
Inden denne rørledning påbegyndes, bør en renset prøve underkastes biokemisk analyse for at vurdere dens chancer for downstream-succes. Forberedelse af en egnet prøve er uden tvivl den største hindring for SBO, især for forbigående og heterogene (både kompositoriske og kropslige) komplekser. Det makromolekylære komplekse præparat skal indeholde så få forurenende stoffer som muligt, i tilstrækkelig koncentration til at give mange partikler i hver kryoEM-mikrograf og i en buffersammensætning, der er velegnet til kryoEM-analyse. Visse bufferkomponenter, herunder saccharose, glycerol og høje (~> 350 mM saltkoncentrationer, afhængigt af prøvestørrelse, egenskaber og andre bufferkomponenter), kan forstyrre vitrificeringsprocessen eller reducere signal-til-støj-forholdet i billeder, hvilket hindrer strukturbestemmelse16.
Typisk, som et minimum, størrelse udelukkelse kromatografi (SEC) og SDS-PAGE gel analyse bør anvendes til at vurdere prøve renhed17,18, men cirkulær dichroisme, funktionelle assays, SEC kombineret med multi-vinkel lys spredning, og termisk stabilitet assays er alle nyttige værktøjer til kvalitativ analyse af makromolektære komplekse præparater forud for kryoEM analyse. Resultaterne fra disse biokemiske analyser giver dog kun ringe indsigt i prøvens strukturelle heterogenitet og dens adfærd på et kryoemgitter. Af denne grund bruges negativ plet EM rutinemæssigt som et hurtigt, billigt og kraftfuldt værktøj til vurdering af kompositorisk og kropslig heterogenitet, og derfor er en god måde at fastslå, hvilken elutionsfraktion fra en rensning der er mest lovende, eller screening af forskellige buffersammensætninger19,20. Når en lovende prøve er blevet identificeret, kan vi gå videre til SPA cryoEM rørledningen. Negativ plet er ikke altid i overensstemmelse med de efterfølgende resultater, der ses i cryoEM; nogle gange ser en prøve dårlig ud af negativ plet, men forbedres, når den ses i glasagtig is i kryoEM. I modsætning hertil ser nogle gange prøver fremragende ud under negative plettrin, men kræver betydelig yderligere optimering, når de udvikler sig til cryoEM. Men i de fleste tilfælde giver negativ plet et nyttigt kvalitetskontroltrin.
Forglasning Det barske miljø i elektronmikroskopets vakuumsystem forårsager både dehydrering og strålingsskader på faste biologiske prøver21. For at afbilde prøven i en oprindelig tilstand skal den biologiske prøve derfor bevares før billeddannelse. For rensede præparater af makromolekylære komplekser er vitrificering den foretrukne metode til at muliggøre dens visualisering ved cryoEM, samtidig med at kompleksets atomdetaljer bevares. Opdagelsen af vitrifikation som en metode til prøvepræparat var et grundlæggende fremskridt inden for elektronmikroskopi af biologiske prøver, for hvilken Dubochet blev anerkendt i Nobelprisen i kemi i 2017. Prøve vitrifikation indebærer at skabe et tyndt lag af opløsning, der indeholder prøven af interesse, typisk snesevis af nm tyk, suspenderet på en cryoEM gitter støtte. Den tynde film fryses derefter ekstremt hurtigt i en cryogen som flydende ethan ved ~ -175 °C. Frysehastigheden er ~ 106 ° C / s, hurtig nok til, at amorf eller glasøs is dannes, suspendere prøven i en tynd, solid film22.
Den oprindelige variabel til at overveje, er cryoEM gitter støtte valgt23. Et EM-gitter består typisk af en amorf carbonfilm med perforeringer (enten almindelige eller uregelmæssige) over en støttestruktur. Støttestrukturen er typisk et cirkulært metalgitter med en diameter på 3,05 mm, normalt fremstillet af kobber, men andre metaller som guld eller molybdæn (som har foretrukket termiske ekspansionsegenskaber24) kan anvendes. Nogle gange påføres en ekstra tynd, kontinuerlig støtte på tværs af gitteret, såsom grafen, grafenoxid eller et tyndt (~ 1-2 nm) amorf kulstoflag. Mens standard kryoEM gitre (oftest 400-200 mesh kobber med en perforeret (1,2 μm runde huller adskilt af 1,3 μm (r1.2/1.3), eller 2 μm adskilt af 2 μm kulstof (r2/2)) kulstof støtte- selv om mange forskellige mønstre er tilgængelige) er blevet anvendt i langt de fleste strukturer rapporteret til dato, nettet nye teknologier med forbedret ledningsevne og reduceret prøvebevægelse er blevet rapporteret25 . Udvalgte gitre udsættes for en glow-udledning/plasmarensningsbehandling for at gøre dem hydrofile og modtagelige for prøveudbringning26.
Efter glød-udledning, den næste fase er tynd film dannelse. Denne tynde film er mest almindeligt dannet ved hjælp af filterpapir til at fjerne overskydende væske fra nettet. Mens dette kan udføres manuelt, en række springet frysning enheder er kommercielt tilgængelige, herunder Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) og CP3 (Gatan). Med disse enheder påføres ~3-5 μL prøve i opløsning på EM-gitteret, efterfulgt af blotting væk overskydende opløsning ved hjælp af filterpapir. Gitteret, med en tynd film suspenderet på tværs af det, er derefter kastet i flydende ethan afkølet af flydende nitrogen (LN2) til ~ -175 °C. Når nettet er frosset, holdes det ved en temperatur under devitrifikationspunktet (-137 °C) før og under billeddannelse.
Prøvescreening og dataindsamling Efter vitrificering af et kryoEM-gitter er næste fase at screene nettet for at vurdere dets kvalitet og afgøre, om nettet er egnet til at fortsætte med dataindsamling i høj opløsning. Et ideelt kryoEM gitter har glasagtig is (i modsætning til krystallinsk is) med istykkelsen lige tilstrækkelig til at rumme den længste dimension af prøven, hvilket sikrer, at den omgivende is bidrager med så lidt støj til det resulterende billede som muligt. Partiklerne i isen skal have en størrelse og (hvis kendt) form i overensstemmelse med biokemi, og ideelt set være monodisperse med en tilfældig fordeling af partikel orienteringer. Endelig bør nettet have tilstrækkeligt mange områder af tilstrækkelig kvalitet til at opfylde den ønskede dataindsamlingslængde. Afhængigt af prøven kan dette tage mange gentagelser af vitrifikation og screening, indtil der produceres optimale gitre. Både heldigvis og desværre er der et stort udvalg af variabler, der kan empirisk testes for at ændre partikelfordelingen på kryoEM-gitre (gennemgået i16,27). I dette manuskript vises repræsentative resultater for et membranproteinprojekt10.
Når et passende gitter er blevet identificeret, kan dataindsamlingen fortsætte. Flere modeller af kryo-transmission elektronmikroskoper til biologiske prøver er optimeret til at indsamle data med høj opløsning på en automatiseret måde. Typisk indsamles data på 300 kV- eller 200 kV-systemer. Automatiseret dataindsamling kan opnås ved hjælp af software, herunder EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 og SerialEM31,32. En automatiseret dataindsamling med moderne detektorer resulterer typisk i terabyte (TB) af rå data i en 24 timers periode (gennemsnitlige datasæt er ~ 4 TB i størrelse).
På grund af covid-19-restriktionerne i store dele af verden (skrivetid december 2020) er mange mikroskopifaciliteter flyttet til at tilbyde fjernadgang. Når gitrene er blevet indlæst i autoloaderen af et mikroskop, kan dataindsamling udføres eksternt.
Billedbehandling og modelbygning Hvis en dataindsamlingssession typisk kan være 0,5-4 dage, kan efterfølgende billedbehandling tage mange uger og måneder, afhængigt af tilgængeligheden af computerressourcer. Det er standard for indledende billedbehandling trin, nemlig bevægelse korrektion og kontrast overførsel funktion (CTF) skøn til at finde sted 'on the fly' 33,34. Til downstream-behandling er der en overflod af softwarepakker til rådighed. Partikler 'plukkes' og udvindes af mikrografer35,36. Når partikler er ekstraheret, en standard protokol ville være at behandle partiklerne gennem flere runder af klassificering (i begge to dimensioner (2D) og tre dimensioner (3D) og / eller fokuseret på specifikke regioner af interesse) for at nå en homogen delmængde af partikler. Denne homogene delmængde af partikler er derefter gennemsnit sammen for at producere en 3D-rekonstruktion. På dette tidspunkt korrigeres data ofte yderligere for at producere det højest mulige kvalitetskort, for eksempel gennem CTF-raffinement, distortionkorrektioner37 og bayesisk polering38 . Resultatet af denne billedbehandling er et 3D cryoEM-kort over den biologiske prøve af interesse. Opløsningsområdet, der nås i et 'standard' automatiseret enkeltpartikeleksperiment fra et gitter af tilstrækkelig kvalitet, med data indsamlet på et 300 kV mikroskopsystem er typisk mellem 10 Å og 2 Å afhængigt af proteinkompleksets størrelse og fleksibilitet. Med en ideel prøve er opløsninger på ~ 1,2 Å nu nået ved hjælp af SPA-arbejdsgange5. Mens denne protokol detaljer skridt i retning af at opnå en EM tæthed kort, når dette er i hånden det kan fortolkes yderligere ved montering og raffinering af en protein model (hvis opløsningen er < 3,5 Å) eller building de novo39. Data i forbindelse med strukturbestemmelseseksperimenter kan deponeres i online offentlige depoter, herunder EM-tæthedskort (Electron Microscopy Data Bank)40, deraf følgende atomkoordinater (Protein Data Bank)41 og rå datasæt (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
I denne protokol bruges det ydre membranproteinkompleks RagAB (~340 kDa) fra Porphyromonas gingivalis som et eksempel på makromolekylær kompleks10 (EMPIAR-10543). For de nye til cryoEM, støtte til prøver gennem denne rørledning fra prøve til struktur er tilgængelig, med forbehold for peer review, gennem finansierede adgangsordninger såsom iNEXT Discovery og Instruct.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

Kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) er en kraftfuld teknik til strukturbestemmelse af makromolekylære komplekser via enkelt partikelanalyse (SPA). Den samlede proces indebærer i) vitrifying prøven i en tynd film understøttes på en cryoEM gitter; ii) screening af prøven for at vurdere partikelfordelingen og iskvaliteten iii) hvis nettet er egnet, indsamling af et enkelt partikeldatasæt til analyse og iv) billedbehandling for at give et EM-tæthedskort. I denne protokol findes der en oversigt over hvert af disse trin med fokus på de variabler, som en bruger kan ændre under arbejdsprocessen, og fejlfinding af almindelige problemer. Med fjernmikroskopdrift, der bliver standard i mange faciliteter, vil variationer på billeddiagnostiske protokoller for at hjælpe brugerne med effektiv drift og billeddannelse, når den fysiske adgang til mikroskopet er begrænset, blive beskrevet.

Ved screening kan gitre kasseres i atlasstadiet, hvor funktioner, der er løst ved lav forstørrelse, markerer nettet som ikke egnet til dataindsamling. Hvis et gitter f.eks. har været udsat for betydelige mekaniske skader, hvor størstedelen af gitterkvartalerne er brudt (figur 2A), eller hvor nettet ser ud til at være »tørt«, uden glasis (figur 2B). Sådanne gitre kan typisk identificeres, da kanterne af gitterkvarterne fremstår skarpe og tydelige. På tværs af de fleste gitre, der er lavet ved hjælp af frysningsanordningen, observeres en gradient af is (Figur 2C, D). Partikelfordeling, afhængigt af prøven af interesse, kan variere dramatisk med istykkelse og så screening en række gitter firkanter til at vurdere partikelfordeling anbefales. Værktøjer er blevet implementeret inden for EPU-software under atlasscreeningstrinnet for at hjælpe brugeren med at identificere gitter firkanter med lignende eller forskellig istykkelse, hvilket kan være særligt nyttigt for brugere, der er nye til at undersøge kryoEM-gitre (Figur 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Figur 2: Eksempel på lave forstørrelses -atlas-montager fra screeningssessioner. A) Et gitter, der har lidt betydelig skade med de fleste gitter firkanter brudt - uegnet til indsamling. B) Et tørt gitter uden glasagtig is - uegnet til opsamling. C) Et gitter, der viser en isgradient med ~ 50% af nettet brugbart. D) En isgradient med ~ 33% af nettet brugbart. Både C og D er velegnede til dataindsamling, hvis de brugbare gitter firkanter har en istykkelse, der passer til indsamling, og der er nok erhvervelsesområder til at opfylde den mindste varighed af en samling (f.eks. 24 timer) E) Et eksempel atlas med vifte af istykkelser. F) Det samme atlas præsenteret i E, men med gitter firkanter kategoriseret og farvet af EPU software i henhold til is tykkelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Ved screening af partikelfordeling skal det sikres, at billeddiagnostiske parametre, såsom forstørrelse og total elektrondosis, svarer til dem, der forventes anvendt under dataindsamlingen, for at give et nøjagtigt billede af de forventede resultater. Under screening er en ideel partikelfordeling monodisperse med en række partikelretninger synlige (afhængigt af prøven og den eksisterende viden om partiklens morfologi kan dette være udfordrende at fastslå) (Figur 3A). Isen skal være så tynd som muligt, samtidig med at partiklernes største dimension imødekommes, hvis isen er for tynd, kan den smelte, når den lyser med elektronstrålen. Dette medfører overdreven bevægelse i mikrografen, og områder, der viser denne egenskab, bør undgås (figur 3B). Fra kollektiv erfaring observeres denne effekt oftest, når der er vaskemiddel i bufferen. Dette kan resultere i meget tynd is i midten af hullet, og så partikler kan fysisk udelukkes og tvinges mod kanten. Denne effekt observeres i figur 3C, men i dette tilfælde er det ikke et ekstremt eksempel, og disse billeder vil stadig med fordel bidrage til et datasæt. Endelig skal isen være glasagtig; udelukke områder af nettet (eller gitre), hvor størstedelen af eller alle de billeder, der er taget, viser krystallinsk is (Figur 3D) fra dataindsamling. Ofte observeres ikke-glasagtig is i kanten af gitter firkanter. Læserne henvises til detaljerede gennemgange af de variabler, der kan ændres under gitter vitrifikation16 og beskrivelser af partikeladfærd i den tynde film miljø46,47 for yderligere information.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Figur 3: Repræsentative mikrografer, der viser forskellige partikelfordelinger. A) En 'ideel' fordeling af monodisperse partikler vedtage en række orienteringer. B) Alt for tynd is i midten af hullet, at det deformerer ved eksponering for elektronstrålen forårsager overdreven bevægelse i mikrografen. Denne effekt observeres oftest, når vaskemiddel er til stede i bufferen C) Hvor is er tyndere i midten af hullet, udelukker dette fysisk partikler fra midten, hvilket forårsager fortrængning af partikler mod hulkanten. I dette tilfælde er det ikke ekstremt nok til at forhindre, at disse billeder er nyttige, men det tyder på, at det er værd at screene lidt tykkere områder. D) Is er ikke glasagtig, bør data ikke indsamles på områder, der ligner dette eksempel mikrograf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
On-the-fly billedbehandling kan bidrage til at afhente fejl og problemer med dataindsamling og så anbefales altid, hvor det er muligt. For eksempel kan overdreven bevægelse i mikrografer indikere, at autoloader turbopumpen er aktiv, eller data indsamles på en revnet gitterplads, hvor isen bevæger sig betydeligt i elektronstrålen, hvilket indikerer, at gitterpladsen skal springes over. På flue CTF skøn kan afsløre omstændigheder, hvor et positivt fokuspunkt (snarere end defokuseret) anvendes (hvor CTF skøn programmer og parametre for at finde disse punkter anvendes), og bestemme fase skift, hvor en Volta fase plade48 anvendes. På fluebilledbehandlingsrørledningerne indeholder de ofte en grafisk oversigt over dataene (Figur 4A) for at gøre det lettere for brugerne hurtigt at vurdere mikrografkvaliteten og beslutte, om der er behov for ændringer af dataindsamlingen.
Valg af partikler fra mikrografer, samtidig med at man undgår "falske positiver", såsom forurening eller netstøttefilmen, kan kræve optimering. Partikelplukkere som crYOLO fungerer imidlertid ofte tilstrækkeligt godt ved hjælp af standardparametre for et "first pass" af dataene (Figur 4B), hvilket gør det muligt at gå videre til 2D-klassen i gennemsnit, hvor det kan være lettere at vurdere dataenes kvalitet og sandsynligheden for downstream-succes. For de fleste projekter, bør 2D klassificering af ~ > 10k partikler begynde at afsløre klasser, der har sekundær struktur detaljer. For at gå videre til 3D bør 2D-klassificeringsfasen typisk afsløre klasser, der repræsenterer en række partikelretninger. Hvis der afsløres en foretrukken orientering, kan det være nødvendigt at flere gentagelser af prøveforberedelse16 eller yderligere dataindsamling med den prøve, der vippes,49. Alle klasser, der viser sekundære strukturdetaljer, bør vælges til at gå videre til 3D-analyse, mens "junk"-partikler kasseres (Figur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Figur 4: Indledende trin til billedbehandling. A) Output fra et 'on the fly' billedbehandlingsscript. B) Eksempel mikrograf (venstre) med passende auto-plukket partikler identificeret ved hjælp af crYOLO generelle model (højre, med partikler afgrænset af røde firkanter) Skala barer (hvid) er 50 nm. C) Resultater fra 2D-klassificering, der viser klasser, der blev kasseret i det røde felt, og klasser, hvorfra partikler blev udvalgt til videre behandling i grønt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
En lille delmængde af partikler kan bruges til at generere en indledende model (Figur 5A). Denne oprindelige model kan derefter bruges som en startmodel i 3D-klassificering og raffinement. For RagAB's vedkommende indeholdt datasættet tre forskellige konforme, som kan adskilles under 3D-klassificering (figur 5B). Partikler, der bidrager til hver af disse klasser, kan derefter behandles uafhængigt og bruges til at forfine et EM-tæthedskort, som derefter kan underkastes yderligere fortolkning og modelopbygning.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Figur 5: Generering af 3D EM-tæthedskort. A) Typisk startmodel genereret ved hjælp af RELION. B) 3D-klassificering over 5 klasser, der viser adskillelse af partikler i tre forskellige kropsbygningstilstande: åben (grøn), åben (blå), lukket (lilla). C) Proces med maske skabelse. Kortet fra 3D raffinement (venstre) skal visualiseres i kimær. Volumenfremviseren kan derefter bruges til at identificere den laveste tærskel, hvor kortet er fri for usammenhængende, støjende tæthed (midten). Denne tærskelværdi er input som den første placeringstærskel i oprettelsesjobbet for RELION Mask. Et eksempel maske output er vist i grå (højre). D) EM-tæthedskort med høj opløsning over ragAB's åbne lukkede tilstand (EMD-10245), filtreret og farvet efter lokal opløsning (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Strukturbestemmelse af makromolekylære komplekser ved hjælp af kryoEM er blevet rutine for visse klasser af proteiner og komplekser. Her opsummeres denne pipeline (prøveforberedelse, screening, dataindsamling og -behandling), og læserne er rettet mod yderligere detaljerede ressourcer og variabler, der kan ændres i tilfælde af mere udfordrende prøver.

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Enkelt-partikel cryo-EM analyse er blevet en rutinemæssig teknik i den strukturelle biolog værktøjskasse gælder for en bred vifte af prøver, herunder membran proteiner, amyloid fibrils, nukleinsyre bindende proteiner og vira. Når prøveforberedelsen er afsluttet, og gitrene er læsset i mikroskopet, kan dataindsamlingen udføres eksternt i mange kryo-EM-faciliteter såsom Astbury Biostructure Laboratory og eBIC. Store hindringer for vellykket strukturbestemmelse ligger ofte i prøveforberedelses- og netscreeningsfasen med flere gentagelser, der undertiden kræves gennem denne proces.Her vil vi demonstrere fjerngitterscreening og dataindsamling af enkeltpartikler. Tabulatordialogboksen ud ved hjælp af pilen under fanen Autoindlæser i brugergrænsefladen i mikroskopet, og tryk på lagerknappen. Dette vil sekventielt kontrollere hver position i kassetten for at afgøre, om der er en patron til stede.Lageret køres fortløbende på hvert slot. Når alle besatte slots er tilknyttet, stopper lageret. Marker det gitter, der skal overføres til mikroskopkolonnen, og klik på belastning.Slotetiketten bliver fra blå til gul, når gitteret er blevet indlæst på scenen. Hvis du vil screene gitrene, skal du åbne EPU-softwaren. Vælg anskaffelsesoptik og indstillinger på forberedelsessiden, og vælg derefter atlasforudindstillingen i rullemenuen.Vælg de relevante forudindstillinger for stråleindstilling, og tryk på sættet for at skubbe parametrene til mikroskopet. Tryk for at åbne kolonneventiler, og indsæt influenzaskærmen. Kontroller, at en stråle er synlig og tilstrækkeligt spredt og centreret til at dække detektoren.Hvis det er nødvendigt, skal du navigere til et tyndere område af gitteret ved hjælp af joysticket eller virtuelle håndpaneler til at styre scenebevægelser i X og Y.Løft influenzaskærmen og tag et billede ved hjælp af eksempelknappen i EPU. I EPU skal du gå til atlassiden og trykke på ny session. Vælg MRC-billedformatet, og angiv et passende mappenavn og en passende placering til lagring af screeningssessionen, og klik derefter på Anvend.Vælg screening i menuen til venstre. Markér afkrydsningsfelterne ved siden af hvert gitter for at få en atlasmontage anskaffet, og start derefter screeningssessionen i EPU. Et atlas erhverves for hvert kontrolleret gitter, og tilgængelige gitter firkanter er opført ved afslutningen.Hvert atlas kan ses ved at fremhæve det på screeningssiden. Når du er færdig, skal du gennemgå de indsamlede atlasser og identificere de gitre, der er egnede til at vurdere stikprøvekvaliteten ved højere forstørrelser. Fremhæv det valgte gitter i EPU-screeningsmenuen, og klik på belastningseksempel.Vælg det gitter, der i øjeblikket er indlæst, i atlasscreeningsmenuen, og flyt scenen til en gitterklud, der indeholder de udfyldte huller, ved at højreklikke over den ønskede placering på gitterbilledet og vælge flyttestadiet her. Gå tilbage til EPU-forberedelsessiden, og vælg den gitterkvalge forudindstilling. Åbn siden med automatiske funktioner i EPU, og kør automatisk eucentrisk efter trin tilt med gitterkvalen forudindstillet for at flytte prøven til eucentrisk højde.Tag et nyt billede af et eksempelbillede for gitter firkantet. Bemærk de grå værdier på tværs af forskellige huller, der angiver forskellige istykkelser. Flyt scenen hen over et hul ved hjælp af højreklik, og flyt scenen hertil.Vælg hullet eller den eucentriske højdeforudindstilling, og klik derefter på eksempel. Vælg forudindstilling for dataindsamling, og angiv en forstørrelse, der gør det nemt at identificere partiklerne. Indstil defokusforskydningen til minus tre til fem mikrometer.Gentage gennem trin for at revurdere en række istykkelse til partikelfordeling, orientering og forurening på tværs af nettet. Afhængigt af mikroskop tilgængelighed, fortsætte direkte til dataindsamling eller gitre kan fjernes fra mikroskopet for fremtidig indsamling, herunder på andre steder. Saml et atlas, hvis man ikke er tilgængelig fra screening ved at oprette atlasindstillinger og vælge gitter til at erhverve atlas.Hent atlas og klik på gitterplaceringen for at se outputtet. Når atlasset er færdigt, skal du definere hver af forudindstillingerne for stråleindstilling i henhold til projektets eksperimentelle behov. Udfør kalibreringer af billedskift.Konfigurer EPU-sessionen ved at vælge EPU-sidesessionsopsætningen og derefter vælge enten ny session eller ny fra indstillinger. Når du har valgt en ny session, vises en popup, der giver mulighed for at bruge tidligere indstillinger. Indstillingerne indlæses automatisk fra forrige til den aktuelle EPU-session.Du kan også vælge ny blandt indstillinger og vælge en fil med gemte indstillinger for at forudindlæse disse oplysninger i den aktuelle EPU. Udfyld sessionsnavnet med noget informativt. Vælg manual i type.For erhvervelse tilstand, skal du vælge præcis hul centrering eller hurtigere erhvervelse, hvis aberration gratis billedskift samling er tilgængelig og ønsket. Vælg det ønskede billedformat, og vælg derefter lagermappen, hvorefter EPU opretter en mappe med sessionsnavnet. Vælg det relevante gitter i henhold til, hvilken gitterhulsafstand der bruges, og tryk på anvend.Vælg en indledende gitterplads, og angiv en anskaffelsesskabelon. Gå til firkantet markering. Hvis alle felter er grønne, skal du klikke på Fjern markeringen af alle øverst til venstre.Åbn felter ved at højreklikke og derefter vælge åbent felt. Tilføj eller vælg en gitter firkant ved at klikke på vælg, og højreklik derefter på og vælge flyt fase til gitter firkantet. Gå til hul udvælgelse og tryk auto-eucentrisk.Vent, indtil der er taget et gitterkvartbillede. Hvis funktionen automatisk mislykkes, kan det skyldes, at højden er betydeligt slukket. Det kan justeres manuelt ved hjælp af influenza skærmen på gitter firkantet forstørrelse.For at måle hulstørrelsen skal du flytte og justere de gule cirkler, så de er over hullerne med korrekt størrelse og afstand. Tryk på find huller. Kontroller, at hullerne er fundet korrekt.Hvis ikke, skal du ændre hulstørrelsen og trykke på find huller igen. Hvis denne proces konsekvent mislykkes, kan du overveje at flytte til et lavere tal eller lysere spotstørrelse ved gitterkvartal forstørrelse. Brug filteriskvalitets histogrammet til højre for at justere hulvalg.Dette kan være nyttigt at udelukke områder med tyk is og tynd is. Dette vil blive husket for fremtidige gitter firkanter valgt under sessionen. Optimer hulvalg med værktøjerne i den valgte menu øverst.Klik f.eks. på Fjern huller tæt på gitterstangen. Gå til skabelondefinition, og tryk på hent. Klik på find og centrer hullet.Skift forsinkelsen efter faseskift og forsinkelse efter billedskifttider til et til fem sekunder, og hvis det er tilgængeligt, skal du kontrollere, at den maksimale billedskiftværdi er som ønsket. Klik på tilføj anskaffelsesområde, og klik et vilkårligt sted på billedet. Flyt anskaffelsesområdet til den ønskede placering.Tilføj defokusområdet øverst til højre. En typisk defokuseringsliste for et membranproteinprojekt er negativ 0,8 til negativ tre mikrometerdefokusering, og tilføj derefter andre opkøbsområder og arrangerer dem således, at erhvervelsesområder ikke er dobbelt eksponeret med strålen. Klik på tilføj automatisk fokusområde, og klik et vilkårligt sted på billedet.Flyt autofokusområdet til kulstofet omkring et hul. Standard praksis er at auto-fokus efter centrering, når du bruger AFIS eller hver fem til 15 mikrometer afhængigt af Z højde variation på tværs af pladsen. Klik på tilføj afdriftsmålingsområde.Driftmåling udført en gang pr. gitterkvator med en fast tærskel på 0,05 nanometer pr. sekund som standardindstilling. Afdriftsmålingsområdet kan overlappe direkte med autofokusområdet. Sørg for, at hverken drift eller autofokusområde overlapper hinanden med et anskaffelsesområde.Gå tilbage til firkantet markering, og vælg de felter, der skal vælges til anskaffelse på gitteret. Brug antallet af anskaffelsesområder og den forventede dataindsamlingshastighed til at forudsige, hvor mange anskaffelsesområder der kræves. Når alle ønskede firkanter er markeret, skal du trykke på forbered alle firkanter.Når hver firkant er indsamlet, navigere mellem gitter firkanter og finjustere hullerne ved hjælp af markeringen børste. Flyt til et scenested over prøven, og brug automatiske funktioner til at indstille eucentrisk højde. Udfør mikroskopjusteringer ved hjælp af mikroskopsoftware som beskrevet tidligere og i teksten.Udfør komafri justering inden for auto-funktioner, før genindsætte og centrering af den objektive blænde og korrigere den objektive linse bygningsfejl med EPU. Sørg for, at begge justeringer konvergerer på passende værdier. Før du starter den automatiserede anskaffelseskørsel, skal du sikre dig, at turbopumpen med automatisk belastning er slukket, og at målåbningen indsættes, hvis det er nødvendigt.I automatiseret erhvervelse skal du trykke på startkørsel for at påbegynde automatiseret dataindsamling. Ved hjælp af denne protokol kan ødelagte eller tørre gitre screenes og kasseres i atlasstadiet. En gradient af is observeres på tværs af de fleste gitre.Under screeningen er en ideel partikelfordeling monodispersed med en række partikelretninger synlige. Hvis isen er for tynd, kan den smelte, når den lyser med elektronstrålen, hvilket forårsager overdreven bevægelse i mikrograf. Dette observeres oftest, når der er vaskemiddel i bufferen.Isen skal være glasagtig, så områder af nettet, hvor de fleste af billederne viser krystallinsk is blev udelukket. Grafisk sammenfatning af dataene blev medtaget for at vurdere mikrografkvaliteten og for at afgøre, om der er behov for ændringer af dataindsamlingen. Partikelplukkere som crYOLO fungerer tilstrækkeligt godt til et første gennemløb af dataene, hvilket muliggør progression til 2D-klasse gennemsnit.Klasser, der viser sekundære strukturdetaljer, bør vælges til 3D-analyse, mens junkpartikler skal kasseres. En delmængde af partikler kan bruges til at generere en indledende model for 3D-klassificering og raffinement. For RagAB's vedkommende indeholdt datasættet tre forskellige konforme, som kan adskilles under 3D-klassificering.Det er vigtigt at huske, at succes ved dataindsamlingen og efterfølgende billedanalyse trin er afhængige af at opnå og identificere veloptimerede gitre i screeningsfasen. Når et 3D EM-tæthedskort er opnået, kan det fortolkes yderligere ved at montere og forfine en proteinmodel eller opbygge en atommodel de novo. Cryo-EM enkeltpartikelanalyse muliggør struktureret bestemmelse af mange mål, der ikke var mulige tidligere.Især er disse arbejdsgange for nylig blevet brugt til at løse strukturer af COVID-19-relaterede makromolekyler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hurtig gitterforberedelse til tidstilslutt kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuel blot-og-plunge frysning af biologiske prøver til enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling af nukleosomkernepartikler kompleksbundet med DNA-reparationsfaktorer til kryo-elektronmikroskopi strukturbestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstraktion af modificerede mikrotubuli fra pattedyrceller til undersøgelse af mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse af monolagsgrafen på kryo-elektronmikroskopigitter til strukturbestemmelse med høj opløsning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...