Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
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Ce travail a été soutenu par l’iNEXT-Discovery (Grant 871037) financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne. J B. R. White est financé par le Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). Les microscopes FEI Titan Krios ont été financés par l’Université de Leeds (prix UoL ABSL) et Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Nous remercions M Iadanza pour l’utilisation de son script d’analyse micrographique. Nous remercions Diamond Light Source pour l’accès et le soutien des installations cryo-EM du Centre national de bio-imagerie électronique (eBIC) du Royaume-Uni financé par le Wellcome Trust, le MRC et le BBRSC.

Aucun conflit d’intérêts n’est signalé.

Dans ce protocole, nous avons décrit un pipeline de base applicable aux spécimens pouvant faire l’objet d’une SPA de routine. Bien que cette méthode de buvard de papier filtre de formation de couches minces et de vitrification soit sans aucun doute réussie compte tenu de son utilisation dans la grande majorité des projets SPA à ce jour, elle présente un certain nombre d’inconvénients. Il s’agit notamment du gaspillage de l’échantillon, des délais lents (secondes) nécessaires pour former le film mince et congeler l’échantillon, de l’irréproductibilité signalée27 et des effets négatifs signalés de l’utilisation de papier filtre pour éliminer l’excès de liquide50. Récemment, de nouvelles technologies ont été développées pour améliorer la reproductibilité de la production de couches minces51,52. D’autres technologies ont été développées qui réduisent le temps entre l’application de l’échantillon et la vitrification53,54,55. Alors que les méthodes à base de papier filtre pour la formation de couches minces restent la méthode la plus répandue de préparation d’échantillons SPA cryoEM au moment de la rédaction, ces nouvelles technologies peuvent apporter une gamme d’avantages en termes d’efficacité et de reproductibilité de la vitrification de grille, ainsi que créer de nouvelles opportunités pour apporter des dimensions expérimentales supplémentaires, telles que la résolution temporelle et le mélange rapide avant la vitrification.
Le processus de criblage de grille pour la plupart des utilisateurs est actuellement un processus qualitatif qui implique l’acquisition d’atlas à faible grossissement, suivie de la prise d’images à fort grossissement à travers la grille pour évaluer la distribution des particules. Bien qu’il s’agisse d’une approche suffisamment robuste pour certains types d’échantillons, il peut être difficile d’évaluer à l’œil nu si le spécimen est effectivement ce que le chercheur espère imager ou a une orientation préférée, par exemple avec de petits échantillons (<200 kDa) ou lorsque la morphologie à basse résolution rend difficile l’identification à l’œil nu si une gamme de distributions de particules est présente. Pour certains projets, il est impossible de déterminer si l’échantillon est comme souhaité, par exemple lorsqu’un ligand est lié ou lorsque l’échantillon est examiné pour évaluer si une petite sous-unité (par exemple, 10 kDa) est toujours présente en association avec un complexe. Pour ces projets, des pipelines entièrement automatisés pour l’analyse des données combinés à des collections « courtes » de 0,5 à 1 h, qui peuvent passer par des étapes de traitement d’image à la classification 2D ou même à la classification et au raffinement 3D, aideraient à déterminer efficacement si une collecte plus longue est justifiée. Ces pipelines sont encore en cours de développement et ne sont pas largement mis en œuvre à l’heure actuelle, mais ils ont le potentiel d’améliorer l’efficacité du criblage de grille cryoEM, en particulier pour les échantillons difficiles.
Les améliorations apportées aux détecteurs d’électrons directs, ainsi que les modifications apportées à la microscopie, combinées aux progrès du traitement des images, telles que la collecte de données par décalage d’image, ont augmenté le débit et la qualité des images produites lors de l’acquisition de données. Cette augmentation du taux de collecte de données souligne la nécessité d’un criblage approfondi des réseaux cryoEM avant l’acquisition de nombreux To de données.
CryoEM SPA est devenu une technique de biologie structurale vraiment courante et, dans de nombreux cas, l’approche « aller à » pour certaines classes de spécimens, tels que les complexes macromoléculaires hétérogènes et labiles. Bien que le protocole décrit ici un aperçu de base du pipeline SPA, chaque section couverte ici (vitrification et criblage en grille, cryoEM et traitement d’image) est un sujet à part entière et mérite d’être exploré lors du développement d’un projet SPA. À mesure que les technologies de préparation des échantillons et de microscopie progressent, et que de nouveaux algorithmes et approches de traitement d’images sont mis en ligne, SPA continuera de se développer en tant que pipeline, aidant les chercheurs à mieux comprendre les systèmes biologiques complexes.

CryoEM à particule unique Pour étudier la vie au niveau moléculaire, nous devons comprendre la structure. De nombreuses techniques pour sonder la structure des protéines sont disponibles, telles que la RMN, la cristallographie aux rayons X, la spectrométrie de masse et la microscopie électronique (EM). À ce jour, la majorité des structures déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB) ont été résolues à l’aide de la cristallographie aux rayons X. Cependant, à partir de ~2012, la cryo-microscopie électronique (cryoEM) est devenue une technique courante pour la détermination de la structure des protéines et son utilisation a considérablement augmenté. Le nombre total de cartes EM déposées dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB) (en décembre 2020) était de 13 421 contre 1 566 en 2012 (Figure 1, www.ebi.co.uk). En 2012, le nombre de coordonnées atomiques modélisées dans les cartes de densité cryoEM, déposées dans l’APB, n’était que de 67, mais en décembre 2020, 2 309 structures avaient été déposées jusqu’à présent, soit une multiplication par 35. Cette croissance sous-jacente de la qualité et de la quantité des cartes de densité cryoEM produites, parfois appelée « révolution de résolution »1, a été causée par une coalescence d’avancées dans de multiples domaines : le développement de nouvelles caméras pour l’imagerie connues sous le nom de détecteurs d’électrons directs ; nouveaux logiciels; et des microscopes plus stables2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Figure 1 : Soumissions cumulatives à la BDIM de 2012 à décembre 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
L’analyse de particules uniques (SPA) est un outil puissant pour générer des informations biologiques dans une grande variété de types d’échantillons en élucidant les structures à haute résolution de complexes isolés5,6, y compris les virus7,8, les protéines membranaires9,10, les assemblages hélicoïdaux11 et d’autres complexes macromoléculaires dynamiques et hétérogènes12,13, dont les tailles varient selon les ordres de grandeur (à partir de 39 kDa 14,15 à des dizaines de mégadaltons). Ici, un protocole pour un pipeline standard pour cryoEM SPA de l’échantillon à la structure est décrit.
Avant de se lancer dans ce pipeline, un échantillon purifié doit être soumis à une analyse biochimique pour évaluer ses chances de succès en aval. La préparation d’un échantillon approprié est sans doute la plus grande barrière à la SPA, en particulier pour les complexes transitoires et hétérogènes (compositionnels et conformationnels). La préparation du complexe macromoléculaire doit contenir le moins de contaminants possible, à une concentration suffisante pour produire de nombreuses particules dans chaque micrographie cryoEM, et dans une composition tampon bien adaptée à l’analyse cryoEM. Certains constituants tampons, y compris le saccharose, le glycérol et des concentrations élevées (~> 350 mM de sels, selon la taille de l’échantillon, les propriétés et d’autres constituants tampons) peuvent interférer avec le processus de vitrification ou réduire le rapport signal/bruit dans les images, entravant la détermination de la structure16.
En règle générale, au minimum, la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et l’analyse de gel SDS-PAGE doivent être utilisées pour évaluer la pureté de l’échantillon17,18, mais le dichroïsme circulaire, les essais fonctionnels, le SEC couplé à la diffusion de la lumière multi-angle et les tests de stabilité thermique sont tous des outils utiles pour l’analyse qualitative des préparations complexes macromoléculaires avant l’analyse cryoEM. Cependant, les résultats de ces analyses biochimiques peuvent donner peu d’informations sur l’hétérogénéité structurelle de l’échantillon et son comportement sur une grille cryoEM. Pour cette raison, la coloration négative EM est couramment utilisée comme un outil rapide, bon marché et puissant pour évaluer l’hétérogénéité de la composition et de la conformation, et donc un bon moyen de déterminer quelle fraction d’élution d’une purification est la plus prometteuse, ou de filtrer différentes compositions tampons19,20. Une fois qu’un échantillon prometteur a été identifié, nous pouvons passer au pipeline SPA cryoEM. La coloration négative ne correspond pas toujours aux résultats ultérieurs observés dans cryoEM; parfois, un échantillon semble pauvre par coloration négative, mais s’améliore lorsqu’il est vu dans la glace vitrée dans cryoEM. En revanche, les échantillons ont parfois l’air excellent pendant les étapes de coloration négative, mais nécessitent une optimisation supplémentaire significative lors de la progression vers cryoEM. Cependant, dans la majorité des cas, la coloration négative constitue une étape utile du contrôle de la qualité.
Vitrification L’environnement hostile dans le système de vide du microscope électronique provoque à la fois une déshydratation et des dommages causés par les radiations aux échantillons biologiques non fixés21. Par conséquent, pour imager l’échantillon dans un état semblable à celui d’un natif, le spécimen biologique doit être conservé avant l’imagerie. Pour les préparations purifiées de complexes macromoléculaires, la vitrification est la méthode de choix pour permettre sa visualisation par cryoEM tout en préservant les détails atomiques du complexe. La découverte de la vitrification comme méthode de préparation des échantillons a été une avancée fondamentale en microscopie électronique de spécimens biologiques, pour laquelle Dubochet a été reconnu dans le prix Nobel de chimie 2017. La vitrification de l’échantillon consiste à créer une fine couche de solution contenant l’échantillon d’intérêt, généralement des dizaines de nm d’épaisseur, suspendue sur un support de grille cryoEM. Le film mince est ensuite congelé extrêmement rapidement dans un cryogène tel que l’éthane liquide à ~-175 °C. Le taux de congélation est d’environ 106 °C/s, assez rapide pour que de la glace amorphe ou vitreuse se forme, suspendant l’échantillon dans un film mince et solide22.
La variable initiale à considérer est le support de réseau cryoEM choisi23. Une grille EM se compose généralement d’un film de carbone amorphe avec des perforations (régulières ou irrégulières), sur une structure de support. La structure de support est généralement une grille métallique circulaire de 3,05 mm de diamètre, généralement en cuivre, mais d’autres métaux tels que l’or ou le molybdène (qui a des propriétés de dilatation thermique préférées24) peuvent être utilisés. Parfois, un support mince et continu supplémentaire est appliqué sur la grille, tel que du graphène, de l’oxyde de graphène ou une fine couche de carbone amorphe (~ 1-2 nm). Alors que les grilles cryoEM standard (le plus souvent du cuivre à mailles 400-200 avec un support en carbone perforé (trous ronds de 1,2 μm séparés par 1,3 μm (r1,2 / 1,3), ou 2 μm séparés par 2 μm de carbone (r2/2)) - bien que de nombreux modèles différents soient disponibles) ont été utilisées dans la grande majorité des structures signalées à ce jour, de nouvelles technologies de grille avec une conductivité améliorée et un mouvement réduit des échantillons ont été signalées25 . Les grilles sélectionnées sont soumises à un traitement de nettoyage par décharge incandescente/plasma pour les rendre hydrophiles et adaptées à l’application d’échantillons26.
Après la décharge luminescente, l’étape suivante est la formation de couches minces. Ce film mince est le plus souvent formé à l’aide de papier filtre pour éliminer l’excès de liquide de la grille. Bien que cela puisse être effectué manuellement, un certain nombre de dispositifs de congélation à piston sont disponibles dans le commerce, notamment le Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), l’EM GP II (Leica) et le CP3 (Gatan). Avec ces dispositifs, environ 3 à 5 μL d’échantillon en solution sont appliqués sur la grille EM, puis effacent l’excès de solution à l’aide de papier filtre. La grille, avec une fine pellicule en suspension à travers elle, est ensuite plongée dans de l’éthane liquide refroidi par de l’azote liquide (LN2) à ~-175 °C. Une fois gelée, la grille est maintenue à une température inférieure au point de dévitrification (-137 °C) avant et pendant l’imagerie.
Sélection d’échantillons et collecte de données Après la vitrification d’une grille cryoEM, l’étape suivante consiste à examiner la grille pour évaluer sa qualité et déterminer si la grille est adaptée à la collecte de données à haute résolution. Une grille cryoEM idéale a de la glace vitrée (par opposition à la glace cristalline) avec l’épaisseur de glace juste suffisante pour accueillir la dimension la plus longue de l’échantillon, garantissant que la glace environnante contribue le moins possible à l’image résultante. Les particules à l’intérieur de la glace devraient avoir une taille et (si elles sont connues) compatibles avec la biochimie, et idéalement être monodispersées avec une distribution aléatoire des orientations des particules. Enfin, la grille devrait avoir suffisamment de zones de qualité suffisante pour satisfaire à la longueur de collecte de données souhaitée. Selon l’échantillon, cela peut prendre de nombreuses itérations de vitrification et de criblage jusqu’à ce que des grilles optimales soient produites. Heureusement et malheureusement, il existe une vaste gamme de variables qui peuvent être testées empiriquement pour modifier la distribution des particules sur les grilles cryoEM (examinées en 16,27). Dans ce manuscrit, des résultats représentatifs pour un projet de protéine membranaire10 sont présentés.
Une fois qu’une grille appropriée a été identifiée, la collecte de données peut se poursuivre. Plusieurs modèles de microscopes électroniques à cryotransmission pour échantillons biologiques sont optimisés pour collecter des données à haute résolution de manière automatisée. En règle générale, les données sont collectées sur des systèmes de 300 kV ou 200 kV. La collecte automatisée de données peut être réalisée à l’aide de logiciels tels que EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 et SerialEM31,32. Une collecte de données automatisée avec des détecteurs modernes donne généralement des téraoctets (To) de données brutes sur une période de 24 heures (la taille moyenne des ensembles de données est d’environ 4 To).
En raison des restrictions COVID-19 en place dans une grande partie du monde (au moment de la rédaction de cet article, décembre 2020), de nombreux établissements de microscopie sont passés à l’offre d’un accès à distance. Une fois que les grilles ont été chargées dans le chargeur automatique d’un microscope, l’acquisition de données peut être effectuée à distance.
Traitement d’images et construction de modèles Lorsqu’une session de collecte de données peut durer généralement de 0,5 à 4 jours, le traitement ultérieur de l’image peut prendre plusieurs semaines et mois, en fonction de la disponibilité des ressources informatiques. Il est standard pour les étapes initiales de traitement d’image, à savoir la correction de mouvement et l’estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) qui doivent avoir lieu « à la volée » 33,34. Pour le traitement en aval, il existe une pléthore de suites logicielles disponibles. Les particules sont « cueillies » et extraites de micrographies35,36. Une fois les particules extraites, un protocole standard consisterait à traiter les particules à travers plusieurs cycles de classification (en deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) et/ou en se concentrant sur des régions d’intérêt spécifiques) pour atteindre un sous-ensemble homogène de particules. Ce sous-ensemble homogène de particules est ensuite moyenné ensemble pour produire une reconstruction 3D. À ce stade, les données sont souvent corrigées davantage pour produire la carte de la plus haute qualité possible, par exemple par le raffinement CTF, les corrections de distorsion37 et le polissage bayésien38 . Le résultat de ce traitement d’image est une carte cryoEM 3D du spécimen biologique d’intérêt. La plage de résolution atteinte dans une expérience automatisée « standard » à partir d’une grille de qualité suffisante, avec des données collectées sur un système de microscope de 300 kV est généralement comprise entre 10 Å et 2 Å en fonction de la taille et de la flexibilité du complexe protéique. Avec un spécimen idéal, des résolutions d’environ 1,2 Å ont maintenant été atteintes à l’aide des workflows SPA5. Bien que ce protocole détaille les étapes vers l’obtention d’une carte de densité EM, une fois que celle-ci est en main, elle peut être interprétée plus avant en ajustant et en affinant un modèle de protéine (si la résolution est < 3,5 Å) ou en construisant de novo39. Les données associées aux expériences de détermination de la structure peuvent être déposées dans des dépôts publics en ligne, y compris des cartes de densité EM (banque de données de microscopie électronique)40, des coordonnées atomiques résultantes (banque de données sur les protéines)41 et des ensembles de données bruts (archives d’images publiques de microscopie électronique)42.
Dans ce protocole, le complexe protéique de la membrane externe RagAB (~340 kDa) de Porphyromonas gingivalis est utilisé comme exemple de complexe macromoléculaire10 (EMPIAR-10543). Pour ceux qui découvrent cryoEM, la prise en charge des échantillons via ce pipeline, de l’échantillon à la structure, est disponible, sous réserve d’un examen par les pairs, via des systèmes d’accès financés tels que iNEXT Discovery et Instruct.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

La cryo-microscopie électronique (cryoEM) est une technique puissante pour la détermination de la structure des complexes macromoléculaires, via l’analyse de particules uniques (SPA). Le processus global consiste à i) vitrifier l’échantillon dans un film mince soutenu sur une grille cryoEM; ii) le criblage de l’échantillon pour évaluer la distribution des particules et la qualité de la glace; iii) si la grille est appropriée, la collecte d’un seul ensemble de données de particules pour analyse; et iv) le traitement d’images pour obtenir une carte de densité EM. Dans ce protocole, une vue d’ensemble de chacune de ces étapes est fournie, en mettant l’accent sur les variables qu’un utilisateur peut modifier au cours du flux de travail et le dépannage des problèmes courants. Le fonctionnement du microscope à distance devenant la norme dans de nombreuses installations, des variantes des protocoles d’imagerie pour aider les utilisateurs à fonctionner efficacement et à imager lorsque l’accès physique au microscope est limité seront décrites.

Lors du criblage, les grilles peuvent être jetées au stade de l’atlas, où les caractéristiques résolues à faible grossissement marquent la grille comme ne convenant pas à l’acquisition de données. Par exemple, si une grille a subi des dommages mécaniques importants avec la majorité des carrés de grille brisés (figure 2A), ou lorsque la grille semble être « sèche », sans glace vitreuse (figure 2B). Ces grilles sont généralement identifiables car les bords des carrés de la grille semblent nets et distincts. Sur la majorité des grilles réalisées à l’aide du dispositif de congélation à plongeon, un gradient de glace est observé (Figure 2C,D). La distribution des particules, selon le spécimen d’intérêt, peut varier considérablement avec l’épaisseur de la glace et il est donc recommandé de filtrer une gamme de carrés de grille pour évaluer la distribution des particules. Des outils ont été mis en œuvre dans le logiciel EPU au cours de l’étape de criblage de l’atlas pour aider l’utilisateur à identifier les carrés de grille d’épaisseur de glace similaire ou différente, ce qui peut être particulièrement utile pour les utilisateurs qui débutent dans l’examen des grilles cryoEM (Figure 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple de montages « atlas » à faible grossissement provenant de séances de projection. A) Une grille qui a subi des dommages importants avec la majorité des carrés de grille cassés - impropre à la collecte. B) Une grille sèche sans glace vitreuse - impropre à la collecte. C) Une grille démontrant un gradient de glace avec ~ 50% de la grille utilisable. D) Un gradient de glace avec ~ 33% de la grille utilisable. C et D conviennent tous deux à la collecte de données si les carrés de grille utilisables ont une épaisseur de glace appropriée pour la collecte et s’il y a suffisamment de zones d’acquisition pour satisfaire à la durée minimale d’une collecte (par exemple, 24 h) E) Un exemple d’atlas avec une gamme d’épaisseurs de glace. F) Le même atlas présenté en E mais avec des carrés de grille catégorisés et colorés par logiciel EPU en fonction de l’épaisseur de la glace. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Lors du dépistage de la distribution des particules, assurez-vous que les paramètres d’imagerie, tels que le grossissement et la dose totale d’électrons, sont similaires à ceux qui devraient être utilisés lors de l’acquisition de données afin de fournir une image précise des résultats attendus. Au cours du criblage, une distribution idéale des particules est monodispersée avec une gamme d’orientations de particules visibles (selon le spécimen et les connaissances existantes sur la morphologie de la particule, cela peut être difficile à déterminer) (Figure 3A). La glace doit être aussi mince que possible tout en accueillant les particules de plus grande dimension, si la glace est trop mince, elle peut fondre lorsqu’elle est éclairée par le faisceau d’électrons. Cela provoque un mouvement excessif dans la micrographie, et les zones qui présentent cette caractéristique doivent être évitées (Figure 3B). D’après l’expérience collective, cet effet est le plus souvent observé lorsqu’il y a du détergent dans le tampon. Cela peut entraîner une glace très mince au centre du trou et donc des particules peuvent être physiquement exclues et forcées vers le bord. Cet effet est observé à la figure 3C, mais dans ce cas, il ne s’agit pas d’un exemple extrême et ces images contribueraient tout de même utilement à un ensemble de données. Enfin, la glace doit être vitreuse; exclure toutes les zones de la grille (ou des grilles) où la majorité ou la totalité des images prises montrent de la glace cristalline (figure 3D) de l’acquisition de données. Souvent, de la glace non vitreuse est observée au bord des carrés de grille. Les lecteurs sont invités à consulter des examens détaillés des variables qui peuvent être modifiées au cours de la vitrification de la grille16 et des descriptions du comportement des particules dans l’environnement à couche mince46,47 pour plus d’informations.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Figure 3 : Micrographies représentatives montrant différentes distributions de particules. A) Une distribution « idéale » de particules monodispersées adoptant une gamme d’orientations. B) Glace trop mince au milieu du trou qu’elle déforme lors de l’exposition au faisceau d’électrons provoquant un mouvement excessif dans la micrographie. Cet effet est le plus souvent observé lorsque du détergent est présent dans le tampon C) Lorsque la glace est plus mince au centre du trou, cela exclut physiquement les particules du centre, provoquant un encombrement des particules vers le bord du trou. Dans ce cas, il n’est pas assez extrême pour empêcher ces images d’être utiles, mais cela suggère qu’il vaut la peine de filtrer des zones légèrement plus épaisses. D) La glace n’est pas vitrée, les données ne doivent pas être collectées sur les zones qui ressemblent à cet exemple de micrographie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le traitement d’image à la volée peut aider à détecter les erreurs et les problèmes d’acquisition de données et est donc toujours recommandé dans la mesure du possible. Par exemple, un mouvement excessif dans les micrographies peut indiquer que la turbopompe du chargeur automatique est active ou que des données sont collectées sur un carré de grille fissuré où la glace se déplace de manière significative dans le faisceau d’électrons, ce qui indique que le carré de la grille doit être ignoré. À la volée, l’estimation CTF peut révéler des circonstances où un point focal positif (plutôt que de se déconcentrer) est appliqué (où des programmes d’estimation CTF et des paramètres pour trouver ces points sont utilisés), et déterminer le déphasage où une plaque de phase Volta48 est utilisée. Les pipelines de traitement d’images à la volée incluent souvent un résumé graphique des données (Figure 4A) pour permettre aux utilisateurs d’évaluer rapidement la qualité des micrographes et de décider si des modifications de collecte de données sont nécessaires.
La sélection des particules à partir de micrographies, tout en évitant les « faux positifs » tels que la contamination ou le film de support de la grille, peut nécessiter une optimisation. Cependant, les sélecteurs de particules tels que crYOLO fonctionnent souvent suffisamment bien en utilisant les paramètres par défaut pour un « premier passage » des données (Figure 4B), permettant une progression vers la moyenne des classes 2D où il peut être plus facile d’évaluer la qualité des données et la probabilité de succès en aval. Pour la plupart des projets, la classification 2D d’environ > 10k particules devrait commencer à révéler des classes qui ont des détails de structure secondaire. Pour passer à la 3D, l’étape de classification 2D doit généralement révéler des classes représentant une gamme d’orientations de particules. Si une orientation privilégiée est révélée, d’autres itérations de préparation de l’échantillon16 ou une acquisition de données supplémentaire avec l’échantillon incliné peuvent être nécessaires49. Toutes les classes qui montrent des détails de structure secondaire doivent être choisies pour passer à l’analyse 3D, tandis que les particules « indésirables » sont éliminées (Figure 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Figure 4 : Étapes initiales de traitement de l’image. A) Sortie à partir d’un script de traitement d’image « à la volée ». B) Exemple de micrographie (à gauche) avec des particules correctement choisies automatiquement identifiées à l’aide du modèle général crYOLO (à droite, avec des particules délimitées par des carrés rouges) Les barres d’échelle (blanches) sont de 50 nm. C) Résultats de la classification 2D montrant les classes qui ont été rejetées dans le carré rouge, et les classes à partir desquelles les particules ont été sélectionnées pour un traitement ultérieur en vert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Un petit sous-ensemble de particules peut être utilisé pour générer un modèle initial (Figure 5A). Ce modèle initial peut ensuite être utilisé comme modèle de départ dans la classification et le raffinement 3D. Dans le cas de RagAB, l’ensemble de données contenait trois conformateurs distincts qui peuvent être séparés lors de la classification 3D (Figure 5B). Les particules contribuant à chacune de ces classes peuvent ensuite être traitées indépendamment et utilisées pour affiner une carte de densité EM qui peut ensuite faire l’objet d’une interprétation plus poussée et de la construction de modèles.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Figure 5 : Génération d’une carte de densité EM 3D. A) Modèle initial typique généré à l’aide de RELION. B) Classification 3D sur 5 classes montrant la séparation des particules en trois états conformationnels distincts : ouvert-ouvert (vert), ouvert-fermé (bleu), fermé-fermé (violet). C) Processus de création de masques. La carte du raffinement 3D (à gauche) doit être visualisée en chimère. La visionneuse de volume peut ensuite être utilisée pour identifier le seuil le plus bas à partir duquel la carte est exempte de densité disjointe et bruyante (milieu). Cette valeur de seuil est entrée en tant que seuil de binarisation initial dans la tâche de création de masque RELION. Un exemple de sortie de masque est affiché en gris (à droite). D) Carte de densité EM haute résolution de l’état ouvert-fermé de RagAB (EMD-10245), filtrée et colorée par résolution locale (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

La détermination de la structure des complexes macromoléculaires à l’aide de cryoEM est devenue une routine pour certaines classes de protéines et de complexes. Ici, ce pipeline est résumé (préparation des échantillons, criblage, acquisition et traitement des données) et les lecteurs sont dirigés vers des ressources et des variables plus détaillées qui peuvent être modifiées dans le cas d’échantillons plus difficiles.

Cryo-microscopie électronique à particule unique : de l’échantillon à la structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

L’analyse cryo-EM à particule unique est devenue une technique de routine dans la boîte à outils du biologiste structurel applicable à un large éventail d’échantillons, y compris les protéines membranaires, les fibrilles amyloïdes, les protéines de liaison aux acides nucléiques et les virus. Une fois la préparation des échantillons terminée et les grilles chargées au microscope, la collecte de données peut être effectuée à distance dans de nombreuses installations cryo-EM telles que le laboratoire de biostructure d’Astbury et eBIC. Les principaux obstacles à la détermination réussie de la structure résident souvent dans les étapes de préparation des échantillons et de criblage de la grille, avec de multiples itérations parfois nécessaires tout au long de ce processus.Ici, nous démontrerons le criblage à distance de la grille et l’acquisition de données monoparticules. Dans l’onglet chargeur automatique de l’interface utilisateur du microscope, appuyez sur la boîte de dialogue des options à l’aide de la flèche et appuyez sur le bouton d’inventaire. Cela vérifiera séquentiellement chaque position dans la cassette pour déterminer si une cartouche est présente.L’inventaire s’exécutera sur chaque emplacement séquentiellement. Lorsque tous les emplacements occupés sont mappés, l’inventaire s’arrête. Mettez en surbrillance la grille à transférer dans la colonne du microscope et cliquez sur Charger.L’étiquette de la fente passera du bleu au jaune une fois que la grille aura été chargée avec succès sur la scène. Pour filtrer les grilles, ouvrez le logiciel EPU. Sur la page de préparation, sélectionnez optiques et paramètres d’acquisition, puis sélectionnez le préréglage de l’atlas dans le menu déroulant.Choisissez les préréglages de réglage de faisceau appropriés et appuyez sur set pour pousser les paramètres au microscope. Appuyez pour ouvrir les vannes de colonne et insérez l’écran de grippe. Vérifiez qu’un faisceau est visible et suffisamment étalé et centré pour couvrir le détecteur.Si nécessaire, accédez à une région plus mince de la grille à l’aide du joystick ou des panneaux de main virtuels pour contrôler les mouvements de la scène en X et Y.Soulevez l’écran de grippe et prenez une image à l’aide du bouton de prévisualisation de l’EPU. Dans EPU, accédez à la page de l’atlas et appuyez sur Nouvelle session. Sélectionnez le format d’image MRC et entrez un nom de dossier et un emplacement appropriés pour enregistrer la session de filtrage, puis cliquez sur Appliquer.Sélectionnez le filtrage dans le menu de gauche. Cochez les cases à côté de chaque grille pour obtenir un montage d’atlas, puis démarrez la session de projection dans EPU. Un atlas est acquis pour chaque grille vérifiée et les carrés de grille disponibles sont répertoriés à la fin.Chaque atlas peut être consulté en le mettant en évidence sur la page de projection. Une fois terminé, examinez les atlas collectés et identifiez les grilles appropriées pour évaluer la qualité de l’échantillon à des grossissements plus élevés. Mettez en surbrillance la grille choisie dans le menu de filtrage EPU et cliquez sur Exemple de charge.Dans le menu de sélection de l’atlas, sélectionnez la grille actuellement chargée et déplacez la scène vers un carré de grille contenant les trous remplis en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’emplacement souhaité sur l’image de la grille et en sélectionnant Déplacer l’étape ici. Revenez à la page de préparation de l’EPU et sélectionnez le préréglage carré de grille. Ouvrez la page des fonctions automatiques de l’EPU et exécutez l’inclinaison auto-eucentrique par étage avec le préréglage carré de la grille pour déplacer l’échantillon à la hauteur eucentrique.Dans la préparation de l’EPU, prenez une nouvelle image d’aperçu carré de grille. Notez les valeurs de gris sur différents trous indiquant différentes épaisseurs de glace. Déplacez la scène sur un trou en cliquant avec le bouton droit de la souris et déplacez la scène ici.Sélectionnez le trou ou la hauteur eucentrique prédéfinie, puis cliquez sur Aperçu. Sélectionnez le préréglage d’acquisition de données et définissez un grossissement qui permet une identification facile des particules. Réglez le décalage de mise au point sur négatif de trois à cinq micromètres.Itérez par étapes pour réévaluer une gamme d’épaisseurs de glace pour la distribution, l’orientation et la contamination des particules à travers le réseau. Selon la disponibilité du microscope, passez directement à la collecte de données ou les grilles peuvent être retirées du microscope pour une collecte future, y compris sur d’autres sites. Collectez un atlas s’il n’est pas disponible lors de la projection en configurant les paramètres de l’atlas et en sélectionnant la grille pour acquérir l’atlas.Acquérez l’atlas et cliquez sur l’emplacement de la grille pour voir la sortie. Une fois l’atlas terminé, définissez chacun des préréglages de réglage du faisceau en fonction des besoins expérimentaux du projet. Effectuez des étalonnages de décalage d’image.Configurez la session EPU en sélectionnant la configuration de la session de page EPU, puis en sélectionnant Nouvelle session ou Nouvelle dans les préférences. Après avoir sélectionné une nouvelle session, une fenêtre contextuelle apparaîtra offrant une option pour utiliser les paramètres précédents. Les paramètres se chargeront automatiquement de la session EPU précédente à la session EPU en cours.Vous pouvez également sélectionner nouveau dans les préférences et choisir un fichier avec des préférences enregistrées pour précharger ces informations dans l’EPU actuel. Remplissez le nom de la session avec quelque chose d’informatif. Dans Type, sélectionnez manuel.Pour le mode d’acquisition, sélectionnez un centrage précis des trous ou une acquisition plus rapide si la collection de décalage d’image sans aberration est disponible et souhaitée. Sélectionnez le format d’image souhaité, puis sélectionnez le dossier de stockage et EPU créera un répertoire avec le nom de la session. Sélectionnez la grille appropriée en fonction de l’espacement des trous de grille utilisé et appuyez sur Appliquer.Sélectionnez un carré de grille initial et définissez un modèle d’acquisition. Accédez à la sélection carrée. Si tous les carrés sont verts, cliquez sur Désélectionner tout en haut à gauche.Ouvrez les vignettes en cliquant avec le bouton droit de la souris, puis en sélectionnant Ouvrir la vignette. Ajoutez ou choisissez un carré de grille en cliquant sur Sélectionner, puis en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant Déplacer l’étape vers le carré de la grille. Accédez à la sélection des trous et appuyez sur auto-eucentrique.Attendez qu’une image carrée de grille soit prise. Si la fonction automatique échoue, cela peut être dû au fait que la hauteur est considérablement réduite. Il peut être ajusté manuellement à l’aide de l’écran de grippe à un grossissement carré de grille.Pour mesurer la taille des trous, déplacez et ajustez les cercles jaunes afin qu’ils soient au-dessus des trous avec une taille et un espacement corrects. Appuyez sur Trouver des trous. Vérifiez que les trous ont été trouvés correctement.Si ce n’est pas le cas, modifiez la taille du trou et appuyez à nouveau sur Rechercher des trous. Si ce processus échoue systématiquement, envisagez de passer à un nombre inférieur ou à une taille de point plus brillante au grossissement carré de la grille. Utilisez l’histogramme de qualité de la glace filtrante sur la droite pour ajuster la sélection des trous.Cela peut être utile pour exclure les zones avec de la glace épaisse et de la glace mince. On s’en souviendra pour les futurs carrés de grille sélectionnés au cours de la session. Optimisez la sélection des trous avec les outils du menu de sélection en haut.Par exemple, cliquez sur Supprimer les trous près de la barre de grille. Accédez à la définition du modèle et appuyez sur Acquérir. Cliquez sur Rechercher et centrer le trou.Modifiez le délai après le décalage de l’étape et le délai après le décalage de l’image à une à cinq secondes, puis, si disponible, vérifiez que la valeur maximale du décalage de l’image est souhaitée. Cliquez sur Ajouter une zone d’acquisition et cliquez n’importe où sur l’image. Déplacez la zone d’acquisition à l’emplacement souhaité.Ajoutez la plage de défocalisation en haut à droite. Une liste de mise au point typique pour un projet de protéine membranaire est négative de 0,8 à négative de trois micromètres de mise au point, puis ajoute d’autres zones d’acquisition, en les organisant de manière à ce que les zones d’acquisition ne soient pas doublement exposées avec le faisceau. Cliquez sur Ajouter une zone de mise au point automatique et cliquez n’importe où sur l’image.Déplacez la zone de mise au point automatique vers le carbone entourant un trou. La pratique standard consiste à faire la mise au point automatique après le centrage lors de l’utilisation d’AFIS ou tous les cinq à 15 micromètres en fonction de la variation de hauteur Z sur le carré. Cliquez sur Ajouter une zone de mesure de dérive.Mesure de dérive effectuée une fois par carré de grille avec un seuil défini de 0,05 nanomètre par seconde comme réglage standard. La zone de mesure de la dérive peut chevaucher directement la zone de mise au point automatique. Assurez-vous qu’aucune zone de dérive ou de mise au point automatique ne chevauche une zone d’acquisition.Revenez à la sélection carrée et sélectionnez les carrés à acquérir sur la grille. Utilisez le nombre de zones d’acquisition et le taux d’acquisition de données attendu pour prédire le nombre de zones d’acquisition requises. Lorsque tous les carrés souhaités sont sélectionnés, appuyez sur Préparer tous les carrés.Une fois chaque carré collecté, naviguez entre les carrés de la grille et affinez les trous à l’aide du pinceau de sélection. Déplacez-vous vers un emplacement de scène au-dessus de l’échantillon et utilisez les fonctions automatiques pour définir la hauteur eucentrique. Effectuez des alignements de microscope à l’aide d’un logiciel de microscope comme décrit précédemment et dans le texte.Effectuez un alignement sans coma dans les fonctions automatiques avant de réinsérer et de centrer l’ouverture de l’objectif et de corriger l’astigmatisme de l’objectif avec l’EPU. Assurez-vous que les deux alignements convergent vers des valeurs appropriées. Avant de commencer l’acquisition automatisée, assurez-vous que la turbopompe du chargeur automatique est éteinte et que l’ouverture de l’objectif est insérée si nécessaire.Dans l’acquisition automatisée, appuyez sur Démarrer l’exécution pour commencer l’acquisition automatisée des données. En utilisant ce protocole, les grilles cassées ou sèches peuvent être filtrées et jetées au stade de l’atlas. Un gradient de glace est observé sur la majorité des grilles.Lors du criblage, une distribution idéale des particules est monodispersée d’une gamme d’orientations de particules visibles. Si la glace est trop mince, elle peut fondre lorsqu’elle est éclairée par le faisceau d’électrons, provoquant un mouvement excessif dans la micrographie. Ceci est le plus souvent observé lorsqu’il y a du détergent dans le tampon.La glace doit être vitrée, de sorte que les zones de la grille où la majorité des images montrent de la glace cristalline ont été exclues. Un résumé graphique des données a été inclus pour évaluer la qualité des micrographies et décider si des modifications à la collecte de données sont nécessaires. Les sélecteurs de particules tels que crYOLO fonctionnent suffisamment bien pour un premier passage des données, ce qui permet une progression vers la moyenne des classes 2D.Les classes qui montrent les détails de la structure secondaire doivent être choisies pour l’analyse 3D tandis que les particules indésirables doivent être éliminées. Un sous-ensemble de particules peut être utilisé pour générer un modèle initial pour la classification et le raffinement 3D. Dans le cas de RagAB, l’ensemble de données contenait trois conformateurs distincts qui peuvent être séparés lors de la classification 3D.Il est important de se rappeler que le succès de l’acquisition des données et des étapes ultérieures d’analyse d’images dépend de l’obtention et de l’identification de grilles bien optimisées pendant la phase de criblage. Une fois qu’une carte de densité EM 3D est obtenue, elle peut être interprétée plus avant en ajustant et en affinant un modèle de protéine ou en construisant un modèle atomique de novo. L’analyse cryo-EM à particule unique permet une détermination structurée de nombreuses cibles qui n’étaient pas possibles auparavant.Notamment, ces flux de travail ont récemment été utilisés pour résoudre des structures de macromolécules liées à la COVID-19.

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