Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
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Diese Arbeit wurde durch das iNEXT-Discovery (Grant 871037) unterstützt, das durch das Horizon 2020 Programm der Europäischen Kommission finanziert wird. J B. R. White wird vom Wellcome Trust (215064/Z/18/Z) finanziert. Die FEI Titan Krios Mikroskope wurden von der University of Leeds (UoL ABSL Award) und wellcome Trust (108466/Z/15/Z) finanziert. Wir danken M Iadanza für die Verwendung seines Mikrographenanalyseskripts. Wir danken Diamond Light Source für den Zugang und die Unterstützung der Kryo-EM-Einrichtungen im nationalen britischen Electron Bio-imaging Centre (eBIC), das vom Wellcome Trust, MRC und BBRSC finanziert wird.

Es werden keine Interessenkonflikte gemeldet.

In diesem Protokoll haben wir eine grundlegende Rohrleitung beschrieben, die auf Proben anwendbar ist, die für Routine-SPA geeignet sind. Während diese Filterpapier-Blotting-Methode der Dünnschichtbildung und -verglasung aufgrund ihrer Verwendung in der überwiegenden Mehrheit der bisherigen SPA-Projekte zweifellos erfolgreich ist, bringt sie eine Reihe von Nachteilen mit sich. Dazu gehören Probenverschwendung, die langsamen Zeitskalen (Sekunden), die erforderlich sind, um den dünnen Film zu bilden und die Probe einzufrieren, berichtete Irreproduzierbarkeit27 und berichtete über negative Auswirkungen der Verwendung von Filterpapier zum Abwischen überschüssiger Flüssigkeit50. In jüngster Zeit wurden neue Technologien entwickelt, um die Reproduzierbarkeit der Dünnschichtproduktion zu verbessern51,52. Es wurden andere Technologien entwickelt, die die Zeit zwischen Probenapplikation und Vitrifikation verkürzen53,54,55. Während filterpapierbasierte Methoden zur Dünnschichtbildung zum Zeitpunkt des Schreibens die allgegenwärtigste Methode der SPA-KryoEM-Probenvorbereitung bleiben, können diese neuen Technologien eine Reihe von Vorteilen in Bezug auf die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Gitterverglasung mit sich bringen und neue Möglichkeiten schaffen, zusätzliche experimentelle Dimensionen wie Zeitauflösung und schnelles Mischen vor der Vitrifikation einzubringen.
Der Prozess des Rasterscreenings ist für die meisten Benutzer derzeit ein qualitativer Prozess, der die Erfassung von Atlanten mit niedriger Vergrößerung beinhaltet, gefolgt von der Aufnahme von Bildern mit hoher Vergrößerung über das Gitter, um die Partikelverteilung zu beurteilen. Während dies für einige Probentypen ein ausreichend robuster Ansatz ist, kann es schwierig sein, mit dem Auge zu beurteilen, ob die Probe tatsächlich das ist, was der Forscher abbilden möchte, oder eine bevorzugte Orientierung hat, zum Beispiel bei kleinen (<200 kDa) Proben oder wo die niedrig aufgelöste Morphologie es schwierig macht, mit dem Auge zu identifizieren, ob eine Reihe von Partikelverteilungen vorhanden sind. Bei einigen Projekten ist es unmöglich festzustellen, ob die Probe wie gewünscht ist, z. B. wo ein Ligand gebunden ist oder wo die Probe gescreent wird, um zu beurteilen, ob eine kleine (z. B. 10 kDa) Untereinheit in Verbindung mit einem Komplex noch vorhanden ist. Für diese Projekte würden vollautomatische Pipelines für die Datenanalyse in Kombination mit einer "kurzen" 0,5 - 1-h-Sammlung, die über Bildverarbeitungsschritte zur 2D-Klassifizierung oder sogar zur 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung führen können, helfen, effizient festzustellen, ob eine längere Sammlung gerechtfertigt ist. Diese Pipelines befinden sich noch in der Entwicklung und sind derzeit noch nicht weit verbreitet, aber sie haben das Potenzial, die Effizienz des KryoEM-Rastersiebens zu verbessern, insbesondere bei anspruchsvollen Proben.
Verbesserungen bei direkten Elektronendetektoren sowie Modifikationen in der Mikroskopie in Kombination mit Fortschritten in der Bildverarbeitung wie der Erfassung von Bildverschiebungsdaten haben den Durchsatz und die Qualität der während der Datenerfassung erzeugten Bilder erhöht. Dieser Anstieg der Rate der gesammelten Daten unterstreicht die Notwendigkeit eines gründlichen Screenings von KryoEM-Grids, bevor viele TB an Daten erfasst werden.
CryoEM SPA hat sich zu einer echten Mainstream-Strukturbiologie-Technik entwickelt und in vielen Fällen der "Go to" -Ansatz für einige Klassen von Proben, wie heterogene und labile makromolekulare Komplexe. Während das Protokoll hier einen grundlegenden Überblick über die SPA-Pipeline beschreibt, ist jeder hier behandelte Abschnitt (Gitterverglasung und -screening, KryoEM und Bildverarbeitung) ein Thema für sich und es lohnt sich, während der Entwicklung eines SPA-Projekts untersucht zu werden. Während die Probenvorbereitungs- und Mikroskopietechnologien voranschreiten und neue Bildverarbeitungsalgorithmen und -ansätze online gehen, wird sich SPA als Pipeline weiterentwickeln und Forschern helfen, Einblicke in komplexe biologische Systeme zu gewinnen.

Einzelpartikel-KryoEM Um das Leben auf molekularer Ebene zu untersuchen, müssen wir die Struktur verstehen. Viele Techniken zur Untersuchung der Proteinstruktur stehen zur Verfügung, wie NMR, Röntgenkristallographie, Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie (EM). Bisher wurde der Großteil der in der Protein Databank (PDB) deponierten Strukturen mittels Röntgenkristallographie gelöst. Ab ~ 2012 wurde die Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) jedoch zu einer Mainstream-Technik zur Bestimmung der Proteinstruktur und ihre Verwendung nahm dramatisch zu. Die Gesamtzahl der in der Electron Microscopy Databank (EMDB) hinterlegten EM-Karten (Stand Dezember 2020) betrug 13.421 gegenüber 1.566 im Jahr 2012 (Abbildung 1, www.ebi.co.uk). Im Jahr 2012 betrug die Anzahl der atomaren Koordinaten, die in KryoEM-Dichtekarten modelliert wurden, die bei der PDB hinterlegt wurden, nur 67, aber bis Dezember 2020 wurden bisher 2.309 Strukturen abgelagert, ein 35-facher Anstieg. Dieses zugrunde liegende Wachstum der Qualität und Quantität der erzeugten KryoEM-Dichtekarten, manchmal auch als "Auflösungsrevolution"1 bezeichnet, wurde durch eine Verschmelzung von Fortschritten in mehreren Bereichen verursacht: die Entwicklung neuer Kameras für die Bildgebung, die als direkte Elektronendetektoren bekannt sind; neue Software; und stabilere Mikroskope2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Abbildung 1: Kumulative Einreichungen bei der EMDB von 2012 bis Dezember 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Zahl anzuzeigen.</a>
Die Einzelpartikelanalyse (SPA) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Gewinnung biologischer Erkenntnisse in einer Vielzahl von Probentypen durch Aufklärung hochauflösender Strukturen isolierter Komplexe5,6 einschließlich Viren7,8, Membranproteine9,10, helikaler Baugruppen11 und anderer dynamischer und heterogener makromolekularer Komplexe12,13, deren Größe um Größenordnungen variiert (ab 39 kDa 14,15 bis dutzende Megadaltons). Hier wird ein Protokoll für eine Standard-Pipeline für cryoEM SPA von der Probe zur Struktur beschrieben.
Vor Beginn dieser Pipeline sollte eine gereinigte Probe einer biochemischen Analyse unterzogen werden, um ihre Erfolgschancen nachgelagert zu bewerten. Die Präparation einer geeigneten Probe ist wohl das größte Hindernis für SPA, insbesondere für transiente und heterogene (sowohl kompositorische als auch konformative) Komplexe. Das makromolekulare Komplexpräparat sollte so wenig Kontaminanten wie möglich enthalten, in ausreichender Konzentration, um viele Partikel in jeder KryoEM-Mikroaufnahme zu erhalten, und in einer Pufferzusammensetzung, die für die KryoEM-Analyse gut geeignet ist. Bestimmte Pufferbestandteile, einschließlich Saccharose, Glycerin und hohe (~ > 350 mM Konzentrationen von Salzen, abhängig von der Probengröße, den Eigenschaften und anderen Pufferbestandteilen), können den Prozess der Vitrifikation stören oder das Signal-Rausch-Verhältnis in Bildern verringern, was die Strukturbestimmung behindert16.
Typischerweise sollten zur Beurteilung der Probenreinheit mindestens die Größenausschlusschromatographie (SEC) und die SDS-PAGE-Gelanalyse verwendet werden17,18, aber zirkulärer Dichroismus, funktionelle Assays, SEC in Verbindung mit Mehrwinkel-Lichtstreuung und thermische Stabilitätsassays sind nützliche Werkzeuge für die qualitative Analyse makromolekularer komplexer Präparate vor der KryoEM-Analyse. Die Ergebnisse dieser biochemischen Analysen können jedoch wenig Aufschluss über die strukturelle Heterogenität der Probe und ihr Verhalten auf einem KryoEM-Gitter geben. Aus diesem Grund wird negative Färbungs-EM routinemäßig als schnelles, kostengünstiges und leistungsfähiges Werkzeug zur Beurteilung der Zusammensetzungs- und Konformationsheterogenität verwendet und daher eine gute Möglichkeit, festzustellen, welche Elutionsfraktion aus einer Reinigung am vielversprechendsten ist, oder um verschiedene Pufferzusammensetzungen zu screenen19,20. Sobald eine vielversprechende Probe identifiziert wurde, können wir zur SPA-KryoEM-Pipeline übergehen. Negative Färbung stimmt nicht immer mit den nachfolgenden Ergebnissen überein, die in CryoEM beobachtet wurden; Manchmal sieht eine Probe durch negative Färbung schlecht aus, verbessert sich aber, wenn sie in Glaseis in KryoEM gesehen wird. Im Gegensatz dazu sehen Proben manchmal während negativer Färbeschritte hervorragend aus, erfordern jedoch eine erhebliche weitere Optimierung, wenn sie zu CryoEM übergehen. In den meisten Fällen bietet die negative Färbung jedoch einen nützlichen Qualitätskontrollschritt.
Verglasung Die raue Umgebung innerhalb des Vakuumsystems des Elektronenmikroskops verursacht sowohl Austrocknung als auch Strahlenschäden an nicht fixierten biologischen Proben21. Um die Probe in einem nativen Zustand abzubilden, muss die biologische Probe daher vor der Bildgebung konserviert werden. Für gereinigte Zubereitungen makromolekularer Komplexe ist die Vitrifikation die Methode der Wahl, um ihre Visualisierung durch KryoEM zu ermöglichen und gleichzeitig die atomaren Details des Komplexes zu erhalten. Die Entdeckung der Vitrifikation als Methode der Probenvorbereitung war ein grundlegender Fortschritt in der Elektronenmikroskopie biologischer Proben, für den Dubochet 2017 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde. Bei der Probenverglasung wird eine dünne Lösungsschicht erzeugt, die die interessierende Probe enthält, typischerweise dutzende nm dick, die auf einem KryoEM-Gitterträger aufgehängt ist. Der dünne Film wird dann extrem schnell in einem Kryogen wie flüssigem Ethan bei ~-175 °C eingefroren. Die Gefriergeschwindigkeit beträgt ~106 °C/s, schnell genug, dass sich amorphes oder glasartiges Eis bildet, das die Probe in einem dünnen, festen Film suspendiert22.
Die erste zu berücksichtigende Variable ist die gewählte KryoEM-Grid-Unterstützung23. Ein EM-Gitter besteht typischerweise aus einem amorphen Kohlenstofffilm mit Perforationen (entweder regelmäßig oder unregelmäßig) über einer Stützstruktur. Die Tragstruktur ist typischerweise ein kreisförmiges Metallgitter mit einem Durchmesser von 3,05 mm, das normalerweise aus Kupfer besteht, aber auch andere Metalle wie Gold oder Molybdän (das bevorzugte Wärmeausdehnungseigenschaften hat24) können verwendet werden. Manchmal wird eine zusätzliche dünne, kontinuierliche Unterstützung über das Gitter aufgetragen, wie Graphen, Graphenoxid oder eine dünne (~ 1-2 nm) amorphe Kohlenstoffschicht. Während Standard-KryoEM-Gitter (am häufigsten 400-200 Mesh-Kupfer mit einer perforierten (1,2 μm runden Löcher getrennt durch 1,3 μm (r1,2/1,3) oder 2 μm getrennt durch 2 μm Kohlenstoff (r2/2)) Kohlenstoffunterstützung - obwohl viele verschiedene Muster verfügbar sind) in der überwiegenden Mehrheit der bisher berichteten Strukturen verwendet wurden, wurden neuartige Gittertechnologien mit verbesserter Leitfähigkeit und reduzierter Probenbewegung berichtet25 . Ausgewählte Gitter werden einer Glühentladungs-/Plasmareinigungsbehandlung unterzogen, um sie hydrophil und probentauglich zu machen26.
Nach der Glimmentladung ist die nächste Stufe die Dünnschichtbildung. Dieser dünne Film wird am häufigsten mit Filterpapier gebildet, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Gitter zu entfernen. Während dies manuell durchgeführt werden kann, sind eine Reihe von Tauchgefriergeräten im Handel erhältlich, darunter der Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) und CP3 (Gatan). Mit diesen Geräten werden ~ 3-5 μL Probe in Lösung auf das EM-Gitter aufgetragen, gefolgt von der Ablöschung überschüssiger Lösung mit Filterpapier. Das Gitter, über dem ein dünner Film schwebt, wird dann in flüssiges Ethan getaucht, das durch flüssigen Stickstoff (LN2) auf ~ -175 ° C gekühlt wird. Nach dem Einfrieren wird das Gitter vor und während der Bildgebung auf einer Temperatur unterhalb des Entleerungspunktes (-137 °C) gehalten.
Probenscreening und Datenerhebung Nach der Vitrifizierung eines KryoEM-Gitters besteht der nächste Schritt darin, das Gitter zu screenen, um seine Qualität zu bewerten und festzustellen, ob das Gitter für die hochauflösende Datenerfassung geeignet ist. Ein ideales KryoEM-Gitter hat Glaseis (im Gegensatz zu kristallinem Eis), wobei die Eisdicke gerade ausreicht, um die längste Dimension der Probe aufzunehmen, um sicherzustellen, dass das umgebende Eis so wenig Rauschen wie möglich zum resultierenden Bild beiträgt. Die Partikel im Eis sollten eine Größe und (falls bekannt) Form haben, die mit der Biochemie übereinstimmt, und idealerweise monodispers mit einer zufälligen Verteilung der Partikelorientierungen sein. Schließlich sollte das Raster genügend Bereiche von ausreichender Qualität aufweisen, um die gewünschte Datenerfassungslänge zu erfüllen. Abhängig von der Probe kann dies viele Iterationen der Vitrifikation und des Screenings erfordern, bis optimale Gitter erzeugt werden. Sowohl glücklich als auch unglücklicherweise gibt es eine Vielzahl von Variablen, die empirisch getestet werden können, um die Partikelverteilung auf KryoEM-Gittern zu verändern (überprüft in16,27). In diesem Manuskript werden repräsentative Ergebnisse für ein Membranproteinprojekt10 gezeigt.
Sobald ein geeignetes Raster identifiziert wurde, kann die Datenerfassung fortgesetzt werden. Mehrere Modelle von Kryo-Transmissionselektronenmikroskopen für biologische Proben sind optimiert, um hochauflösende Daten automatisiert zu sammeln. Typischerweise werden Daten auf 300-kV- oder 200-kV-Systemen gesammelt. Die automatisierte Datenerfassung kann mit Software wie EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 und SerialEM31,32 erreicht werden. Eine automatisierte Datenerfassung mit modernen Detektoren führt typischerweise zu Terabyte (TB) an Rohdaten in einem Zeitraum von 24 Stunden (durchschnittliche Datensätze sind ~ 4 TB groß).
Aufgrund der COVID-19-Beschränkungen, die in weiten Teilen der Welt gelten (Zeitpunkt des Schreibens im Dezember 2020), sind viele Mikroskopieeinrichtungen dazu übergegangen, Fernzugriff anzubieten. Sobald die Gitter in den Autoloader eines Mikroskops geladen wurden, kann die Datenerfassung aus der Ferne durchgeführt werden.
Bildverarbeitung und Modellbildung Wenn eine Datenerfassungssitzung in der Regel 0,5-4 Tage dauern kann, kann die nachfolgende Bildverarbeitung je nach Verfügbarkeit der Rechenressourcen viele Wochen und Monate dauern. Es ist Standard für anfängliche Bildverarbeitungsschritte, nämlich Bewegungskorrektur und Kontrastübertragungsfunktion (CTF) Schätzung, um "on the fly" 33,34 zu erfolgen. Für die nachgelagerte Verarbeitung stehen eine Vielzahl von Software-Suiten zur Verfügung. Partikel werden "gepflückt" und aus Mikroaufnahmen extrahiert35,36. Sobald Partikel extrahiert sind, wäre ein Standardprotokoll, die Partikel durch mehrere Runden der Klassifizierung zu verarbeiten (sowohl in zwei Dimensionen (2D) als auch in drei Dimensionen (3D) und / oder fokussiert auf bestimmte Regionen von Interesse), um eine homogene Teilmenge von Partikeln zu erreichen. Diese homogene Teilmenge der Partikel wird dann zu einer 3D-Rekonstruktion gemittelt. An dieser Stelle werden die Daten oft weiter korrigiert, um eine möglichst hochwertige Karte zu erhalten, zum Beispiel durch CTF-Verfeinerung, Verzerrungskorrekturen37 und Bayes'sches Polieren38 . Das Ergebnis dieser Bildverarbeitung ist eine 3D-KryoEM-Karte der biologischen Probe von Interesse. Der Auflösungsbereich, der in einem "standardmäßigen" automatisierten Einzelpartikelexperiment aus einem Raster von ausreichender Qualität erreicht wird, wobei die auf einem 300-kV-Mikroskopsystem gesammelten Daten typischerweise zwischen 10 Å und 2 Å liegen, abhängig von der Größe und Flexibilität des Proteinkomplexes. Mit einer idealen Probe wurden nun Auflösungen von ~1,2 Å mit SPA-Workflows erreicht5. Während dieses Protokoll Die Schritte zur Erlangung einer EM-Dichtekarte detailliert beschreibt, kann sie, sobald diese in der Hand ist, durch Anpassen und Verfeinern eines Proteinmodells (wenn die Auflösung < 3,5 Å beträgt) oder durch Erstellen von de novo39 weiter interpretiert werden. Daten im Zusammenhang mit Strukturbestimmungsexperimenten können in öffentlichen Online-Repositorien hinterlegt werden, darunter EM-Dichtekarten (Electron Microscopy Data Bank)40, resultierende Atomkoordinaten (Protein Data Bank)41 und Rohdatensätze (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
In diesem Protokoll wird der äußere Membranproteinkomplex RagAB (~340 kDa) aus Porphyromonas gingivalis als Beispiel makromolekularer Komplex10 (EMPIAR-10543) verwendet. Für diejenigen, die neu in der KryoEM sind, ist die Unterstützung für Proben durch diese Pipeline von der Probe bis zur Struktur verfügbar, vorbehaltlich einer Peer-Review durch finanzierte Zugangsprogramme wie iNEXT Discovery und Instruct.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

Die Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist eine leistungsfähige Technik zur Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels Einzelpartikelanalyse (SPA). Der Gesamtprozess beinhaltet i) die Vitrifizierung der Probe in einem dünnen Film, der auf einem KryoEM-Gitter liegt; ii) Screening der Probe zur Beurteilung der Partikelverteilung und der Eisqualität; iii) wenn das Gitter geeignet ist, das Sammeln eines einzelnen Partikeldatensatzes für die Analyse; und iv) Bildverarbeitung, um eine EM-Dichtekarte zu erhalten. In diesem Protokoll wird eine Übersicht für jeden dieser Schritte bereitgestellt, wobei der Schwerpunkt auf den Variablen liegt, die ein Benutzer während des Workflows ändern kann, und der Fehlerbehebung bei häufigen Problemen. Da der Fernbetrieb des Mikroskops in vielen Einrichtungen zum Standard wird, werden Variationen der Bildgebungsprotokolle beschrieben, um Benutzer bei einer effizienten Bedienung und Bildgebung zu unterstützen, wenn der physische Zugang zum Mikroskop eingeschränkt ist.

Beim Screening können Gitter in der Atlasstufe verworfen werden, wo Merkmale, die bei geringer Vergrößerung aufgelöst werden, das Gitter als nicht für die Datenerfassung geeignet markieren. Zum Beispiel, wenn ein Gitter einer erheblichen mechanischen Beschädigung ausgesetzt war, wobei die Mehrheit der Gitterquadrate gebrochen ist (Abbildung 2A), oder wenn das Gitter "trocken" zu sein scheint, ohne Glaseis (Abbildung 2B). Solche Gitter sind typischerweise identifizierbar, da die Kanten der Gitterquadrate scharf und deutlich erscheinen. In der Mehrzahl der Gitter, die mit der Tauchgefriervorrichtung hergestellt wurden, wird ein Eisgradient beobachtet (Abbildung 2C,D). Die Partikelverteilung kann je nach interessierender Probe mit der Eisdicke dramatisch variieren, so dass das Screening einer Reihe von Gitterquadraten zur Beurteilung der Partikelverteilung empfohlen wird. Während des Atlas-Screening-Schritts wurden Werkzeuge in der EPU-Software implementiert, um dem Benutzer zu helfen, Gitterquadrate mit ähnlicher oder unterschiedlicher Eisdicke zu identifizieren, was besonders für Benutzer nützlich sein kann, die neu in der Untersuchung von KryoEM-Gittern sind (Abbildung 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für "Atlas"-Montagen mit geringer Vergrößerung aus Screening-Sitzungen. A) Ein Gitter, das erheblichen Schaden erlitten hat, indem die Mehrheit der Gitterquadrate gebrochen ist - ungeeignet für die Sammlung. B) Ein trockenes Gitter ohne Glaseis - ungeeignet für die Sammlung. C) Ein Gitter, das einen Eisgradienten mit ~ 50% des Gitters zeigt. D) Ein Eisgradient mit ~ 33% des Gitters nutzbar. Sowohl C als auch D eignen sich für die Datenerfassung, wenn die verwendbaren Gitterquadrate eine für die Sammlung geeignete Eisdicke aufweisen und genügend Erfassungsbereiche vorhanden sind, um die Mindestdauer einer Sammlung zu erfüllen (z. B. 24 h) E) Ein Beispielatlas mit einem Bereich von Eisdicken. F) Derselbe Atlas, der in E dargestellt wird, aber mit Gitterquadraten, die von der EPU-Software nach Eisdicke kategorisiert und gefärbt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Stellen Sie beim Screening der Partikelverteilung sicher, dass bildgebende Parameter wie Vergrößerung und Gesamtelektronendosis denen ähneln, die während der Datenerfassung erwartet werden, um ein genaues Bild der erwarteten Ergebnisse zu erhalten. Während des Screenings ist eine ideale Partikelverteilung monodispers mit einer Reihe von sichtbaren Partikelorientierungen (abhängig von der Probe und den vorhandenen Kenntnissen der Morphologie des Partikels kann dies schwierig zu bestimmen sein) (Abbildung 3A). Das Eis sollte so dünn wie möglich sein und gleichzeitig die größte Dimension der Partikel aufnehmen, wenn Eis zu dünn ist, kann es schmelzen, wenn es mit dem Elektronenstrahl beleuchtet wird. Dies führt zu einer übermäßigen Bewegung in der Mikroaufnahme, und Bereiche, die diese Eigenschaft aufweisen, sollten vermieden werden (Abbildung 3B). Aus kollektiver Erfahrung wird dieser Effekt am häufigsten beobachtet, wenn sich Reinigungsmittel im Puffer befindet. Dies kann zu sehr dünnem Eis in der Mitte des Lochs führen und so können Partikel physikalisch ausgeschlossen und zum Rand gezwungen werden. Dieser Effekt ist in Abbildung 3C zu beobachten, aber in diesem Fall ist es kein extremes Beispiel und diese Bilder würden immer noch nützlich zu einem Datensatz beitragen. Schließlich muss das Eis glasig sein; Schließen Sie alle Bereiche des Gitters (oder der Gitter) aus, in denen die Mehrheit oder alle aufgenommenen Bilder kristallines Eis (Abbildung 3D) aus der Datenerfassung zeigen. Oft wird glasfreies Eis am Rand von Gitterquadraten beobachtet. Für weitere Informationen werden die Leser auf detaillierte Übersichten über die Variablen verwiesen, die während der Gitterverglasung verändert werden können16 und Beschreibungen des Partikelverhaltens in der Dünnschichtumgebung46,47.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Mikroaufnahmen mit unterschiedlichen Partikelverteilungen. A) Eine "ideale" Verteilung von monodispersen Partikeln, die eine Reihe von Orientierungen annehmen. B) Zu dünnes Eis in der Mitte des Lochs, das sich bei Einwirkung des Elektronenstrahls verformt, was zu einer übermäßigen Bewegung in der Mikroaufnahme führt. Dieser Effekt wird am häufigsten beobachtet, wenn Reinigungsmittel im Puffer vorhanden ist C) Wenn Eis in der Mitte des Lochs dünner ist, schließt dies Partikel physikalisch aus dem Zentrum aus, was zu einer Verdichtung der Partikel in Richtung Lochrand führt. In diesem Fall ist es nicht extrem genug, um zu verhindern, dass diese Bilder nützlich sind, aber es deutet darauf hin, dass es sich lohnt, etwas dickere Bereiche zu screenen. D) Eis ist nicht glasig, Daten sollten nicht über Bereiche gesammelt werden, die wie diese Beispielmikroskopaufnahme aussehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
On-the-fly-Bildverarbeitung kann helfen, Fehler und Probleme bei der Datenerfassung zu erkennen und ist daher immer zu empfehlen, wo es möglich ist. Zum Beispiel kann eine übermäßige Bewegung in Mikroaufnahmen darauf hindeuten, dass die Autoloader-Turbopumpe aktiv ist, oder daten werden auf einem rissigen Gitterquadrat gesammelt, wo sich Eis im Elektronenstrahl signifikant bewegt, was darauf hindeutet, dass das Gitterquadrat übersprungen werden sollte. Im laufenden Betrieb kann die CTF-Schätzung Umstände aufdecken, unter denen ein positiver Fokuspunkt (und nicht eine Defokussierung) angewendet wird (wo CTF-Schätzprogramme und Parameter zum Auffinden dieser Punkte verwendet werden), und die Phasenverschiebung bestimmen, bei der eine Volta-Phasenplatte48 verwendet wird. On-the-fly-Bildverarbeitungspipelines enthalten häufig eine grafische Zusammenfassung der Daten (Abbildung 4A), um es den Benutzern zu erleichtern, die Mikroaufnahmequalität schnell zu beurteilen und zu entscheiden, ob Änderungen an der Datenerfassung erforderlich sind.
Die Auswahl von Partikeln aus Mikroaufnahmen bei gleichzeitiger Vermeidung von "Fehlalarmen" wie Verunreinigungen oder der Rasterträgerfolie kann eine Optimierung erfordern. Partikelpicker wie crYOLO funktionieren jedoch oft ausreichend gut, indem sie Standardparameter für einen "ersten Durchlauf" der Daten verwenden (Abbildung 4B), was den Übergang zur 2D-Klassenmittelung ermöglicht, bei der es einfacher sein kann, die Qualität der Daten und die Wahrscheinlichkeit eines nachgelagerten Erfolgs zu beurteilen. Für die meisten Projekte sollte die 2D-Klassifizierung von ~ > 10k-Partikeln beginnen, Klassen aufzudecken, die sekundäre Strukturdetails aufweisen. Um mit 3D fortzufahren, sollte die 2D-Klassifizierungsphase in der Regel Klassen anzeigen, die eine Reihe von Partikelorientierungen darstellen. Wenn eine bevorzugte Orientierung offenbart wird, können weitere Iterationen der Probenvorbereitung16 oder eine weitere Datenerfassung mit geneigter Probe erforderlich sein49. Alle Klassen, die sekundäre Strukturdetails zeigen, sollten so gewählt werden, dass sie zur 3D-Analyse weitergeleitet werden, während "Junk"-Partikel verworfen werden (Abbildung 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Abbildung 4: Erste Bildverarbeitungsschritte. A) Ausgabe von einem "on the fly" Bildverarbeitungsskript. B) Beispiel-Mikroaufnahme (links) mit entsprechend automatisch ausgewählten Partikeln, die mit dem crYOLO-Allgemeinenmodell identifiziert wurden (rechts, mit Partikeln, die durch rote Quadrate begrenzt sind) Skalenbalken (weiß) sind 50 nm. C) Ergebnisse aus der 2D-Klassifikation, die Klassen zeigen, die im roten Quadrat verworfen wurden, und Klassen, aus denen Partikel für die weitere Verarbeitung in Grün ausgewählt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Eine kleine Teilmenge von Partikeln kann verwendet werden, um ein erstes Modell zu erstellen (Abbildung 5A). Dieses Ausgangsmodell kann dann als Ausgangsmodell in der 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung verwendet werden. Im Fall von RagAB enthielt der Datensatz drei verschiedene Konformoren, die während der 3D-Klassifizierung getrennt werden können (Abbildung 5B). Partikel, die zu jeder dieser Klassen beitragen, können dann unabhängig voneinander behandelt und verwendet werden, um eine EM-Dichtekarte zu verfeinern, die dann einer weiteren Interpretation und Modellbildung unterzogen werden kann.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Abbildung 5: Generieren einer 3D-EM-Dichtekarte. A) Typisches Ausgangsmodell, das mit RELION generiert wurde. B) 3D-Klassifikation über 5 Klassen, die die Trennung von Partikeln in drei verschiedene Konformationszustände zeigen: offen-offen (grün), offen-geschlossen (blau), geschlossen-geschlossen (violett). C) Prozess der Maskenerstellung. Die Karte aus der 3D-Verfeinerung (links) sollte in Chimären visualisiert werden. Der Volumen-Viewer kann dann verwendet werden, um den niedrigsten Schwellenwert zu identifizieren, bei dem die Karte frei von unzusammenhängender, verrauschter Dichte (Mitte) ist. Dieser Schwellenwert wird als anfänglicher Binarisierungsschwellenwert in den RELION Mask Erstellungsjob eingegeben. Eine Beispiel-Maskenausgabe ist grau dargestellt (rechts). D) Hochauflösende EM-Dichtekarte des offen-geschlossenen Zustands von RagAB (EMD-10245), gefiltert und eingefärbt nach lokaler Auflösung (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Die Einzelpartikel-Kryo-EM-Analyse ist zu einer Routinetechnik im Werkzeugkasten des Strukturbiologen geworden, die auf eine Vielzahl von Proben anwendbar ist, darunter Membranproteine, Amyloidfibrillen, Nukleinsäure-bindende Proteine und Viren. Sobald die Probenvorbereitung abgeschlossen und die Gitter in das Mikroskop geladen sind, kann die Datenerfassung in vielen Kryo-EM-Einrichtungen wie dem Astbury Biostructure Laboratory und eBIC aus der Ferne durchgeführt werden. Große Hindernisse für eine erfolgreiche Strukturbestimmung liegen oft in den Phasen der Probenvorbereitung und des Rasterscreenings, wobei manchmal mehrere Iterationen durch diesen Prozess erforderlich sind.Hier demonstrieren wir Remote Grid Screening und Einzelpartikeldatenerfassung. Öffnen Sie auf der Registerkarte Auto-Loader der Benutzeroberfläche des Mikroskops das Optionsdialogfeld mit dem Pfeil und drücken Sie die Inventartaste. Dadurch wird jede Position in der Kassette nacheinander überprüft, um festzustellen, ob eine Patrone vorhanden ist.Das Inventar wird auf jedem Slot nacheinander ausgeführt. Wenn alle belegten Slots zugeordnet sind, stoppt das Inventar. Markieren Sie das Raster, das in die Mikroskopspalte übertragen werden soll, und klicken Sie auf Last.Das Slot-Label wird von blau nach gelb, sobald das Gitter erfolgreich auf die Bühne geladen wurde. Um die Raster zu überprüfen, öffnen Sie die EPU-Software. Wählen Sie auf der Vorbereitungsseite die Erfassungsoptik und -einstellungen aus und wählen Sie dann die Atlasvorgabe aus dem Dropdown-Menü aus.Wählen Sie die entsprechenden Strahleinstellungsvoreinstellungen und drücken Sie set, um die Parameter an das Mikroskop zu übertragen. Drücken Sie, um die Säulenventile zu öffnen und das Grippesieb einzusetzen. Überprüfen Sie, ob ein Strahl sichtbar und ausreichend verteilt und zentriert ist, um den Detektor abzudecken.Navigieren Sie bei Bedarf mit dem Joystick oder virtuellen Handpanels zu einem dünneren Bereich des Rasters, um die Bühnenbewegungen in X und Y zu steuern.Heben Sie den Grippebildschirm an und nehmen Sie ein Bild mit der Vorschautaste in EPU auf. Gehen Sie in EPU zur Atlasseite und drücken Sie neue Sitzung. Wählen Sie das MRC-Bildformat aus, geben Sie einen geeigneten Ordnernamen und Speicherort für die Screening-Sitzung ein, und klicken Sie dann auf Übernehmen.Wählen Sie Screening aus dem Menü auf der linken Seite. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen neben jedem Raster, um eine Atlasmontage zu erhalten, und starten Sie dann die Screening-Sitzung in EPU. Für jedes geprüfte Gitter wird ein Atlas erstellt und die verfügbaren Gitterquadrate werden nach Fertigstellung aufgelistet.Jeder Atlas kann angezeigt werden, indem er auf der Screening-Seite hervorgehoben wird. Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie die gesammelten Atlanten und identifizieren Sie die Gitter, die für die Beurteilung der Probenqualität bei höheren Vergrößerungen geeignet sind. Markieren Sie das ausgewählte Raster im Menü EPU-Screening, und klicken Sie auf Beispiel laden.Wählen Sie im Atlas-Screening-Menü das derzeit geladene Raster aus und verschieben Sie die Bühne in ein Gitterquadrat, das die gefüllten Löcher enthält, indem Sie mit der rechten Maustaste über die gewünschte Position im Rasterbild klicken und hier Stufe verschieben auswählen. Kehren Sie zur EPU-Vorbereitungsseite zurück und wählen Sie die Voreinstellung für das Rasterquadrat aus. Öffnen Sie die EPU-Autofunktionsseite und führen Sie auto-euzentrisch durch Stufenneigung mit der Voreinstellung des Rasterquadrats aus, um das Sample auf euzentrische Höhe zu verschieben.Nehmen Sie in der EPU-Vorbereitung ein neues Rasterquadrat-Vorschaubild auf. Beachten Sie die Grauwerte in verschiedenen Löchern, die unterschiedliche Eisdicken anzeigen. Bewegen Sie die Bühne mit der rechten Maustaste über ein Loch und verschieben Sie die Stufe hier.Wählen Sie die Loch- oder euzentrische Höhenvorgabe aus, und klicken Sie dann auf Vorschau. Wählen Sie die Voreinstellung für die Datenerfassung und stellen Sie eine Vergrößerung ein, die eine einfache Identifizierung der Partikel ermöglicht. Stellen Sie den Defokussierungsversatz auf negativ drei bis fünf Mikrometer ein.Durchlaufen Sie Schritte, um einen Bereich der Eisdicke für die Partikelverteilung, -orientierung und -kontamination im gesamten Gitter neu zu bewerten. Abhängig von der Verfügbarkeit des Mikroskops fahren Sie direkt mit der Datenerfassung fort oder Gitter können für die zukünftige Sammlung auch an anderen Standorten aus dem Mikroskop entfernt werden. Sammeln Sie einen Atlas, wenn einer nicht verfügbar ist, indem Sie Atlaseinstellungen einrichten und das Raster auswählen, um atlas zu erfassen.Erfassen Sie den Atlas und klicken Sie auf den Netzstandort, um die Ausgabe zu sehen. Sobald der Atlas fertig ist, definieren Sie jede der Voreinstellungen für die Strahleinstellung entsprechend den experimentellen Anforderungen des Projekts. Führen Sie Bildverschiebungskalibrierungen durch.Richten Sie die EPU-Sitzung ein, indem Sie die EPU-Seite Sitzung einrichten und dann entweder neue Sitzung oder neu aus den Einstellungen auswählen. Nachdem Sie neue Sitzung ausgewählt haben, erscheint ein Popup-Fenster mit der Option, vorherige Einstellungen zu verwenden. Die Einstellungen werden automatisch von der vorherigen zur aktuellen EPU-Sitzung geladen.Alternativ können Sie "Neu" aus den Voreinstellungen auswählen und eine Datei mit gespeicherten Voreinstellungen auswählen, um diese Informationen vorab in die aktuelle EPU zu laden. Füllen Sie den Sitzungsnamen mit etwas Informativem aus. Wählen Sie unter Typ die Option Manuell aus.Wählen Sie für den Erfassungsmodus eine genaue Lochzentrierung oder eine schnellere Erfassung, wenn eine aberrationsfreie Bildverschiebungssammlung verfügbar und gewünscht ist. Wählen Sie das gewünschte Bildformat, dann den Speicherordner und EPU erstellt ein Verzeichnis mit dem Sitzungsnamen. Wählen Sie das entsprechende Raster aus, je nachdem, welcher Rasterlochabstand verwendet wird, und klicken Sie auf Übernehmen.Wählen Sie ein anfängliches Rasterquadrat aus und legen Sie eine Erfassungsvorlage fest. Gehen Sie zur Quadratischen Auswahl. Wenn alle Quadrate grün sind, klicken Sie oben links auf Auswahl aufheben.Öffnen Sie Kacheln, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und dann Kachel öffnen auswählen. Fügen Sie ein Rasterquadrat hinzu oder wählen Sie es aus, indem Sie auf Auswählen klicken, dann mit der rechten Maustaste klicken und Bühne in Rasterquadrat verschieben auswählen. Gehen Sie zur Lochauswahl und drücken Sie auto-euzentrisch.Warten Sie, bis ein Rasterquadratbild aufgenommen wurde. Wenn die Autofunktion fehlschlägt, kann dies daran liegen, dass die Höhe erheblich abweicht. Es kann manuell mit dem Grippeschutz bei Gitterquadratvergrößerung eingestellt werden.Um die Lochgröße zu messen, bewegen und passen Sie die gelben Kreise so an, dass sie sich mit der richtigen Größe und dem richtigen Abstand über den Löchern befinden. Drücken Sie auf Löcher finden. Überprüfen Sie, ob die Löcher korrekt gefunden wurden.Wenn nicht, ändern Sie die Lochgröße und drücken Sie erneut auf Löcher suchen. Wenn dieser Prozess konsequent fehlschlägt, sollten Sie in Betracht ziehen, bei Gitterquadratvergrößerung zu einer niedrigeren Zahl oder einer helleren Spotgröße zu wechseln. Verwenden Sie das Filter-Eisqualitätshistogramm auf der rechten Seite, um die Lochauswahl anzupassen.Dies kann nützlich sein, um Bereiche mit dickem Eis und dünnem Eis auszuschließen. Dies wird für zukünftige Gitterquadrate, die während der Sitzung ausgewählt werden, gespeichert. Optimieren Sie die Bohrungsauswahl mit den Werkzeugen im Auswahlmenü oben.Klicken Sie beispielsweise auf Bohrungen in der Nähe der Rasterleiste entfernen. Gehen Sie zur Vorlagendefinition und drücken Sie auf Erwerben. Klicken Sie auf Bohrloch suchen und zentrieren.Ändern Sie die Verzögerung nach der Stufenverschiebung und die Verzögerung nach der Bildverschiebung auf ein bis fünf Sekunden, und überprüfen Sie dann, falls verfügbar, den maximalen Bildverschiebungswert wie gewünscht. Klicken Sie auf Erfassungsbereich hinzufügen und klicken Sie auf eine beliebige Stelle auf das Bild. Verschieben Sie den Erfassungsbereich an den gewünschten Speicherort.Fügen Sie den Defokusbereich oben rechts hinzu. Eine typische Defokussierungsliste für ein Membranproteinprojekt ist eine negative Defokussierung von 0,8 bis negativen drei Mikrometern, dann fügen Sie andere Erfassungsbereiche hinzu und ordnen Sie sie so an, dass Bereiche der Erfassung nicht doppelt mit dem Strahl belichtet werden. Klicken Sie auf Autofokusbereich hinzufügen und klicken Sie auf eine beliebige Stelle im Bild.Verschieben Sie den Autofokusbereich auf das Carbon, das ein Loch umgibt. Standardpraxis ist der Autofokus nach der Zentrierung bei Verwendung von AFIS oder alle fünf bis 15 Mikrometer, abhängig von der Z-Höhenvariation über das Quadrat. Klicken Sie auf Driftmessbereich hinzufügen.Die Driftmessung wird einmal pro Gitterquadrat mit einem festgelegten Schwellenwert von 0,05 Nanometern pro Sekunde als Standardeinstellung durchgeführt. Der Driftmessbereich kann sich direkt mit dem Autofokusbereich überlappen. Stellen Sie sicher, dass sich weder der Drift- noch der Autofokusbereich mit einem Erfassungsbereich überlappen.Gehen Sie zurück zur Quadratauswahl und wählen Sie die Quadrate für die Erfassung im Raster aus. Verwenden Sie die Anzahl der Erfassungsbereiche und die erwartete Datenerfassungsrate, um vorherzusagen, wie viele Erfassungsbereiche erforderlich sind. Wenn alle gewünschten Quadrate ausgewählt sind, drücken Sie alle Quadrate vorbereiten.Sobald jedes Quadrat gesammelt ist, navigieren Sie zwischen den Gitterquadraten und verfeinern Sie die Löcher mit dem Auswahlpinsel. Bewegen Sie sich zu einer Bühnenposition über der Probe und verwenden Sie auto-Funktionen, um die euzentrische Höhe einzustellen. Führen Sie Mikroskopausrichtungen mit Mikroskopsoftware durch, wie zuvor und im Text beschrieben.Führen Sie eine komafreie Ausrichtung innerhalb der Autofunktionen durch, bevor Sie die Objektivblende wieder einsetzen und zentrieren und den Objektivastigmatismus mit EPU korrigieren. Stellen Sie sicher, dass beide Ausrichtungen zu geeigneten Werten konvergieren. Bevor Sie mit dem automatischen Erfassungslauf beginnen, stellen Sie sicher, dass die Turbopumpe des automatischen Laders ausgeschaltet ist und die Objektivöffnung bei Bedarf eingesetzt ist.Bei der automatisierten Erfassung drücken Sie den Startlauf, um mit der automatisierten Datenerfassung zu beginnen. Mit diesem Protokoll können gebrochene oder trockene Gitter im Atlasstadium gescreent und verworfen werden. Ein Gradient von Eis wird über die meisten Gitter beobachtet.Während des Screenings wird eine ideale Partikelverteilung monodispersiert, wobei eine Reihe von Partikelorientierungen sichtbar sind. Wenn Eis zu dünn ist, kann es schmelzen, wenn es mit dem Elektronenstrahl beleuchtet wird, was zu einer übermäßigen Bewegung in der Mikroaufnahme führt. Dies wird am häufigsten beobachtet, wenn sich Reinigungsmittel im Puffer befindet.Das Eis muss glasig sein, so dass Bereiche des Gitters, in denen die Mehrheit der Bilder kristallines Eis zeigt, ausgeschlossen wurden. Eine grafische Zusammenfassung der Daten wurde aufgenommen, um die Qualität der Mikroaufnahme zu bewerten und zu entscheiden, ob Änderungen an der Datenerhebung erforderlich sind. Partikelpicker wie crYOLO funktionieren ausreichend gut für einen ersten Durchlauf der Daten und ermöglichen den Übergang zur 2D-Klassenmittelung.Klassen, die sekundäre Strukturdetails zeigen, sollten für die 3D-Analyse ausgewählt werden, während Junk-Partikel verworfen werden sollten. Eine Teilmenge von Partikeln kann verwendet werden, um ein erstes Modell für die 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung zu generieren. Im Fall von RagAB enthielt der Datensatz drei verschiedene Konformere, die bei der 3D-Klassifizierung getrennt werden können.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Erfolg bei der Datenerfassung und den nachfolgenden Bildanalyseschritten davon abhängt, dass während der Screening-Phase gut optimierte Gitter erhalten und identifiziert werden. Sobald eine 3D-EM-Dichtekarte erhalten ist, kann sie durch Anpassen und Verfeinern eines Proteinmodells oder Erstellen eines Atommodells de novo weiter interpretiert werden. Die Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse ermöglicht eine strukturierte Bestimmung vieler Targets, die bisher nicht möglich waren.Insbesondere wurden diese Workflows kürzlich verwendet, um Strukturen von COVID-19-bedingten Makromolekülen zu lösen.

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SCIENTISTS IN ACTION

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

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Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...