Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery (מענק 871037) במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית. J. B. R. White ממומן על ידי קרן Wellcome (215064/ Z / 18 /Z). המיקרוסקופים של FEI Titan Krios מומנו על ידי אוניברסיטת לידס (פרס ABSL UoL) וקרן Wellcome (108466/Z/15/Z). אנו מודים לאם איאדנזה על השימוש בתסריט ניתוח המיקרוגרף שלו. אנו מכירים במקור אור יהלום לגישה ותמיכה במתקני cryo-EM במרכז הלאומי להדמיה ביולוגית אלקטרונים (eBIC) בבריטניה הממומן על ידי קרן Wellcome, MRC ו- BBRSC.

לא מדווחים על ניגודי עניינים.

בפרוטוקול זה תיארנו צינור בסיסי החל על דגימות המקובלות על ספא שגרתי. בעוד ששיטת כתמי נייר מסנן זו של היווצרות סרט דק ו- vitrification היא ללא ספק מוצלחת בהתחשב בשימוש ברוב המכריע של פרויקטי ספא עד כה, היא מגיעה עם מספר חסרונות. אלה כוללים בזבוז מדגם, צירי הזמן האיטיים (שניות) הנדרשים כדי ליצור את הסרט הדק ולהקפיא את הדגימה, דיווח על חוסר תפוקה27 ודיווח על השפעות שליליות של שימוש בנייר מסנן כדי למחוק עודף נוזל50. לאחרונה פותחו טכנולוגיות חדשות לשיפור יכולת הרבייה של הפקת סרטים דקים51,52. טכנולוגיות אחרות פותחו אשר לקצר את הזמן בין יישום מדגם ו vitrification53,54,55. בעוד ששיטות מבוססות נייר סינון להיווצרות סרט דק נשארות השיטה הנפוצה ביותר להכנת מדגם SPA CryoEM בזמן הכתיבה, טכנולוגיות חדשות אלה עשויות להביא מגוון יתרונות מבחינת יעילות ושחזור של vitrification רשת, כמו גם יצירת הזדמנויות חדשות להביא ממדים ניסיוניים נוספים, כגון רזולוציית זמן וערבוב מהיר לפני vitrification.
תהליך סינון הרשת עבור רוב המשתמשים הוא כיום תהליך איכותי הכולל רכישת אטלסים הגדלה נמוכה ואחריו צילום תמונות הגדלה גבוהה על פני הרשת כדי להעריך את התפלגות החלקיקים. אמנם זוהי גישה חזקה מספיק עבור סוגים מסוימים של דגימה, זה יכול להיות קשה להעריך על ידי העין אם הדגימה היא אכן מה החוקר מקווה לדמיין או יש אוריינטציה מועדפת, למשל עם דגימות קטנות (<200 kDa) או שבו מורפולוגיה ברזולוציה נמוכה מקשה לזהות על ידי העין אם מגוון של התפלגות חלקיקים קיימים. עבור פרויקטים מסוימים, לא ניתן לקבוע אם הדגימה היא כרצונה, לדוגמה, כאשר ליגנד מאוגד או היכן המדגם נבדק כדי להעריך אם ארון משנה קטן (לדוגמה, 10 kDa) עדיין קיים בשיתוף עם קומפלקס. עבור פרוייקטים אלה, צינורות אוטומטיים לחלוטין לניתוח נתונים בשילוב עם אוספים 'קצרים' של 0.5 - 1 שעות, שיכולים להמשיך בשלבי עיבוד תמונה לסיווג 2D או אפילו סיווג ושיפור תלת-ממדי יסייעו לקבוע ביעילות אם יש צורך באיסוף ארוך יותר. צינורות אלה עדיין נמצאים בפיתוח ואינם מיושמים באופן נרחב כיום, אך יש להם פוטנציאל לשפר את היעילות של הקרנת רשת CryoEM, במיוחד עבור דגימות מאתגרות.
שיפורים בגלאי אלקטרונים ישירים, כמו גם שינויים במיקרוסקופיה בשילוב עם התקדמות בעיבוד תמונה כגון איסוף נתוני העברת תמונה, הגבירו את התפוקה והאיכות של תמונות שהופקו במהלך רכישת נתונים. עלייה זו בשיעור איסוף הנתונים מדגישה את הצורך בסינון יסודי של רשתות cryoEM לפני ש-TB רבים של נתונים נרכשים.
CryoEM SPA הפך לטכניקה ביולוגית מבנית מיינסטרים באמת, ובמקרים רבים הגישה 'ללכת אל' עבור סוגים מסוימים של דגימות, כגון קומפלקסים מקרומולקולריים הטרוגניים ושפתיים. בעוד הפרוטוקול כאן מתאר סקירה בסיסית של צינור הספא, כל סעיף מכוסה כאן (vitrification רשת וסינון, cryoEM ועיבוד תמונה) הוא נושא בפני עצמו וראוי לחקירה במהלך פיתוח פרויקט SPA. ככל שמתקדמות טכנולוגיות הכנת הדגימה והמיקרוסקופיה, ואלגוריתמים וגישות חדשות לעיבוד תמונה עולים לרשת, SPA תמשיך להתפתח כצינור, ותסייע לחוקרים להשיג תובנות על מערכות ביולוגיות מורכבות.

קריום חלקיק יחיד כדי לחקור את החיים ברמה המולקולרית עלינו להבין את המבנה. טכניקות רבות לבדיקת מבנה החלבון זמינות, כגון NMR, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ספקטרומטריית מסה ומיקרוסקופיית אלקטרונים (EM). עד כה, רוב המבנים שהופקדו במאגר נתוני החלבון (PDB) נפתרו באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עם זאת, משנת 2012 ואילך, מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryoEM) הפכה לטכניקה מיינסטרים לקביעת מבנה החלבון והשימוש בה גדל באופן דרמטי. המספר הכולל של מפות EM שהופקדו במאגר הנתונים אלקטרון מיקרוסקופיה (EMDB) (נכון לדצמבר 2020) היה 13,421 לעומת 1,566 בשנת 2012 (איור 1, www.ebi.co.uk). בשנת 2012 מספר הקואורדינטות האטומיות שעוצבו במפות צפיפות cryoEM, שהופקדו ל- PDB היה רק 67 אך נכון לדצמבר 2020 הופקדו עד כה 2,309 מבנים, גידול של פי 35. צמיחה זו באיכות ובכמות מפות צפיפות cryoEM המיוצרות, המכונות לעתים "מהפכת הרזולוציה"1, נגרמה על ידי התמזגות של התקדמות בתחומים מרובים: פיתוח מצלמות חדשות להדמיה המכונות גלאי אלקטרונים ישירים; תוכנה חדשה; ומיקרוסקופים יציבים יותר2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> איור 1: הגשות מצטברות ל- EMDB מ- 2012 עד דצמבר 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
ניתוח חלקיקים יחיד (SPA) הוא כלי רב עוצמה ליצירת תובנה ביולוגית במגוון רחב של סוגי מדגמים על ידי ביסוס מבנים ברזולוציה גבוהה של מתחמים מבודדים5,6 כולל וירוסים7,8, חלבונים ממברנה9,10, מכלולים סלילים11 ומתחמים מאקרומולקולריים דינמיים והטרוגניים אחרים12,13, שגודלם משתנה לפי סדרי גודל (מ- 39 kDa 14,15 עד עשרות מגדונים). כאן, פרוטוקול עבור צינור סטנדרטי עבור spa cryoEM מדגם למבנה מתואר.
לפני ההחלמה על צינור זה, מדגם מטוהר צריך להיות נתון לניתוח ביוכימי כדי להעריך את סיכוייה להצלחה במורד הזרם. הכנת מדגם מתאים היא ללא ספק המחסום הגדול ביותר לספא, במיוחד עבור מתחמים ארעיים והטרוגניים (קומפוזיציה וקונפורמיים כאחד). ההכנה המורכבת המקרומולקולרית צריכה להכיל כמה שפחות מזהמים, בריכוז מספיק כדי להניב חלקיקים רבים בכל מיקרוגרף cryoEM, ובהרכב חיץ מתאים היטב לניתוח cryoEM. מרכיבי חיץ מסוימים, כולל סוכרוז, גליצול וגבוה (~ > 350 mM ריכוזים של מלחים, בהתאם לגודל המדגם, תכונות ומרכיבי חוצץ אחרים) יכול להפריע לתהליך של vitrification או להפחית את יחס אות לרעש בתמונות, לעכב את קביעת המבנה16.
בדרך כלל, ככרומטוגרפיה מינימלית של אי-הכללת גודל (SEC) וניתוח ג'ל SDS- PAGE יש להשתמש כדי להעריך טוהר מדגם17,18, אך דיכרויזם מעגלי, בדיקות תפקודיות, SEC בשילוב עם פיזור אור רב-זוויתי, ובוחות יציבות תרמית הם כלים שימושיים לניתוח איכותי של הכנות מורכבות מקרומולקולריות לפני ניתוח cryoEM. עם זאת, התוצאות של ניתוחים ביוכימיים אלה עשויות להניב תובנה מועטה על ההטרוגניות המבנית של המדגם והתנהגותה ברשת cryoEM. מסיבה זו, כתם שלילי EM משמש באופן שגרתי ככלי מהיר, זול ורב עוצמה להערכת הטרוגניות קומפוזיציה וקונפורמציה, ולכן דרך טובה לברר איזה שבר חמקן מטיהור הוא המבטיח ביותר, או הקרנת קומפוזיציות חיץ שונות19,20. ברגע שזוהתה דגימה מבטיחה, נוכל להמשיך לצינור ההקפאה של הספא. כתם שלילי לא תמיד ליישר עם התוצאות הבאות לראות cryoEM; לפעמים מדגם נראה עני על ידי כתם שלילי אבל משתפר כאשר נראה בקרח הזגוגות cryoEM. לעומת זאת, לפעמים דגימות נראות מצוינות במהלך שלבי כתם שליליים אך דורשות מיטוב משמעותי נוסף כאשר מתקדמים ל- cryoEM. עם זאת, ברוב המקרים כתם שלילי מספק שלב בקרת איכות שימושי.
ויטריפיקציה הסביבה הקשה בתוך מערכת הוואקום של מיקרוסקופ האלקטרונים גורמת הן להתייבשות והן לנזק לקרינה לדגימות ביולוגיות שלא פתורות21. לכן, כדי לדמיין את המדגם במצב דמוי יליד, הדגימה הביולוגית חייבת להישמר לפני ההדמיה. עבור הכנות מטוהרות של מתחמים מקרומולקולריים, vitrification היא שיטת הבחירה כדי לאפשר הדמיה שלה על ידי cryoEM תוך שמירה על הפרטים האטומיים של המתחם. גילוי ה-vitrification כשיטה להכנת מדגם היה התקדמות בסיסית במיקרוסקופיה אלקטרונית של דגימות ביולוגיות, אשר דובוצ'ה הוכר בפרס נובל לכימיה לשנת 2017. vitrification לדוגמה כרוך ביצירת שכבה דקה של פתרון המכיל את הדגימה של עניין, בדרך כלל עשרות ננומטר עובי, מושעה על תמיכה ברשת cryoEM. הסרט הדק קפוא במהירות רבה בקריוגן כגון אתאן נוזלי ב ~ -175 °C (70 °F). קצב ההקפאה הוא ~ 106 °C/s, מהיר מספיק כדי אמורפי, או קרח זוועתי צורות, השעיית הדגימה בסרט דק, מוצק22.
המשתנה ההתחלתי שיש לקחת בחשבון הוא התמיכה ברשת cryoEM שנבחרה23. רשת EM מורכבת בדרך כלל מסרט פחמן אמורפי עם ניקובים (רגילים או לא סדירים), על מבנה תמיכה. מבנה התמיכה הוא בדרך כלל רשת מתכת עגולה בקוטר 3.05 מ"מ, בדרך כלל עשוי נחושת, אבל מתכות אחרות כגון זהב, או מוליבדן (אשר העדיף תכונות התפשטות תרמית24) ניתן להשתמש. לעיתים, תמיכה דקה ורציפה נוספת מוחלת על פני הרשת, כגון גרפן, תחמוצת גרפן או שכבת פחמן אמורפית דקה (~1-2 ננומטר). בעוד רשתות cryoEM סטנדרטיות (הנפוצות ביותר 400-200 נחושת רשת עם מחורר (1.2 מיקרומטר חורים עגולים מופרדים על ידי 1.3 מיקרומטר (r1.2/1.3), או 2 מיקרומטר מופרד על ידי 2 מיקרומטר של פחמן (r2/2)) תמיכה בפחמן - למרות דפוסים רבים ושונים זמינים) שימשו ברוב המכריע של מבנים שדווחו עד כה, טכנולוגיות רשת חדשניות עם מוליכות משופרת ותנועה מופחתת דגימה דווחו25 . רשתות נבחרות כפופות לטיפול ניקוי זוהר-פריקה/פלזמה כדי להפוך אותם הידרופיליים ומקובל לדגום application26.
לאחר פריקת זוהר, השלב הבא הוא היווצרות סרט דק. סרט דק זה נוצר בדרך כלל באמצעות נייר סינון כדי להסיר נוזל עודף מהרשת. בעוד זה יכול להתבצע באופן ידני, מספר מכשירי הקפאת צלילה זמינים מסחרית, כולל Vitrobot Mk IV (תרמו פישר מדעי), EM GP II (לייקה) ו CP3 (גטן). עם התקנים אלה, ~ 3-5 μL של מדגם בפתרון מוחל על רשת EM, ואחריו סופג את פתרון עודף באמצעות נייר מסנן. הרשת, עם סרט דק תלוי על פני זה, הוא צלל לתוך אתאן נוזלי מקורר על ידי חנקן נוזלי (LN2) כדי ~ -175 °C (70 °F). לאחר הקפאת, הרשת נשמרת בטמפרטורה מתחת לנקודת הפיחות (-137 °C)-C לפני, ובמהלך ההדמיה.
סינון דגימה ואיסוף נתונים לאחר vitrification של רשת cryoEM, השלב הבא הוא לסנן את הרשת כדי להעריך את איכותה ולקבוע אם הרשת מתאימה להמשיך לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה. רשת cryoEM אידיאלית כוללת קרח זגוכי (בניגוד לקרח גבישי) עם עובי הקרח מספיק כדי להכיל את הממד הארוך ביותר של הדגימה, מה שמבטיח שהקרח שמסביב תורם כמה שפחות רעש לתמונה המתקבלת. החלקיקים בתוך הקרח צריכים להיות בגודל (אם ידוע) צורה עולה בקנה אחד עם ביוכימיה, באופן אידיאלי להיות monodisperse עם התפלגות אקראית של כיווני חלקיקים. לבסוף, הרשת צריכה להיות מספיק אזורים באיכות מספקת כדי לספק את אורך איסוף הנתונים הרצוי. בהתאם לדגימה, זה עשוי לקחת איטרציות רבות של vitrification והקרנה עד רשתות אופטימליות מיוצרים. למרבה המזל ולמרבה הצער, יש מגוון עצום של משתנים שניתן לבדוק אמפירית כדי לשנות את התפלגות החלקיקים ברשתות cryoEM (נבדק ב-16,27). בכתב יד זה, תוצאות מייצגות עבור פרויקט חלבון ממברנה10 מוצגים.
לאחר זיהוי רשת מתאימה, איסוף הנתונים יכול להמשיך. מספר מודלים של מיקרוסקופ אלקטרונים בהעברת קריו עבור דגימות ביולוגיות מותאמים לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה באופן אוטומטי. בדרך כלל, נתונים נאספים במערכות 300 kV או 200 kV. איסוף נתונים אוטומטי ניתן להשיג באמצעות תוכנה כולל EPU (תרמו פישר מדעי)28, Leginon29, JADAS30 ו SerialEM31,32. איסוף נתונים אוטומטי עם גלאים מודרניים בדרך כלל גורם לטרה-בתים (TB) של נתונים גולמיים בפרק זמן של 24 שעות (ערכות נתונים ממוצעות הן ~ 4 TB בגודל).
בשל מגבלות COVID-19 במקום על רוב העולם (זמן כתיבת דצמבר 2020), מתקני מיקרוסקופיה רבים עברו להציע גישה מרחוק. לאחר שהרשתות נטענו לתוך המטען האוטומטי של מיקרוסקופ, ניתן לבצע רכישת נתונים מרחוק.
עיבוד תמונה ובניית מודל כאשר הפעלת איסוף נתונים עשויה להיות בדרך כלל 0.5-4 ימים, עיבוד תמונה עוקב עשוי להימשך שבועות וחודשים רבים, בהתאם לזמינות משאבי המחשוב. זה סטנדרטי עבור שלבים ראשוניים עיבוד תמונה, כלומר תיקון תנועה והערכת פונקציית העברת ניגודיות (CTF) להתקיים 'תוך כדי תנועה' 33,34. עבור עיבוד במורד הזרם, יש שפע של חבילות תוכנה זמינות. חלקיקים 'נקטפים' ומופקים ממיקרוגרפים35,36. לאחר חילוץ החלקיקים, פרוטוקול סטנדרטי יהיה לעבד את החלקיקים באמצעות מספר סבבי סיווג (בשני הממדים (2D) ושלושה ממדים (3D) ו / או התמקד באזורים ספציפיים של עניין) כדי להגיע תת קבוצה הומוגנית של חלקיקים. תת-קבוצה הומוגנית זו של חלקיקים היא אז ממוצע יחד כדי לייצר שחזור 3D. בשלב זה נתונים מתוקנים לעתים קרובות עוד יותר כדי לייצר את המפה באיכות הגבוהה ביותר האפשרית, למשל באמצעות עידון CTF, תיקוני עיוות37 ו ליטוש בייסיאן38 . התוצאה של עיבוד תמונה זה היא מפת cryoEM תלת-ממדית של הדגימה הביולוגית של עניין. טווח הרזולוציה אליו הגיע בניסוי חלקיקים יחידים אוטומטי 'סטנדרטי' מרשת באיכות מספקת, כאשר הנתונים הנאספים במערכת מיקרוסקופ של 300 קילוואט הוא בדרך כלל בין 10 Å ל- 2 Å בהתאם לגודל ולגמישות של קומפלקס החלבון. עם דגימה אידיאלית, רזולוציות של ~ 1.2 Å הגיעו כעת באמצעות זרימות עבודה של SPA5. בעוד פרוטוקול זה מפרט צעדים לקראת קבלת מפת צפיפות EM, ברגע זה ביד זה יכול להתפרש עוד יותר באמצעות התאמה ועידון מודל חלבון (אם הרזולוציה היא < 3.5 Å) או בניית דה novo39. נתונים הקשורים לניסויי קביעת מבנים יכולים להיות מופקדים במאגרים ציבוריים מקוונים, כולל מפות צפיפות EM (אלקטרון מיקרוסקופיה Data Bank)40, וכתוצאה מכך קואורדינטות אטומיות (Protein Data Bank)41 וערכת נתונים גולמית (ארכיון התמונות הציבוריות של אלקטרון מיקרוסקופיה)42.
בפרוטוקול זה, קומפלקס חלבון הממברנה החיצונית RagAB (~ 340 kDa) מ Porphyromonas gingivalis משמש קומפלקס מקרומולקולרי דוגמה10 (EMPIAR-10543). עבור אלה חדשים cryoEM, תמיכה עבור דגימות דרך צינור זה מדגם למבנה זמין, בכפוף לביקורת עמיתים, באמצעות תוכניות גישה ממומנות כגון גילוי iNEXT והוראה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryoEM) היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים, באמצעות ניתוח חלקיקים יחיד (SPA). התהליך הכולל כרוך i) vitrifying הדגימה בסרט דק נתמך על רשת cryoEM; ii) סינון הדגימה להערכת התפלגות החלקיקים ואיכות הקרח; iii) אם הרשת מתאימה, איסוף ערכת נתונים חלקיקית אחת לניתוח; ו-iv) עיבוד תמונה כדי להניב מפת צפיפות EM. בפרוטוקול זה, מסופקת מבט כולל עבור כל אחד מהצעדים הללו, תוך התמקדות במשתנים שהמשתמש יכול לשנות במהלך זרימת העבודה ובפתרון בעיות נפוצות. עם פעולת מיקרוסקופ מרחוק הופכת לסטנדרט במתקנים רבים, יתואר וריאציות על פרוטוקולי הדמיה כדי לסייע למשתמשים בתפעול והדמיה יעילים כאשר הגישה הפיזית למיקרוסקופ מוגבלת.

בעת ההקרנה, ניתן למחוק רשתות בשלב האטלס, שבו תכונות שנפתרו בהגדלה נמוכה מסמנות את הרשת כמי שאינה מתאימה לרכישת נתונים. לדוגמה, אם רשת הייתה נתונה לנזק מכני משמעותי כאשר רוב ריבועי הרשת נשברו (איור 2A), או כאשר הרשת נראית 'יבשה', ללא קרח זגג (איור 2B). רשתות כאלה ניתנות לזיהוי בדרך כלל מכיוון שקצוות ריבועי הרשת נראים חדים ומובחנים. ברוב הרשתות המיוצרות באמצעות מכשיר ההקפאה של הצלילה, נצפה שיפוע קרח (איור 2C, D). התפלגות החלקיקים, בהתאם לדגימה של עניין, יכול להשתנות באופן דרמטי עם עובי הקרח ולכן הקרנת מגוון של ריבועי רשת כדי להעריך את התפלגות החלקיקים מומלץ. כלים יושמו בתוכנת EPU במהלך שלב סינון האטלס כדי לסייע למשתמש לזהות ריבועי רשת של עובי קרח דומה או שונה, אשר יכול להיות שימושי במיוחד למשתמשים חדשים לבדיקת רשתות cryoEM (איור 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> איור 2: מונטאז'ים 'אטלס' בהגדלה נמוכה לדוגמה מהפעלות הקרנה. A) רשת שספגה נזק משמעותי כאשר רוב ריבועי הרשת נשברו - לא מתאימים לאיסוף. ב) רשת יבשה ללא קרח עליז - לא מתאימה לאיסוף. C) רשת המדגים שיפוע קרח עם ~ 50% מהרשת שמיש. D) שיפוע קרח עם ~ 33% מהרשת שמיש. הן C והן D, מתאימים לאיסוף נתונים אם לריבועי הרשת השימושיים יש עובי קרח המתאים לאיסוף, ויש מספיק אזורי רכישה כדי לספק את משך הזמן המינימלי של אוסף (למשל, 24 שעות) E) אטלס לדוגמה עם טווח של עובי קרח. ו) אותו אטלס המוצג ב- E אך עם ריבועי רשת מסווגים וצבעוניים על ידי תוכנת EPU לפי עובי הקרח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בעת סינון התפלגות חלקיקים, ודא כי פרמטרי הדמיה, כגון הגדלה ומינון אלקטרונים כולל, דומים לאלה הצפויים לשמש במהלך רכישת נתונים על מנת לספק תמונה מדויקת של התוצאות הצפויות. במהלך ההקרנה, התפלגות חלקיקים אידיאלית היא חד-ממדית עם מגוון של כיווני חלקיקים הנראים לעין (בהתאם לדגימה ולידע הקיים של המורפולוגיה של החלקיק, זה עשוי להיות מאתגר לברר) (איור 3A). הקרח צריך להיות דק ככל האפשר תוך כדי אירוח הממד הגדול ביותר של החלקיקים, אם הקרח דק מדי הוא יכול להינמס כאשר הוא מואר בקרן האלקטרונים. הדבר גורם לתנועה מוגזמת במיקרוגרף, ויש להימנע מאזורים המציגים מאפיין זה (איור 3B). מניסיון קולקטיבי, אפקט זה הוא הנפוץ ביותר כאשר יש חומר ניקוי במאגר. זה יכול לגרום קרח דק מאוד במרכז החור ולכן חלקיקים ניתן לשלול פיזית נאלץ לכיוון הקצה. אפקט זה נצפה באיור 3C, אך במקרה זה הוא אינו דוגמה קיצונית ותמונות אלה עדיין יתרמו באופן מועיל ערכת נתונים. לבסוף, הקרח צריך להיות שרץ; אל תכלול אזורים ברשת (או ברשתות) שבהם רוב התמונות שצולמו או כולן מציגות קרח גבישי (איור 3D) מרכישת נתונים. לעתים קרובות, קרח לא מרץ נצפה בקצה ריבועי רשת. הקוראים מופנים ביקורות מפורטות של המשתנים שניתן לשנות במהלך vitrification רשת16 ותיאורים של התנהגות חלקיקים בסביבת הסרט הדק46,47 לקבלת מידע נוסף.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> איור 3: מיקרוגרפים מייצגים המציגים התפלגות חלקיקים שונה. A) התפלגות 'אידיאלית' של חלקיקים חד-ממדיים המאמצים מגוון אוריינטציות. B) קרח דק מדי באמצע החור שהוא מעוות עם החשיפה לקרן האלקטרונים וגורם לתנועה מוגזמת במיקרוגרף. אפקט זה נצפה לרוב כאשר חומר ניקוי קיים במאגר C) כאשר קרח הוא דק יותר במרכז החור, זה פיזית מוציא חלקיקים מהמרכז, גרימת צפיפות של חלקיקים לכיוון קצה החור. במקרה זה זה לא קיצוני מספיק כדי למנוע תמונות אלה להיות שימושי, אבל זה מרמז שזה שווה הקרנה אזורים מעט עבים יותר. ד) קרח אינו שרץ, אין לאסוף נתונים על אזורים שנראים כמו מיקרוגרף לדוגמה זו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עיבוד תמונה תוך כדי תנועה יכול לעזור לאסוף שגיאות ובעיות ברכישת נתונים ולכן מומלץ תמיד במידת האפשר. לדוגמה, תנועה מופרזת בתוך מיקרוגרפים עשויה להצביע על כך שמשאבת הטורבו האוטומטית פעילה, או שנאספים נתונים בריבוע רשת סדוק שבו הקרח נע באופן משמעותי בקרן האלקטרונים, מה שמצביע על כך שיש לדלג על ריבוע הרשת. על זבוב הערכת CTF יכול לחשוף נסיבות שבהן נקודת מיקוד חיובית (ולא defocus) מוחל (שבו תוכניות הערכת CTF ופרמטרים כדי למצוא נקודות אלה משמשים), ולקבוע את שינוי הפאזה שבו צלחת שלב וולטה48 משמש. בצינורות עיבוד התמונות של Fly יש לעתים קרובות סיכום גרפי של הנתונים (איור 4A) כדי להקל על המשתמשים להעריך את איכות המיקרוגרף במהירות ולהחליט אם נדרשים תיקוני איסוף נתונים.
בחירת חלקיקים ממיקרוגרפים, תוך הימנעות מ"תוצאות חיוביות שגויות" כגון זיהום או סרט התמיכה ברשת יכולה לדרוש מיטוב. עם זאת, בוררי חלקיקים כגון crYOLO פועלים לעתים קרובות מספיק טוב באמצעות פרמטרי ברירת המחדל עבור 'מעבר ראשון' של הנתונים (איור 4B), המאפשר התקדמות למחלקה דו-יומית בממוצע שבה ניתן להעריך את איכות הנתונים ואת הסבירות להצלחה במורד הזרם. עבור רוב הפרויקטים, סיווג 2D של ~ > חלקיקי 10k צריך להתחיל לחשוף מחלקות שיש להם פירוט מבנה משני. כדי להמשיך לתל-ממד, שלב הסיווג הדו-ממדי אמור בדרך כלל לחשוף מחלקות המייצגות טווח של כיווני חלקיקים. אם מתגלה כיוון מועדף, ייתכן שיידרשו איטרציות נוספות של הכנת מדגם16 או רכישת נתונים נוספת כאשר המדגם מוטה עשוי להידרש49. יש לבחור את כל המחלקות המציגות פרטי מבנה משניים כדי לעבור לניתוח תלת-ממדי, בעוד חלקיקי 'זבל' מושלכים (איור 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> איור 4: שלבים ראשוניים של עיבוד תמונה. A) פלט מקובץ Script של עיבוד תמונה 'תוך כדי תנועה'. ב) מיקרוגרף לדוגמה (משמאל) עם חלקיקים שנבחרו אוטומטית כראוי שזוהו באמצעות המודל הכללי של crYOLO (מימין, עם חלקיקים תחובים בריבועים אדומים) מוטות קנה מידה (לבן) הם 50 ננומטר. ג) תוצאות מסיווג 2D המציגות מחלקות שהושלכו בריבוע האדום, וכיתות שמהן נבחרו חלקיקים לעיבוד נוסף בירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ניתן להשתמש בתת-קבוצה קטנה של חלקיקים ליצירת דגם ראשוני (איור 5A). לאחר מכן ניתן להשתמש במודל התחלתי זה כמודל התחלתי בסיווג ושיפור תלת-ממדיים. במקרה של RagAB, ערכת הנתונים הכילה שלושה קונפורמרים נפרדים שניתן להפרידם במהלך סיווג תלת-ממדי (איור 5B). חלקיקים התורמים לכל אחד משיעורים אלה יכולים להיות מטופלים באופן עצמאי ולהשתמש בהם כדי לחדד מפת צפיפות EM אשר לאחר מכן יכול להיות כפוף לפרשנות נוספת ובניית מודל.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> איור 5: יצירת מפת צפיפות EM תלת-ממדית. A) דגם התחלתי אופייני שנוצר באמצעות RELION. ב) סיווג תלת-ממדי על פני 5 מחלקות המציגות הפרדת חלקיקים לשלושה מצבים קונפורמיים נפרדים: פתוח (ירוק), סגור פתוח (כחול), סגור (סגול). ג) תהליך יצירת מסיכה. יש לדמיין את המפה מעידון תלת-ממדי (משמאל) ב כימרה. לאחר מכן ניתן להשתמש במציג עוצמת הקול כדי לזהות את הסף הנמוך ביותר שבו המפה נקייה מצפיפות מתפוררת ורועשת (אמצע). ערך סף זה הוא קלט כסף הבינאריזציה ההתחלתי ב משימת יצירת מסיכת RELION. פלט מסיכה לדוגמה מוצג באפור (מימין). D) מפת צפיפות EM ברזולוציה גבוהה של המצב הפתוח הסגור של RagAB (EMD-10245), מסוננת וצבעונית לפי רזולוציה מקומית (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

ניתוח קריו-EM של חלקיק יחיד הפך לטכניקה שגרתית בארגז הכלים של הביולוג המבני החל על מגוון רחב של דגימות כולל חלבונים ממברנה, סיבי עמילואיד, חלבונים מחייבים חומצת גרעין ווירוסים. לאחר השלמת הכנת המדגם והרשתות נטענות למיקרוסקופ, איסוף הנתונים יכול להתבצע מרחוק במתקני cryo-EM רבים כגון המעבדה לביו-מבנה Astbury ו- eBIC. חסמים עיקריים לקביעת מבנה מוצלחת טמונים לעתים קרובות בשלבי הכנת המדגם וסינון הרשת עם איטרציות מרובות הנדרשות לעיתים בתהליך זה.כאן, אנו נודגים סינון רשת מרחוק ורכישת נתונים של חלקיק יחיד. בכרטיסיה טעינה אוטומטית של ממשק המשתמש של המיקרוסקופ, תחוץ את תיבת הדו-שיח אפשרויות באמצעות החץ ולחצה על לחצן המלאי. פעולה זו תבדוק ברצף כל מיקום בקלטת כדי לקבוע אם קיימת מחסנית.המלאי יפעל על כל חריץ ברצף. כאשר כל החריצים הכבושים ממופים, המלאי ייפסק. סמן את הרשת שיש להעביר לעמודת המיקרוסקופ ולחץ על טעינה.תווית החריץ תהפוך מכחול לצהוב לאחר שרשת הטעינה בהצלחה על הבמה. כדי לסנן את הרשתות, פתח את תוכנת EPU. בדף ההכנה, בחר אופטיקה והגדרות רכישה ולאחר מכן בחר את הקביעה המוגדרת מראש של אטלס מהתפריט הנפתח.בחרו קביעות קרן מוגדרות מראש מתאימות ולחצו על ערכת הדחיפה של הפרמטרים למיקרוסקופ. לחץ כדי לפתוח שסתומי עמודה ולהכניס את מסך שפעת. בדוק כי קרן גלויה ומופצת מספיק ומרוכזת כדי לכסות את הגלאי.במידת הצורך, נווטו לאזור דק יותר ברשת באמצעות הג'ויסטיק או לוחות היד הווירטואליים כדי לשלוט בתנועות הבמה ב- X וב- Y.Lift את מסך השפעת ולצלם תמונה באמצעות לחצן התצוגה המקדימה ב- EPU. ב- EPU, עבור לדף האטלס ולחץ על הפעלה חדשה. בחר את תבנית התמונה MRC והזן שם תיקיה ומיקום מתאימים לשמירת הפעלת ההקרנה ולאחר מכן לחץ על החל.בחר הקרנה מהתפריט מימין. סמן את תיבות הסימון לצד כל רשת כדי שנרכש מונטאז' אטלס ולאחר מכן התחל את הפעלת ההקרנה ב- EPU. אטלס נרכש עבור כל רשת מסומנת לריבועי רשת זמינים מפורטים עם השלמתם.ניתן לצפות בכל אטלס על-ידי הדגשתו בדף ההקרנה. בסיום, סקור את האטלסים שנאספו וזיהה את הרשתות המתאימות להערכת איכות המדגם בהגדלות גבוהות יותר. סמן את הרשת שנבחרה בתפריט ההקרנה EPU ולחץ על דוגמה לטעינה.מתפריט ההקרנה אטלס, בחר את הרשת שנטענה כעת והזז את הבמה לריבוע רשת המכיל את החורים המלאים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על המיקום הרצוי בתמונת הרשת ובחירת שלב המעבר כאן. חזרו לעמוד ההכנה ל-EPU ובחרו את הקביעה המוגדרת מראש של הרשת. פתחו את עמוד הפונקציות האוטומטיות של EPU והפעילו את ההטיה האוטומטית-אוצנטרית לפי שלב עם הקביעה המוגדרת מראש של ריבוע הרשת כדי להעביר את הדגימה לגובה האוצנטרי.בהכנה ל-EPU, צפו תמונת תצוגה מקדימה מרובעת חדשה של הרשת. שים לב לערכים האפורים על פני חורים שונים המציינים עובי קרח שונה. הזז את השלב מעל חור באמצעות לחץ באמצעות לחיצה ימנית והזז את השלב כאן.בחרו את החור או את קביעת הגובה האוצנטרית המוגדרת מראש ולחצו על תצוגה מקדימה. בחר קביעה מוגדרת מראש של רכישת נתונים והגדר הגדלה המאפשרת זיהוי קל של החלקיקים. הגדר את היסט ההיסט ל- מינוס 3 עד 5 מיקרומטר.יש לחזור על שלבים כדי להעריך מחדש טווח של עובי קרח עבור התפלגות חלקיקים, כיוון וזיהום על-פני הרשת. בהתאם לזמינות המיקרוסקופ, המשך ישירות לאיסוף נתונים או שניתן להסיר רשתות מהמיקרוסקופ לצורך איסוף עתידי, כולל באתרים אחרים. לאסוף אטלס אם אחד אינו זמין מהקרנה על ידי הגדרת הגדרות אטלס ובחירת רשת לרכוש אטלס.לרכוש אטלס ולחץ על מיקום הרשת כדי לראות את הפלט. לאחר השלמת האטלס, הגדר כל אחת מההגדרות המוגדרות מראש של הקרן בהתאם לצרכים הניסיוניים של הפרויקט. בצע כיול הזזת תמונה.הגדר את הפעלת ה-EPU על-ידי בחירת הגדרת הפעלת עמוד EPU ולאחר מכן בחירת הפעלה חדשה או חדשה מהעדפות. לאחר בחירת הפעלה חדשה, יופיע מוקפץ המספק אפשרות להשתמש בהגדרות קודמות. ההגדרות ייטענו באופן אוטומטי מההפעלה הקודמת להפעלה הנוכחית של EPU.לחלופין, בחרו 'חדש' מהעדפות ובחרו קובץ עם העדפות שמורות כדי לטעון מראש מידע זה ל-EPU הנוכחי. מלא את שם ההפעלה במשהו אינפורמטיבי. בסוג, בחר ידני.עבור מצב רכישה, בחר ריכוז חורים מדויק או רכישה מהירה יותר אם אוסף הסטייה החופשי של העברת התמונה זמין ורצוי. בחר את תבנית התמונה הרצויה ולאחר מכן בחר תיקיית אחסון ו- EPU ייצור ספריה בשם ההפעלה. בחר את הרשת המתאימה לפיה נעשה שימוש בריווח חורי רשת והקש על החלה.בחר ריבוע רשת התחלתי והגדר תבנית רכישה. עבור אל בחירה מרובעת. אם כל הריבועים ירוקים, לחץ על בטל את הבחירה בכל הימני העליון.פתח אריחים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ולאחר מכן בחירה באריחים פתוחים. הוסף או בחר ריבוע רשת על-ידי לחיצה על Select ולאחר מכן לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ובחירה באפשרות העבר שלב לריבוע רשת. עבור אל בחירת חור ולחץ על אוטומטי eucentric.המתן עד לתמונה מרובעת של רשת. אם הפונקציה האוטומטית נכשלת, ייתכן שהסיכום לכך הוא שהגובה כבוי באופן משמעותי. ניתן לכוונן אותו באופן ידני באמצעות מסך השפעת בהגדלה מרובעת של הרשת.כדי למדוד את גודל החור, הזז ולהתאים את העיגולים הצהובים כך שהם מעל החורים עם גודל ומרווח נכונים. לחץ למצוא חורים. בדוק כי החורים נמצאו כראוי.אם לא, שנה את גודל החור ולחץ על מצא חורים שוב. אם תהליך זה נכשל בעקביות, שקול לעבור למספר נמוך יותר או לגודל נקודה בהיר יותר בהגדלה מרובעת של רשת. השתמש בהיסטוגרמה של איכות הקרח של המסנן בצד ימין כדי להתאים את בחירת החורים.זה יכול להיות שימושי כדי לא לכלול אזורים עם קרח עבה וקרח דק. אפשרות זו תיזכר עבור ריבועי רשת עתידיים שנבחרו במהלך ההפעלה. מטב את בחירת החורים בעזרת הכלים בתפריט הנבחר בחלק העליון.לדוגמה, לחץ על הסר חורים קרוב לסרגל הרשת. עבור להגדרת תבנית ולחץ על acquire. לחץ על חיפוש ומרכז חור.שנה את ההשהיה לאחר הסטת השלב והשהה לאחר זמני הזזת התמונה לשניה עד חמש שניות, ולאחר מכן, בדוק שערך הסטת התמונה המרבי הוא לפי הרצות. לחץ על הוסף אזור רכישה ולחץ במקום כלשהו בתמונה. העבר את אזור הרכישה למיקום הרצוי.הוסף את טווח ההשבתה בצד ימין למעלה. רשימת נטרול טיפוסית לפרויקט חלבון ממברנה היא מינוס 0.8 למינוס 0.8 למינוס שלושה מיקרומטרים, ואז מוסיפים אזורי רכישה אחרים, ומסדרים אותם כך שתחומי הרכישה לא ייחשפו כפליים עם הקרן. לחץ על הוסף אזור מיקוד אוטומטי ולחץ במקום כלשהו בתמונה.העבר את אזור המיקוד האוטומטי לפחמן המקיף חור. הנוהג המקובל הוא להתמקד אוטומטית לאחר ריכוז בעת שימוש ב- AFIS או כל חמישה עד 15 מיקרומטר בהתאם לשינוי גובה Z על פני הריבוע. לחץ על הוסף אזור מדידת דריפט.מדידת דריפט שבוצעה פעם אחת בריבוע רשת עם סף מוגדר של 0.05 ננומטר לשנייה כהגדרה סטנדרטית. אזור מדידת הסחף יכול לחפוף ישירות לאזור המיקוד האוטומטי. ודא שלא סחיפה ולא אזור מיקוד אוטומטי חופפים לאזור רכישה.חזור לבחירה מרובעת ובחר את הריבועים לרכישה ברשת. השתמש במספר אזורי הרכישה ובקצב רכישת הנתונים הצפוי כדי לחזות כמה אזורי רכישה נדרשים. כאשר כל הריבועים הרצויים נבחרים, לחץ על הכן את כל הריבועים.לאחר איסוף כל ריבוע, נווטו בין ריבועי הרשת והתכוונן היטב את החורים באמצעות מברשת הבחירה. עבור למיקום שלב מעל הדגימה והשתמש בפונקציות אוטומטיות כדי להגדיר גובה אוצנטרי. בצע יישור מיקרוסקופ באמצעות תוכנת מיקרוסקופ כמתואר קודם לכן ובטקסט.בצע יישור ללא תרדמת בתוך הפונקציות האוטומטיות לפני כניסה מחדש וריפרוך הצמצם האובייקטיבי ותיקון אסטיגמציה העדשה האובייקטיבית עם EPU. ודא ששני היישורים מתכנסים לערכים מתאימים. לפני תחילת ריצת הרכישה האוטומטית, ודאו כי משאבת הטורבו האוטומטית כבויה והצמצם האובייקטיבי מוכנס במידת הצורך.ברכישה אוטומטית, לחץ על התחל לפעול כדי להתחיל ברכישת נתונים אוטומטית. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לסנן ולהשליך רשתות שבורות או יבשות בשלב האטלס. שיפוע קרח נצפה על פני רוב הרשתות.במהלך ההקרנה, התפלגות חלקיקים אידיאלית היא monodispersed עם מגוון של כיווני חלקיקים גלויים. אם הקרח דק מדי, הוא יכול להינמס כאשר הוא מואר בקרן האלקטרונים, מה שגורם לתנועה מוגזמת במיקרוגרף. זה הוא הנפוץ ביותר כאשר יש חומר ניקוי במאגר.הקרח צריך להיות שפל כך שאזורים ברשת שבהם רוב התמונות מראות שקרח גבישי לא נכללו. סיכום גרפי של הנתונים נכלל כדי להעריך את איכות המיקרוגרף ולהחליט אם נדרשים תיקוני איסוף נתונים. בוררי חלקיקים כגון crYOLO פועלים מספיק טוב עבור מעבר ראשון של הנתונים, ומאפשרים התקדמות לממוצע מחלקה דו-יומית.מחלקות המציגות פרטי מבנה משניים יש לבחור עבור ניתוח תלת-ממדי בעוד חלקיקי זבל יש להשליך. ניתן להשתמש בתת-קבוצה של חלקיקים כדי ליצור מודל ראשוני לסיווג ועידון תלת-ממדיים. במקרה של RagAB, ערכת הנתונים הכילה שלושה קונפורמרים נפרדים שניתן להפריד במהלך סיווג תלת-ממדי.חשוב לזכור כי הצלחה בשלבי רכישת הנתונים וניתוח התמונה הבאים מסתמכים על השגת וזיהוי רשתות ממוטבות היטב בשלב ההקרנה. לאחר קבלת מפת צפיפות EM תלת-ממדית, ניתן לפרש אותה עוד יותר באמצעות התאמה וזיקוק של מודל חלבון או בניית מודל אטומי דה נובו. ניתוח חלקיקים יחידים Cryo-EM מאפשר קביעה מובנית של מטרות רבות שלא היו אפשריות בעבר.ראוי לציין, זרימות עבודה אלה שימשו לאחרונה כדי לפתור מבנים של מקרו-19 הקשורים ל- COVID-19.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

חילוץ מיקרוטובולים מהונדסים מתאי יונקים לחקר קומפלקסים של מיקרוטובולים-חלבונים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...