Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

इस काम को यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित iNEXT-डिस्कवरी (अनुदान 871037) द्वारा समर्थित किया गया था। J. B. R. White को Wellcome Trust (215064/Z/18/Z) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। एफईआई टाइटन क्रिओस माइक्रोस्कोप को लीड्स विश्वविद्यालय (यूओएल एबीएसएल पुरस्कार) और वेलकम ट्रस्ट (108466 / जेड / 15 / जेड) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम अपने माइक्रोग्राफ विश्लेषण स्क्रिप्ट के उपयोग के लिए एम Iadanza धन्यवाद. हम यूके के राष्ट्रीय इलेक्ट्रॉन बायो-इमेजिंग सेंटर (ईबीआईसी) में क्रायो-ईएम सुविधाओं के उपयोग और समर्थन के लिए डायमंड लाइट सोर्स को स्वीकार करते हैं, जिसे वेलकम ट्रस्ट, एमआरसी और बीबीआरएससी द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

हितों के टकराव की कोई सूचना नहीं है।

इस प्रोटोकॉल में हमने नियमित एसपीए के लिए उपयुक्त नमूनों पर लागू एक बुनियादी पाइपलाइन का वर्णन किया है। जबकि पतली फिल्म गठन और विट्रीफिकेशन की यह फिल्टर पेपर ब्लोटिंग विधि निस्संदेह एसपीए परियोजनाओं के विशाल बहुमत में इसके उपयोग को देखते हुए सफल है, यह कई नुकसानों के साथ आता है। इनमें नमूना अपव्यय, पतली फिल्म बनाने और नमूने को फ्रीज करने के लिए आवश्यक धीमी टाइमस्केल (सेकंड) शामिल हैं, अपरिवर्तनीयता 27 की सूचना दी गई है और अतिरिक्त तरल 50 को दूर करने के लिए फ़िल्टर पेपर का उपयोग करने के नकारात्मक प्रभावों की सूचना दी गई है। हाल ही में, पतली फिल्म निर्माण 51,52 की पुनरुत्पादकता में सुधार करने के लिए नई प्रौद्योगिकियों को विकसित किया गया है। अन्य प्रौद्योगिकियों को विकसित किया गया है जो नमूना अनुप्रयोग और विट्रीफिकेशन 53,54,55 के बीच के समय को कम करते हैं। जबकि पतली फिल्म गठन के लिए फ़िल्टर पेपर-आधारित तरीके लेखन के समय एसपीए क्रायोईएम नमूना तैयारी की सबसे सर्वव्यापी विधि बनी हुई हैं, ये नई प्रौद्योगिकियां ग्रिड विट्रीफिकेशन की दक्षता और पुनरुत्पादन के संदर्भ में लाभों की एक श्रृंखला ला सकती हैं, साथ ही साथ अतिरिक्त प्रयोगात्मक आयामों को लाने के लिए नए अवसर पैदा कर सकती हैं, जैसे कि समय संकल्प और विट्रिफिकेशन से पहले तेजी से मिश्रण।
अधिकांश उपयोगकर्ताओं के लिए ग्रिड स्क्रीनिंग की प्रक्रिया वर्तमान में एक गुणात्मक प्रक्रिया है जिसमें कण वितरण का आकलन करने के लिए ग्रिड में उच्च-आवर्धन छवियों को लेने के बाद कम आवर्धन एटलस का अधिग्रहण शामिल है। हालांकि यह कुछ प्रकार के नमूने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत दृष्टिकोण है, यह आंखों से आकलन करना मुश्किल हो सकता है कि क्या नमूना वास्तव में वह है जो शोधकर्ता छवि की उम्मीद कर रहा है या एक पसंदीदा अभिविन्यास है, उदाहरण के लिए छोटे (<200 केडीए) नमूनों के साथ या जहां कम-रिज़ॉल्यूशन आकृति विज्ञान आंखों से पहचानना मुश्किल बनाता है यदि कण वितरण की एक श्रृंखला मौजूद है। कुछ परियोजनाओं के लिए, यह निर्धारित करना असंभव है कि क्या नमूना वांछित है, उदाहरण के लिए जहां एक लिगैंड बाध्य है या जहां नमूना यह आकलन करने के लिए जांचा जा रहा है कि क्या एक छोटा (उदाहरण के लिए, 10 केडीए) सबयूनिट अभी भी एक जटिल के सहयोग से मौजूद है। इन परियोजनाओं के लिए, डेटा विश्लेषण के लिए पूरी तरह से स्वचालित पाइपलाइनों को 'शॉर्ट' 0.5 - 1-एच संग्रह के साथ जोड़ा गया है, जो 2 डी वर्गीकरण या यहां तक कि 3 डी वर्गीकरण और शोधन के लिए छवि प्रसंस्करण चरणों के माध्यम से आगे बढ़ सकता है, यह कुशलतापूर्वक निर्धारित करने में मदद करेगा कि क्या एक लंबा संग्रह वारंट किया गया है। ये पाइपलाइनें अभी भी विकास के अधीन हैं और वर्तमान में व्यापक रूप से लागू नहीं की गई हैं, लेकिन उनके पास क्रायोईएम ग्रिड स्क्रीनिंग की दक्षता में सुधार करने की क्षमता है, खासकर चुनौतीपूर्ण नमूनों के लिए।
प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों में सुधार, साथ ही साथ छवि प्रसंस्करण में प्रगति के साथ संयुक्त माइक्रोस्कोपी में संशोधन जैसे कि छवि शिफ्ट डेटा संग्रह, डेटा अधिग्रहण के दौरान उत्पादित छवियों के थ्रूपुट और गुणवत्ता में वृद्धि हुई है। एकत्र किए जा रहे आंकड़ों की दर में यह वृद्धि कई टीबी डेटा के अधिग्रहण से पहले क्रायोईएम ग्रिड की पूरी तरह से जांच की आवश्यकता पर प्रकाश डालती है।
क्रायोईएम एसपीए वास्तव में एक मुख्यधारा की संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक बन गई है, और कई मामलों में नमूनों के कुछ वर्गों के लिए 'जाने' दृष्टिकोण, जैसे विषम और लेबाइल मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स। जबकि यहां प्रोटोकॉल एसपीए पाइपलाइन के एक बुनियादी अवलोकन का वर्णन करता है, यहां कवर किए गए प्रत्येक अनुभाग (ग्रिड विट्रिफिकेशन और स्क्रीनिंग, क्रायोईएम और छवि प्रसंस्करण) अपने आप में एक विषय है और एक एसपीए परियोजना के विकास के दौरान अन्वेषण के योग्य है। जैसा कि नमूना तैयारी और माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियां प्रगति करती हैं, और नई छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम और दृष्टिकोण ऑनलाइन आते हैं, एसपीए एक पाइपलाइन के रूप में विकसित करना जारी रखेगा, जिससे शोधकर्ताओं को जटिल जैविक प्रणालियों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में सहायता मिलेगी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) एकल कण विश्लेषण (एसपीए) के माध्यम से मैक्रोमोलेक्यूलर परिसरों की संरचना निर्धारण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। समग्र प्रक्रिया में शामिल है i) क्रायोईएम ग्रिड पर समर्थित एक पतली फिल्म में नमूने को विट्रीफाइंग करना; ii) कण वितरण और बर्फ की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए नमूने की स्क्रीनिंग; iii) यदि ग्रिड उपयुक्त है, तो विश्लेषण के लिए एक कण डेटासेट एकत्र करना; और iv) एक ईएम घनत्व मानचित्र उपज करने के लिए छवि प्रसंस्करण। इस प्रोटोकॉल में, इन चरणों में से प्रत्येक के लिए एक सिंहावलोकन प्रदान किया जाता है, जिसमें उन चरों पर ध्यान केंद्रित किया जाता है जिन्हें उपयोगकर्ता वर्कफ़्लो और सामान्य समस्याओं के समस्या निवारण के दौरान संशोधित कर सकता है। दूरस्थ माइक्रोस्कोप ऑपरेशन कई सुविधाओं में मानक बनने के साथ, कुशल संचालन में उपयोगकर्ताओं की सहायता करने के लिए इमेजिंग प्रोटोकॉल पर भिन्नताओं और माइक्रोस्कोप तक भौतिक पहुंच सीमित होने पर इमेजिंग का वर्णन किया जाएगा।

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

क्रायोईएम का उपयोग करके मैक्रोमोलेक्यूलर परिसरों की संरचना का निर्धारण प्रोटीन और परिसरों के कुछ वर्गों के लिए नियमित हो गया है। यहां, इस पाइपलाइन को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है (नमूना तैयारी, स्क्रीनिंग, डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण) और पाठकों को आगे के विस्तृत संसाधनों और चर की ओर निर्देशित किया जाता है जिन्हें अधिक चुनौतीपूर्ण नमूनों के मामले में बदला जा सकता है।

एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी: नमूना से संरचना तक

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए दोहरी-बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विट्रियस जैविक नमूनों से लैमेला तैयार करना

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

मैनुअल धब्बा-और-डुबकी एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों की ठंड

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पूरे सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी वर्कफ़्लो के भीतर प्रत्यक्ष सेल पोजिशनिंग के लिए

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचनात्मक निर्धारण के लिए डीएनए मरम्मत कारकों के साथ जटिल न्यूक्लियोसोम कोर कणों की तैयारी

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं-प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं से संशोधित सूक्ष्मनलिकाएं निकालना

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के लिए मोनोलेयर ग्राफीन का अनुप्रयोग

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...