Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
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Questo lavoro è stato supportato dall'iNEXT-Discovery (Grant 871037) finanziato dal programma Horizon 2020 della Commissione Europea. J B. R. White è finanziato dal Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). I microscopi FEI Titan Krios sono stati finanziati dall'Università di Leeds (premio UoL ABSL) e wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Ringraziamo M Iadanza per l'uso del suo script di analisi micrografica. Riconosciamo Diamond Light Source per l'accesso e il supporto delle strutture crio-EM presso l'Electron Bio-imaging Centre (eBIC) nazionale del Regno Unito finanziato dal Wellcome Trust, MRC e BBRSC.

Non vengono segnalati conflitti di interesse.

In questo protocollo abbiamo descritto una pipeline di base applicabile ai campioni suscettibili di SPA di routine. Mentre questo metodo di blotting della carta da filtro per la formazione e la vetrificazione di film sottili ha indubbiamente successo dato il suo uso nella stragrande maggioranza dei progetti SPA fino ad oggi, presenta una serie di svantaggi. Questi includono lo spreco del campione, i tempi lenti (secondi) necessari per formare il film sottile e congelare il campione, l'irriproducibilità segnalata27 e gli effetti negativi segnalati dell'uso della carta da filtro per cancellare il liquido in eccesso50. Recentemente sono state sviluppate nuove tecnologie per migliorare la riproducibilità della produzione a film sottile51,52. Sono state sviluppate altre tecnologie che riducono il tempo tra l'applicazione del campione e la vetrificazione53,54,55. Mentre i metodi basati su carta da filtro per la formazione di film sottili rimangono il metodo più onnipresente di preparazione del campione SPA cryoEM al momento della scrittura, queste nuove tecnologie possono portare una serie di vantaggi in termini di efficienza e riproducibilità della vitrificazione della griglia, oltre a creare nuove opportunità per introdurre ulteriori dimensioni sperimentali, come la risoluzione temporale e la miscelazione rapida prima della vetrificazione.
Il processo di screening della griglia per la maggior parte degli utenti è attualmente un processo qualitativo che prevede l'acquisizione di atlanti a basso ingrandimento seguiti dall'acquisizione di immagini ad alto ingrandimento attraverso la griglia per valutare la distribuzione delle particelle. Mentre questo è un approccio sufficientemente robusto per alcuni tipi di campioni, può essere difficile valutare a occhio se il campione è effettivamente ciò che il ricercatore spera di immaginare o ha un orientamento preferito, ad esempio con campioni piccoli (<200 kDa) o dove la morfologia a bassa risoluzione rende difficile identificare ad occhio se è presente una gamma di distribuzioni di particelle. Per alcuni progetti, è impossibile determinare se il campione è come desiderato, ad esempio dove un ligando è legato o dove il campione viene sottoposto a screening per valutare se una piccola subunità (ad esempio, 10 kDa) è ancora presente in associazione con un complesso. Per questi progetti, pipeline completamente automatizzate per l'analisi dei dati combinate con raccolte "brevi" da 0,5 a 1 ora, che possono procedere attraverso fasi di elaborazione delle immagini fino alla classificazione 2D o persino alla classificazione e al perfezionamento 3D, aiuterebbero a determinare in modo efficiente se è necessaria una raccolta più lunga. Queste pipeline sono ancora in fase di sviluppo e non sono attualmente ampiamente implementate, ma hanno il potenziale per migliorare l'efficienza dello screening della griglia crioEM, specialmente per i campioni difficili.
I miglioramenti nei rivelatori di elettroni diretti, così come le modifiche nella microscopia combinate con i progressi nell'elaborazione delle immagini come la raccolta dei dati di spostamento delle immagini, hanno aumentato il throughput e la qualità delle immagini prodotte durante l'acquisizione dei dati. Questo aumento del tasso di raccolta dei dati evidenzia la necessità di uno screening approfondito delle griglie crioEM prima dell'acquisizione di molti TB di dati.
CryoEM SPA è diventata una tecnica di biologia strutturale veramente mainstream e in molti casi l'approccio "go to" per alcune classi di campioni, come complessi macromolecolari eterogenei e labili. Mentre il protocollo qui descrive una panoramica di base della pipeline SPA, ogni sezione trattata qui (vetrificazione e screening della griglia, crioEM ed elaborazione delle immagini) è un argomento a sé stante e degno di essere esplorato durante lo sviluppo di un progetto SPA. Man mano che le tecnologie di preparazione dei campioni e microscopia progrediscono e nuovi algoritmi e approcci di elaborazione delle immagini entrano in linea, SPA continuerà a svilupparsi come una pipeline, aiutando i ricercatori a ottenere informazioni su sistemi biologici complessi.

CryoEM a singola particella Per indagare la vita a livello molecolare dobbiamo capire la struttura. Sono disponibili molte tecniche per sondare la struttura delle proteine, come NMR, cristallografia a raggi X, spettrometria di massa e microscopia elettronica (EM). Ad oggi, la maggior parte delle strutture depositate nella Protein Databank (PDB) sono state risolte utilizzando la cristallografia a raggi X. Tuttavia, dal ~ 2012 in poi, la microscopia crioelettronica (cryoEM) è diventata una tecnica tradizionale per la determinazione della struttura proteica e il suo uso è aumentato drasticamente. Il numero totale di mappe EM depositate presso la Banca dati di microscopia elettronica (EMDB) (a dicembre 2020) era di 13.421 rispetto alle 1.566 del 2012 (Figura 1, www.ebi.co.uk). Nel 2012 il numero di coordinate atomiche modellate nelle mappe di densità crioEM, depositate nel PDB era solo 67 ma a dicembre 2020 sono state depositate finora 2.309 strutture, un aumento di 35 volte. Questa crescita di fondo della qualità e della quantità delle mappe di densità crioEM prodotte, a volte indicata come la "rivoluzione della risoluzione"1, è stata causata da una coalescenza di progressi in più aree: lo sviluppo di nuove telecamere per l'imaging note come rivelatori di elettroni diretti; nuovo software; e microscopi più stabili2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Figura 1: Invii cumulativi all'EMDB dal 2012 a dicembre 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'analisi a singola particella (SPA) è un potente strumento per generare informazioni biologiche in un'ampia varietà di tipi di campioni chiarendo strutture ad alta risoluzione di complessi isolati5,6 tra cui virus7,8, proteine di membrana9,10, assemblaggi elicoidali11 e altri complessi macromolecolari dinamici ed eterogenei12,13, le cui dimensioni variano in ordine di grandezza (da 39 kDa Da 14,15 a decine di megadaltoni). Qui viene descritto un protocollo per una pipeline standard per cryoEM SPA dal campione alla struttura.
Prima di intraprendere questa pipeline, un campione purificato dovrebbe essere sottoposto ad analisi biochimiche per valutarne le possibilità di successo a valle. La preparazione di un campione adatto è probabilmente la più grande barriera alla SPA, in particolare per i complessi transitori ed eterogenei (sia compositivi che conformazionali). La preparazione del complesso macromolecolare dovrebbe contenere il minor numero possibile di contaminanti, a concentrazione sufficiente per produrre molte particelle in ogni micrografia crioEM e in una composizione tampone adatta all'analisi crioEM. Alcuni costituenti tampone, tra cui saccarosio, glicerolo e alte concentrazioni di sali (~> 350 mM, a seconda delle dimensioni del campione, delle proprietà e di altri componenti tampone) possono interferire con il processo di vitrificazione o ridurre il rapporto segnale-rumore nelle immagini, ostacolando la determinazione della struttura16.
Tipicamente, come minimo, la cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) e l'analisi del gel SDS-PAGE dovrebbero essere utilizzate per valutare la purezza del campione17,18, ma il dicroismo circolare, i saggi funzionali, la SEC accoppiata con la diffusione della luce multi-angolo e i saggi di stabilità termica sono tutti strumenti utili per l'analisi qualitativa dei preparati complessi macromolecolari prima dell'analisi crioEM. Tuttavia, i risultati di queste analisi biochimiche possono fornire poche informazioni sull'eterogeneità strutturale del campione e sul suo comportamento su una griglia crioEM. Per questo motivo, la macchia negativa EM viene abitualmente utilizzata come strumento rapido, economico e potente per valutare l'eterogeneità compositiva e conformazionale, e quindi un buon modo per accertare quale frazione di eluizione da una purificazione è più promettente, o per lo screening di diverse composizioni tampone19,20. Una volta identificato un campione promettente, possiamo procedere alla pipeline CRYOEM SPA. La macchia negativa non sempre si allinea con i risultati successivi osservati in crioEM; a volte un campione sembra povero di macchia negativa ma migliora se visto nel ghiaccio vitreo in crioEM. Al contrario, a volte i campioni sembrano eccellenti durante le fasi di colorazione negativa, ma richiedono un'ulteriore ottimizzazione significativa quando si passa al crioEM. Tuttavia, nella maggior parte dei casi la macchia negativa fornisce un'utile fase di controllo della qualità.
Vitrificazione L'ambiente ostile all'interno del sistema a vuoto del microscopio elettronico provoca sia disidratazione che danni da radiazioni a campioni biologici non fissati21. Pertanto, per visualizzare il campione in uno stato nativo, il campione biologico deve essere conservato prima dell'imaging. Per i preparati purificati di complessi macromolecolari, la vitrificazione è il metodo di scelta per consentirne la visualizzazione tramite crioEM preservando i dettagli atomici del complesso. La scoperta della vitrificazione come metodo di preparazione del campione è stato un progresso fondamentale nella microscopia elettronica di campioni biologici, per il quale Dubochet è stato riconosciuto nel Premio Nobel per la Chimica 2017. La vitrificazione del campione comporta la creazione di un sottile strato di soluzione contenente il campione di interesse, tipicamente di decine di nm di spessore, sospeso su un supporto a griglia crioEM. Il film sottile viene quindi congelato estremamente rapidamente in un criogeno come l'etano liquido a ~ -175 ° C. La velocità di congelamento è di ~ 106 ° C / s, abbastanza veloce da formarsi ghiaccio amorfo o vitreo, sospendendo il campione in un film sottile e solido22.
La variabile iniziale da considerare è il supporto della griglia cryoEM scelto23. Una griglia EM è tipicamente costituita da un film di carbonio amorfo con perforazioni (regolari o irregolari), su una struttura di supporto. La struttura di supporto è tipicamente una griglia metallica circolare di 3,05 mm di diametro, solitamente realizzata in rame, ma possono essere utilizzati altri metalli come l'oro o il molibdeno (che ha proprietà di espansione termica preferite24). A volte, un ulteriore supporto sottile e continuo viene applicato attraverso la griglia, come grafene, ossido di grafene o uno strato di carbonio amorfo sottile (~ 1-2 nm). Mentre le griglie crioEM standard (più comunemente rame a maglie 400-200 con un supporto in carbonio perforato (fori rotondi da 1,2 μm separati da 1,3 μm (r1,2 / 1,3) o 2 μm separati da 2 μm di carbonio (r2/2)) - sebbene siano disponibili molti modelli diversi) sono state utilizzate nella stragrande maggioranza delle strutture segnalate fino ad oggi, sono state segnalate nuove tecnologie a griglia con conduttività migliorata e ridotto movimento del campione25 . Le griglie selezionate sono sottoposte a un trattamento di pulizia a scarica di bagliore/plasma per renderle idrofile e suscettibili di applicazione su campione26.
Dopo la scarica di bagliore, la fase successiva è la formazione di film sottili. Questo film sottile è più comunemente formato utilizzando carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso dalla griglia. Mentre questo può essere eseguito manualmente, sono disponibili in commercio numerosi dispositivi di congelamento a tuffo, tra cui Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) e CP3 (Gatan). Con questi dispositivi, ~ 3-5 μL di campione in soluzione viene applicato alla griglia EM, seguito da un'eliminazione della soluzione in eccesso utilizzando carta da filtro. La griglia, con un film sottile sospeso su di essa, viene quindi immersa in etano liquido raffreddato da azoto liquido (LN2) a ~ -175 ° C. Una volta congelata, la griglia viene mantenuta a una temperatura inferiore al punto di devitrificazione (-137 °C) prima e durante l'imaging.
Screening dei campioni e raccolta dei dati Dopo la vetrificazione di una griglia crioEM, la fase successiva consiste nello schermare la griglia per valutarne la qualità e determinare se la griglia è adatta per procedere alla raccolta di dati ad alta risoluzione. Una griglia crioEM ideale ha ghiaccio vitreo (opposto al ghiaccio cristallino) con lo spessore del ghiaccio appena sufficiente per ospitare la dimensione più lunga del campione, assicurando che il ghiaccio circostante contribuisca il minor rumore possibile all'immagine risultante. Le particelle all'interno del ghiaccio dovrebbero avere una dimensione e (se nota) forma coerente con la biochimica, e idealmente essere monodisperse con una distribuzione casuale degli orientamenti delle particelle. Infine, la griglia dovrebbe avere abbastanza aree di qualità sufficiente per soddisfare la lunghezza di raccolta dei dati desiderata. A seconda del campione, questo può richiedere molte iterazioni di vetrificazione e screening fino a quando non vengono prodotte griglie ottimali. Sia fortunatamente che sfortunatamente, ci sono una vasta gamma di variabili che possono essere testate empiricamente per alterare la distribuzione delle particelle sulle griglie crioEM (recensito in16,27). In questo manoscritto sono mostrati i risultati rappresentativi per un progetto di proteina di membrana10.
Una volta identificata una griglia adatta, la raccolta dei dati può procedere. Diversi modelli di microscopi elettronici a criotrasmissione per campioni biologici sono ottimizzati per raccogliere dati ad alta risoluzione in modo automatizzato. In genere, i dati vengono raccolti su sistemi a 300 kV o 200 kV. La raccolta automatizzata dei dati può essere ottenuta utilizzando software tra cui EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 e SerialEM31,32. Una raccolta automatizzata di dati con rilevatori moderni in genere si traduce in terabyte (TB) di dati grezzi in un periodo di 24 ore (i set di dati medi sono ~ 4 TB di dimensione).
A causa delle restrizioni COVID-19 in vigore su gran parte del mondo (momento della scrittura dicembre 2020), molte strutture di microscopia sono passate a offrire l'accesso remoto. Una volta che le griglie sono state caricate nel caricatore automatico di un microscopio, l'acquisizione dei dati può essere condotta da remoto.
Elaborazione delle immagini e costruzione di modelli Laddove una sessione di raccolta dati può essere in genere di 0,5-4 giorni, l'elaborazione successiva delle immagini può richiedere molte settimane e mesi, a seconda della disponibilità di risorse di elaborazione. È standard per le fasi iniziali di elaborazione delle immagini, vale a dire la correzione del movimento e la stima della funzione di trasferimento del contrasto (CTF) che avvengono "al volo" 33,34. Per l'elaborazione a valle, ci sono una pletora di suite software disponibili. Le particelle vengono "raccolte" ed estratte dalle micrografie35,36. Una volta estratte le particelle, un protocollo standard sarebbe quello di elaborare le particelle attraverso diversi cicli di classificazione (sia in due dimensioni (2D) che in tre dimensioni (3D) e / o focalizzate su specifiche regioni di interesse) per raggiungere un sottoinsieme omogeneo di particelle. Questo sottoinsieme omogeneo di particelle viene quindi mediato insieme per produrre una ricostruzione 3D. A questo punto i dati vengono spesso corretti ulteriormente per produrre la mappa di massima qualità possibile, ad esempio attraverso il perfezionamento CTF, le correzioni di distorsione37 e la lucidatura bayesiana38 . Il risultato di questa elaborazione delle immagini è una mappa crioEM 3D del campione biologico di interesse. L'intervallo di risoluzione raggiunto in un esperimento automatizzato "standard" di singola particella da una griglia di qualità sufficiente, con dati raccolti su un sistema di microscopio a 300 kV è in genere compreso tra 10 Å e 2 Å a seconda delle dimensioni e della flessibilità del complesso proteico. Con un campione ideale, risoluzioni di ~ 1,2 Å sono state raggiunte utilizzando i flussi di lavoro SPA5. Mentre questo protocollo descrive in dettaglio i passi verso l'ottenimento di una mappa di densità EM, una volta che questo è in mano può essere ulteriormente interpretato attraverso l'adattamento e la raffinazione di un modello proteico (se la risoluzione è < 3,5 Å) o la costruzione de novo39. I dati associati agli esperimenti di determinazione della struttura possono essere depositati in archivi pubblici online, tra cui mappe di densità EM (Electron Microscopy Data Bank)40, coordinate atomiche risultanti (Protein Data Bank)41 e set di dati grezzi (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
In questo protocollo, il complesso proteico di membrana esterna RagAB (~340 kDa) di Porphyromonas gingivalis viene utilizzato come esempio di complesso macromolecolare10 (EMPIAR-10543). Per coloro che sono nuovi a cryoEM, il supporto per i campioni attraverso questa pipeline dal campione alla struttura è disponibile, soggetto a revisione tra pari, attraverso schemi di accesso finanziati come iNEXT Discovery e Instruct.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

La crioscopia elettronica (cryoEM) è una potente tecnica per la determinazione della struttura di complessi macromolecolari, tramite analisi di singole particelle (SPA). Il processo complessivo prevede i) la vetrificazione del campione in un film sottile supportato su una griglia crioEM; ii) screening del campione per valutare la distribuzione delle particelle e la qualità del ghiaccio; iii) se la griglia è idonea, raccogliendo un singolo dataset di particelle per l'analisi; e iv) elaborazione delle immagini per produrre una mappa di densità EM. In questo protocollo viene fornita una panoramica per ciascuno di questi passaggi, con particolare attenzione alle variabili che un utente può modificare durante il flusso di lavoro e alla risoluzione dei problemi comuni. Con il funzionamento del microscopio remoto che sta diventando standard in molte strutture, verranno descritte le variazioni sui protocolli di imaging per assistere gli utenti in un funzionamento efficiente e l'imaging quando l'accesso fisico al microscopio è limitato.

Durante lo screening, le griglie possono essere scartate nella fase dell'atlante, dove le caratteristiche risolte a basso ingrandimento contrassegnano la griglia come non adatta per l'acquisizione dei dati. Ad esempio, se una griglia è stata soggetta a danni meccanici significativi con la maggior parte dei quadrati della griglia rotti (Figura 2A) o dove la griglia sembra essere "asciutta", senza ghiaccio vitreo (Figura 2B). Tali griglie sono in genere identificabili in quanto i bordi dei quadrati della griglia appaiono nitidi e distinti. Nella maggior parte delle griglie realizzate utilizzando il dispositivo di congelamento a tuffo, si osserva un gradiente di ghiaccio (Figura 2C, D). La distribuzione delle particelle, a seconda del campione di interesse, può variare notevolmente con lo spessore del ghiaccio e quindi si consiglia di vagliare una gamma di quadrati della griglia per valutare la distribuzione delle particelle. Gli strumenti sono stati implementati all'interno del software EPU durante la fase di screening dell'atlante per aiutare l'utente a identificare quadrati di griglia di spessore di ghiaccio simile o diverso, che possono essere particolarmente utili per gli utenti che sono nuovi all'esame delle griglie crioEM (Figura 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Figura 2: Esempi di montaggi "atlante" a basso ingrandimento da sessioni di screening. A) Una griglia che ha subito danni significativi con la maggior parte dei quadrati della griglia rotti - inadatti alla raccolta. B) Una griglia asciutta senza ghiaccio vitreo - inadatta alla raccolta. C) Una griglia che dimostra un gradiente di ghiaccio con ~ 50% della griglia utilizzabile. D) Un gradiente di ghiaccio con ~ 33% della griglia utilizzabile. Sia C che D, sono adatti per la raccolta dei dati se i quadrati della griglia utilizzabili hanno uno spessore del ghiaccio appropriato per la raccolta e ci sono abbastanza aree di acquisizione per soddisfare la durata minima di una raccolta (ad esempio, 24 h) E) Un atlante di esempio con gamma di spessori di ghiaccio. F) Lo stesso atlante presentato in E ma con, quadrati di griglia classificati e colorati dal software EPU in base allo spessore del ghiaccio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Quando si esegue lo screening della distribuzione delle particelle, assicurarsi che i parametri di imaging, come l'ingrandimento e la dose totale di elettroni, siano simili a quelli che si prevede di utilizzare durante l'acquisizione dei dati al fine di fornire un quadro accurato dei risultati attesi. Durante lo screening, una distribuzione ideale delle particelle è monodispersa con una gamma di orientamenti delle particelle visibili (a seconda del campione e delle conoscenze esistenti della morfologia della particella, questo può essere difficile da accertare) (Figura 3A). Il ghiaccio dovrebbe essere il più sottile possibile mentre ospita le particelle più grandi, se il ghiaccio è troppo sottile può sciogliersi quando illuminato con il fascio di elettroni. Ciò causa un movimento eccessivo nella micrografia e le aree che mostrano questa caratteristica dovrebbero essere evitate (Figura 3B). Dall'esperienza collettiva, questo effetto è più comunemente osservato quando c'è detersivo nel tampone. Ciò può causare ghiaccio molto sottile al centro del foro e quindi le particelle possono essere fisicamente escluse e forzate verso il bordo. Questo effetto è osservato nella Figura 3C, ma in questo caso non è un esempio estremo e queste immagini contribuirebbero comunque utilmente a un set di dati. Infine, il ghiaccio deve essere vitreo; escludere dall'acquisizione dei dati qualsiasi area della griglia (o delle griglie) in cui la maggior parte o tutte le immagini scattate mostrano ghiaccio cristallino (Figura 3D). Spesso, il ghiaccio non vitreo viene osservato ai margini dei quadrati della griglia. Per ulteriori informazioni, i lettori rimandano a revisioni dettagliate delle variabili che possono essere modificate durante la vitrificazione della griglia16 e alle descrizioni del comportamento delle particelle nell'ambiente a film sottile46,47.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Figura 3: Micrografie rappresentative che mostrano diverse distribuzioni di particelle. A) Una distribuzione "ideale" di particelle monodisperse che adottano una gamma di orientamenti. B) Ghiaccio eccessivamente sottile nel mezzo del foro che si deforma dopo l'esposizione al fascio di elettroni causando un movimento eccessivo nella micrografia. Questo effetto è più spesso osservato quando il detergente è presente nel tampone C) Dove il ghiaccio è più sottile al centro del foro, questo esclude fisicamente le particelle dal centro, causando l'affollamento delle particelle verso il bordo del foro. In questo caso non è abbastanza estremo da impedire che queste immagini siano utili, ma suggerisce che vale la pena schermare aree leggermente più spesse. D) Il ghiaccio non è vitreo, i dati non dovrebbero essere raccolti su aree che assomigliano a questa micrografia di esempio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'elaborazione delle immagini al volo può aiutare a rilevare errori e problemi con l'acquisizione dei dati e quindi è sempre consigliata ove possibile. Ad esempio, un movimento eccessivo all'interno dei micrografi può indicare che la turbopompa del caricatore automatico è attiva o che i dati vengono raccolti su un quadrato della griglia incrinato in cui il ghiaccio si muove in modo significativo nel fascio di elettroni, indicando che il quadrato della griglia dovrebbe essere saltato. Al volo la stima CTF può rivelare circostanze in cui viene applicato un punto di messa a fuoco positivo (piuttosto che defocus) (in cui vengono utilizzati programmi di stima CTF e parametri per trovare questi punti) e determinare lo sfasamento in cui viene utilizzata una piastra di fase Volta48. Le pipeline di elaborazione delle immagini al volo spesso includono un riepilogo grafico dei dati (Figura 4A) per rendere più facile per gli utenti valutare rapidamente la qualità delle micrografie e decidere se sono necessarie modifiche alla raccolta dei dati.
La selezione delle particelle dalle micrografie, evitando al contempo "falsi positivi" come la contaminazione o la pellicola di supporto della griglia può richiedere un'ottimizzazione. Tuttavia, i raccoglitori di particelle come crYOLO spesso funzionano sufficientemente bene utilizzando parametri predefiniti per un "primo passaggio" dei dati (Figura 4B), consentendo la progressione verso la media di classe 2D dove può essere più facile valutare la qualità dei dati e la probabilità di successo a valle. Per la maggior parte dei progetti, la classificazione 2D di ~ > particelle 10k dovrebbe iniziare a rivelare classi che hanno dettagli di struttura secondaria. Per passare al 3D, la fase di classificazione 2D dovrebbe in genere rivelare classi che rappresentano una gamma di orientamenti delle particelle. Se viene rivelato un orientamento preferito, potrebbero essere necessarie più iterazioni di preparazione del campione16 o un'ulteriore acquisizione di dati con il campione inclinato49. Tutte le classi che mostrano dettagli della struttura secondaria dovrebbero essere scelte per portare avanti l'analisi 3D, mentre le particelle "spazzatura" vengono scartate (Figura 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Figura 4: Fasi iniziali di elaborazione delle immagini. A) Output da uno script di elaborazione delle immagini "al volo". B) Micrografia di esempio (a sinistra) con particelle opportunamente auto-selezionate identificate utilizzando il modello generale crYOLO (a destra, con particelle delimitate da quadrati rossi) Le barre di scala (bianche) sono 50 nm. C) Risultati della classificazione 2D che mostrano le classi che sono state scartate nel quadrato rosso e le classi da cui sono state selezionate le particelle per un'ulteriore elaborazione in verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Un piccolo sottoinsieme di particelle può essere utilizzato per generare un modello iniziale (Figura 5A). Questo modello iniziale può quindi essere utilizzato come modello di partenza nella classificazione e nel perfezionamento 3D. Nel caso di RagAB, il set di dati conteneva tre conformisti distinti che possono essere separati durante la classificazione 3D (Figura 5B). Le particelle che contribuiscono a ciascuna di queste classi possono quindi essere trattate in modo indipendente e utilizzate per perfezionare una mappa di densità EM che può quindi essere soggetta a ulteriori interpretazioni e costruzione di modelli.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Figura 5: Generazione di una mappa di densità EM 3D. A) Tipico modello iniziale generato utilizzando RELION. B) Classificazione 3D su 5 classi che mostrano la separazione delle particelle in tre distinti stati conformazionali: aperto-aperto (verde), aperto-chiuso (blu), chiuso-chiuso (viola). C) Processo di creazione della maschera. La mappa dal perfezionamento 3D (a sinistra) dovrebbe essere visualizzata in chimera. Il visualizzatore di volume può quindi essere utilizzato per identificare la soglia più bassa alla quale la mappa è priva di densità disarticolata e rumorosa (al centro). Questo valore di soglia viene immesso come soglia di binarizzazione iniziale nel processo di creazione della maschera RELION. Un esempio di output della maschera è mostrato in grigio (a destra). D) Mappa di densità EM ad alta risoluzione dello stato aperto-chiuso di RagAB (EMD-10245), filtrata e colorata per risoluzione locale (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

La determinazione della struttura dei complessi macromolecolari utilizzando il crioEM è diventata di routine per alcune classi di proteine e complessi. Qui, questa pipeline è riassunta (preparazione del campione, screening, acquisizione ed elaborazione dei dati) e i lettori sono indirizzati verso ulteriori risorse dettagliate e variabili che possono essere modificate nel caso di campioni più impegnativi.

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

L'analisi crio-EM a singola particella è diventata una tecnica di routine nella cassetta degli attrezzi del biologo strutturale applicabile a una vasta gamma di campioni tra cui proteine di membrana, fibrille amiloidi, proteine leganti gli acidi nucleici e virus. Una volta completata la preparazione del campione e caricate le griglie nel microscopio, la raccolta dei dati può essere effettuata da remoto in molte strutture crio-EM come l'Astbury Biostructure Laboratory e l'eBIC. I principali ostacoli al successo della determinazione della struttura si trovano spesso nelle fasi di preparazione del campione e di screening della griglia con più iterazioni a volte richieste attraverso questo processo.Qui, dimostreremo lo screening remoto della griglia e l'acquisizione di dati a singola particella. Nella scheda del caricatore automatico dell'interfaccia utente del microscopio, selezionare la finestra di dialogo delle opzioni utilizzando la freccia e premere il pulsante dell'inventario. Questo controllerà sequenzialmente ogni posizione nella cassetta per determinare se è presente una cartuccia.L'inventario verrà eseguito su ogni slot in sequenza. Quando tutti gli slot occupati sono mappati, l'inventario si fermerà. Evidenziare la griglia da trasferire nella colonna del microscopio e fare clic su Carica.L'etichetta dello slot passerà dal blu al giallo una volta che la griglia sarà stata caricata correttamente sul palco. Per schermare le griglie, aprire il software EPU. Nella pagina di preparazione, seleziona l'ottica di acquisizione e le impostazioni, quindi seleziona il preset dell'atlante dal menu a discesa.Scegliere i preset di impostazione del fascio appropriati e premere set per spingere i parametri al microscopio. Premere per aprire le valvole a colonna e inserire lo schermo antinfluenzale. Verificare che un raggio sia visibile e sufficientemente diffuso e centrato per coprire il rilevatore.Se necessario, passare a una regione più sottile della griglia utilizzando il joystick o i pannelli manuali virtuali per controllare i movimenti del palco in X e Y.Sollevare lo schermo antinfluenzale e scattare un'immagine utilizzando il pulsante di anteprima in EPU. In EPU, vai alla pagina dell'atlante e premi nuova sessione. Selezionare il formato immagine MRC e immettere un nome e una posizione di cartella adatti per salvare la sessione di screening, quindi fare clic su Applica.Seleziona screening dal menu a sinistra. Seleziona le caselle di controllo accanto a ciascuna griglia per acquisire un montaggio dell'atlante, quindi avvia la sessione di screening in EPU. Viene acquisito un atlante per ogni griglia controllata e i quadrati della griglia disponibili vengono elencati al completamento.Ogni atlante può essere visualizzato evidenziandolo nella pagina di screening. Al termine, rivedere gli atlanti raccolti e identificare le griglie adatte per valutare la qualità del campione a ingrandimenti più elevati. Evidenziare la griglia scelta nel menu di screening EPU e fare clic su Carica campione.Dal menu di screening dell'atlante, selezionare la griglia attualmente caricata e spostare lo stage in un quadrato della griglia contenente i fori riempiti facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione desiderata sull'immagine della griglia e selezionando sposta lo stage qui. Tornate alla pagina di preparazione dell'EPU e selezionate il preset quadrato della griglia. Apri la pagina delle funzioni automatiche dell'EPU ed esegui l'inclinazione auto-eucentrica per stadio con il quadrato della griglia preimpostato per spostare il campione all'altezza eucentrica.Nella preparazione dell'EPU, acquisire una nuova immagine di anteprima quadrata della griglia. Osservate i valori di grigio attraverso fori diversi che indicano diversi spessori di ghiaccio. Spostate lo stage su un foro facendo clic con il pulsante destro del mouse e spostate lo stage qui.Selezionate il foro o l'altezza eucentrica preimpostata, quindi fate clic su Anteprima ( Preview). Selezionare il preset di acquisizione dati e impostare un ingrandimento che consenta una facile identificazione delle particelle. Impostare l'offset di sfocatura su negativo da tre a cinque micrometri.Scorrere i passaggi per rivalutare una gamma di spessori di ghiaccio per la distribuzione delle particelle, l'orientamento e la contaminazione attraverso la griglia. A seconda della disponibilità del microscopio, continuare direttamente alla raccolta dei dati o le griglie possono essere rimosse dal microscopio per la raccolta futura, anche in altri siti. Raccogliere un atlante se non è disponibile dallo screening impostando le impostazioni dell'atlante e selezionando la griglia per acquisire l'atlante.Acquisisci l'atlante e fai clic sulla posizione della griglia per vedere l'output. Una volta completato l'atlante, definire ciascuno dei preset di impostazione del fascio in base alle esigenze sperimentali del progetto. Eseguire calibrazioni di spostamento dell'immagine.Configurare la sessione EPU selezionando la configurazione della sessione della pagina EPU e quindi selezionando nuova sessione o nuova dalle preferenze. Dopo aver selezionato la nuova sessione, apparirà un popup che fornisce un'opzione per utilizzare le impostazioni precedenti. Le impostazioni verranno caricate automaticamente dalla sessione EPU precedente a quella corrente.In alternativa, selezionare nuovo dalle preferenze e selezionare un file con le preferenze salvate per precaricare queste informazioni nell'EPU corrente. Inserisci il nome della sessione con qualcosa di informativo. In tipo, selezionare manuale.Per la modalità di acquisizione, selezionare il centraggio accurato del foro o l'acquisizione più rapida se la raccolta di spostamento dell'immagine libera da aberrazione è disponibile e desiderata. Seleziona il formato immagine desiderato, quindi seleziona la cartella di archiviazione e EPU creerà una directory con il nome della sessione. Selezionate la griglia appropriata in base alla quale viene utilizzata la spaziatura dei fori della griglia e premete applica (Apply).Selezionare un quadrato della griglia iniziale e impostare un modello di acquisizione. Vai alla selezione quadrata. Se tutti i quadrati sono verdi, fai clic su Deseleziona tutto in alto a sinistra.Aprire i riquadri facendo clic con il pulsante destro del mouse e quindi selezionando Apri riquadro. Aggiungere o scegliere un quadrato griglia facendo clic su Seleziona, quindi facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando Sposta lo stage nel quadrato della griglia. Vai a Selezione fori e premi auto-eucentrico.Attendere fino a quando non viene scattata un'immagine quadrata della griglia. Se la funzione automatica non riesce, ciò potrebbe essere dovuto al fatto che l'altezza è significativamente disattivata. Può essere regolato manualmente utilizzando lo schermo antinfluenzale con ingrandimento quadrato della griglia.Per misurare le dimensioni dei fori, spostate e regolate i cerchi gialli in modo che siano sopra i fori con dimensioni e spaziatura corrette. Premere trova fori. Controllare che i fori siano stati trovati correttamente.In caso contrario, modificate le dimensioni del foro e premete nuovamente Trova fori. Se questo processo fallisce costantemente, considera la possibilità di passare a un numero inferiore o a una dimensione del punto più luminoso all'ingrandimento quadrato della griglia. Utilizzare l'istogramma della qualità del ghiaccio del filtro a destra per regolare la selezione dei fori.Questo può essere utile per escludere aree con ghiaccio spesso e ghiaccio sottile. Questo sarà ricordato per i futuri quadrati della griglia selezionati durante la sessione. Ottimizzate la selezione dei fori con gli strumenti del menu di selezione in alto.Ad esempio, fate clic su Rimuovi fori vicino alla barra della griglia. Vai alla definizione del modello e premi acquisisci. Fate clic su Trova (Find) e sul foro centrale (Center Hole).Modificare il ritardo dopo lo spostamento dello stadio e il ritardo dopo i tempi di spostamento dell'immagine a uno o cinque secondi, quindi, se disponibile, controllare che il valore massimo di spostamento dell'immagine sia quello desiderato. Fai clic su Aggiungi area di acquisizione e fai clic in un punto qualsiasi dell'immagine. Spostare l'area di acquisizione nella posizione desiderata.Aggiungi l'intervallo di sfocatura in alto a destra. Un tipico elenco di defocus per un progetto di proteina di membrana è negativo da 0,8 a tre micrometri negativo, quindi aggiungere altre aree di acquisizione, disponendole in modo tale che le aree di acquisizione non siano doppiamente esposte con il raggio. Fai clic su Aggiungi area di messa a fuoco automatica e fai clic in un punto qualsiasi dell'immagine.Spostate l'area di messa a fuoco automatica sul carbonio che circonda un foro. La pratica standard è quella di mettere a fuoco automaticamente dopo la centratura quando si utilizza AFIS o ogni cinque a 15 micrometri a seconda della variazione di altezza Z attraverso il quadrato. Fare clic su Aggiungi area di misurazione della deriva.Misurazione della deriva eseguita una volta per quadrato di griglia con una soglia impostata di 0,05 nanometri al secondo come impostazione standard. L'area di misurazione della deriva può sovrapporsi direttamente all'area di messa a fuoco automatica. Assicurati che né la deriva né l'area di messa a fuoco automatica si sovrappongano a un'area di acquisizione.Torna alla selezione quadrata e seleziona i quadrati per l'acquisizione sulla griglia. Utilizzare il numero di aree di acquisizione e il tasso di acquisizione dati previsto per prevedere quante aree di acquisizione sono necessarie. Quando tutti i quadrati desiderati sono selezionati, premere Prepara tutti i quadrati.Una volta raccolto ogni quadrato, naviga tra i quadrati della griglia e perfeziona i fori usando il pennello di selezione. Spostatevi in una posizione dello stage sopra il campione e utilizzate le funzioni automatiche per impostare l'altezza eucentrica. Eseguire allineamenti al microscopio utilizzando il software del microscopio come descritto in precedenza e nel testo.Eseguire l'allineamento senza coma all'interno delle funzioni automatiche prima di reinserire e centrare l'apertura dell'obiettivo e correggere l'astigmatismo dell'obiettivo con EPU. Assicurarsi che entrambi gli allineamenti convergano su valori adatti. Prima di iniziare l'acquisizione automatica, assicurarsi che la turbopompa del caricatore automatico sia spenta e che l'apertura dell'obiettivo sia inserita, se necessario.Nell'acquisizione automatizzata, premere start run per avviare l'acquisizione automatica dei dati. Utilizzando questo protocollo, le griglie rotte o asciutte possono essere vagliate e scartate nella fase dell'atlante. Un gradiente di ghiaccio è osservato attraverso la maggior parte delle griglie.Durante lo screening, una distribuzione ideale delle particelle viene monodispersa con una gamma di orientamenti delle particelle visibili. Se il ghiaccio è troppo sottile, può sciogliersi quando illuminato con il fascio di elettroni, causando un movimento eccessivo nella micrografia. Questo è più comunemente osservato quando c'è detersivo nel tampone.Il ghiaccio deve essere vitreo, quindi le aree della griglia in cui la maggior parte delle immagini mostrano ghiaccio cristallino sono state escluse. È stato incluso un riepilogo grafico dei dati per valutare la qualità delle micrografie e decidere se sono necessarie modifiche alla raccolta dei dati. I selettori di particelle come crYOLO funzionano sufficientemente bene per un primo passaggio dei dati, consentendo la progressione verso la media di classe 2D.Le classi che mostrano i dettagli della struttura secondaria dovrebbero essere scelte per l'analisi 3D mentre le particelle spazzatura dovrebbero essere scartate. Un sottoinsieme di particelle può essere utilizzato per generare un modello iniziale per la classificazione e il perfezionamento 3D. Nel caso di RagAB, il set di dati conteneva tre conformisti distinti che possono essere separati durante la classificazione 3D.È importante ricordare che il successo nell'acquisizione dei dati e nelle successive fasi di analisi delle immagini dipende dall'ottenimento e dall'identificazione di griglie ben ottimizzate durante la fase di screening. Una volta ottenuta una mappa di densità EM 3D, può essere ulteriormente interpretata attraverso l'adattamento e la raffinazione di un modello proteico o la costruzione di un modello atomico de novo. L'analisi crio-EM a singola particella consente la determinazione strutturata di molti bersagli che in precedenza non erano possibili.In particolare, questi flussi di lavoro sono stati recentemente utilizzati per risolvere le strutture delle macromolecole correlate a COVID-19.

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