Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
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この研究は、欧州委員会のHorizon 2020プログラムが資金を提供するiNEXT-Discovery(グラント871037)によって支援されました。J B. R. ホワイトはウェルカムトラスト(215064/Z/18/Z)から資金提供を受けています。FEIタイタンクリオス顕微鏡は、リーズ大学(UoL ABSL賞)とウェルカムトラスト(108466/Z/15/Z)によって資金提供されました。私たちは、彼の顕微鏡写真分析スクリプトの使用のためのM Iadanzaに感謝します。我々は、ウェルカム・トラスト、MRC、BBRSCが出資する英国の電子バイオイメージングセンター(eBIC)のクライオEM施設へのアクセスと支援に対するダイヤモンド光源を認める。

利益相反は報告されません。

このプロトコルでは、ルーチンSPAに適した標本に適用可能な基本的なパイプラインを説明しました。薄膜形成およびガラス化のこのフィルターペーパーブロッティング方法は、これまでのSPAプロジェクトの大半での使用を考えると間違いなく成功しているが、それは多くの欠点を伴う。これらは、試料の浪費、薄膜を形成し、試料を凍結するために必要な遅いタイムスケール(秒)、報告された再現性27を報告し、過剰な液体50を消すために濾紙を使用することの悪影響を報告した。近年、薄膜生産の再現性を向上させる新技術が開発されました51,52。サンプル用途とガラス化の間の時間を短縮する他の技術が開発されています53,54,55。薄膜形成のためのフィルターペーパーベースの方法は、執筆時点でSPA cryoEMサンプル調製の最もユビキタスな方法のままですが、これらの新しい技術は、グリッドガラス化の効率と再現性の面で様々な利点をもたらし、硝化前に時間分解能や急速な混合などの追加の実験次元をもたらす新しい機会を生み出す可能性があります。
ほとんどのユーザーのためのグリッドスクリーニングのプロセスは、現在、粒子分布を評価するためにグリッド全体で高倍率画像を撮影し、低倍率アトラスの取得を含む定性的なプロセスです。これは一部の種類の標本では十分に堅牢なアプローチですが、例えば小さな(<200 kDa)サンプルや低解像度の形態によって粒子分布の範囲が存在する場合、研究者が画像を画像化しようとしているものや好ましい向きを持っている場合、検体が実際に望んでいる場合、目で評価することは困難です。一部のプロジェクトでは、例えば、リガンドが結合している場所や、サンプルがスクリーニングされている場所など、標本が望ましいかどうかを判断して、小さな(例えば、10 kDa)サブユニットがまだ複合体に関連しているかどうかを評価することは不可能です。これらのプロジェクトでは、2D分類、あるいは3D分類や絞り込みまでを進めることができる「短い」0.5-1-hコレクションと組み合わせたデータ分析のための完全に自動化されたパイプラインは、より長いコレクションが保証されているかどうかを効率的に判断するのに役立ちます。これらのパイプラインはまだ開発中であり、現在のところ広く実装されていませんが、特に困難な標本のために、cryoEMグリッドスクリーニングの効率を向上させる可能性があります。
直接電子検出器の改良、画像シフトデータ収集などの画像処理の進歩と合わせて顕微鏡の改変により、データ取得時に生成される画像のスループットと品質が向上しています。このデータ収集率の増加は、多数のデータが取得される前にcryoEMグリッドを徹底的にスクリーニングする必要性を強調しています。
CryoEM SPAは本当に主流の構造生物学技術となっており、多くの場合、異機種および不安定な高分子複合体のようないくつかのクラスの標本に対する「行く」アプローチとなっています。ここでのプロトコルは、SPAパイプラインの基本的な概要を説明していますが、ここで説明する各セクション(グリッドガラス化とスクリーニング、cryoEMと画像処理)は、それ自体のトピックであり、SPAプロジェクトの開発中に探査する価値があります。サンプル調製および顕微鏡技術が進歩し、新しい画像処理アルゴリズムとアプローチがオンラインになるにつれて、SPAは引き続きパイプラインとして発展し、研究者が複雑な生物学的システムに関する洞察を得るのを助けます。

単粒子クライオエム 分子レベルで生命を調べるには、構造を理解する必要があります。NMR、X線結晶学、質量分析、電子顕微鏡(EM)など、タンパク質構造をプローブする多くの技術が利用可能です。現在までに、タンパク質データバンク(PDB)に堆積した構造の大部分は、X線結晶学を用いて解決されてきました。しかし、2012年から、クライオ電子顕微鏡(cryoEM)はタンパク質構造決定の主流の技術となり、その使用が劇的に増加しました。電子顕微鏡データバンク(EMDB)に堆積したEMマップの総数(2020年12月現在)は、2012年の1,566台に対して13,421台でした(図1、www.ebi.co.uk)。2012年には、PDBに堆積したクライオEM密度マップでモデル化された原子座標の数はわずか67でしたが、2020年12月現在、これまでに2,309の構造物が堆積し、35倍に増加しました。「分解能革命」と呼ばれる「分解革命」とも呼ばれるクライオEM密度マップの質と量のこの根本的な成長は、複数の分野での進歩の合体によって引き起こされた:直接電子検出器として知られているイメージングのための新しいカメラの開発。新しいソフトウェア。そしてより安定した顕微鏡2、3、4。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> 図1:2012年から2020年12月までのEMDBへの累積提出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank"></a>
単一粒子分析(SPA)は、ウイルス7,8、膜タンパク質9,10、ヘリカルアセンブリ11および他の動的および異種の高分子複合体12,13を含む単離された複合体の高解像度構造を解明することによって、多種多様なサンプルタイプの生物学的洞察を生成する強力なツールです。14,15から数十メガダルトン)。ここでは、サンプルから構造までのクライオエム SPA の標準パイプラインのプロトコルについて説明します。
このパイプラインに着手する前に、精製されたサンプルは、下流の成功の可能性を評価するために生化学的分析を受ける必要があります。適切なサンプルの調製は、特に一過性および異種(組成および立体構造の両方)複合体に対するSPAにとって最も大きな障壁である。高分子複合体製剤は、各クライオEM顕微鏡写真で多くの粒子を得るのに十分な濃度で、かつcryoEM分析に適した緩衝組成物において、できるだけ少ない汚染物質を含むべきである。特定の緩衝成分は、スクロース、グリセロールおよび高い(サンプルサイズ、特性および他の緩衝剤の構成物に応じて、塩の350mM濃度を>する)、ガラス化のプロセスを妨げるか、または画像の信号対雑音比を減少させ、構造決定を妨げる。
一般的に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)およびSDS-PAGEゲル分析は、サンプル純度17,18を評価するために使用されるべきであるが、循環二色化、機能的アッセイ、SECとマルチアングル光散乱、および熱安定性アッセイは、クライオエム分析前の高分子複合体製剤の質的分析に有用なツールである。しかし、これらの生化学的分析の結果は、サンプルの構造不均一性とcryoEMグリッド上でのその挙動に関する洞察をほとんど得ない。このため、負の汚れEMは、組成および立体構造の異質性を評価するための迅速で安価で強力なツールとして日常的に使用され、精製からどの溶出分が最も有望であるか、または異なる緩衝組成物をスクリーニングする良い方法である19,20。有望なサンプルが特定されたら、SPA cryoEM パイプラインに進むことができます。負の染色は、cryoEMに見られるその後の結果と必ずしも一致するとは限りません。時々サンプルは陰性の汚れによって貧弱に見えるが、cryoEMの中の膜炎で見ると改善する。対照的に、陰性染色ステップ中にサンプルが優れている場合がありますが、cryoEMに進行する際に大幅な最適化が必要になることがあります。しかし、ほとんどの場合、負の汚れは有用な品質管理ステップを提供する。
ガラス 電子顕微鏡の真空システム内の過酷な環境は、未固定の生物学的標本21に脱水と放射線損傷の両方を引き起こす。したがって、サンプルをネイティブのような状態で画像化するには、生物学的標本をイメージング前に保存する必要があります。高分子複合体の精製製剤の場合、ガラス化は、複合体の原子の細部を維持しながら、cryoEMによってその可視化を可能にする選択の方法です。試料調製方法としてのガラス化の発見は、2017年のノーベル化学賞でデュボシェが認められた生物学的標本の電子顕微鏡の根本的な進歩であった。サンプルガラス化は、目的の標本を含む溶液の薄い層を作成することを含みます, 典型的には数十 nm厚, cryoEMグリッド支持体に懸濁.次いで、薄膜は、~175°Cの液体エタン等の凍結剤で極めて速やかに凍結する。 凍結率は、〜106 °C/sであり、アモルファス、または硝子体の氷が形成されるほど速く、薄い固体膜22内に試料を懸濁させる。
考慮すべき最初の変数は、cryoEM グリッドサポート選択23です。EM グリッドは、通常、支持構造上の(規則的または不規則な)穿膜を有するアモルファス炭素膜から成り立つ。支持構造は、典型的には直径3.05mmの円形の金属格子であり、通常は銅からなされるが、金、又はモリブデン(好ましい熱膨張特性を有する24)のような他の金属が使用され得る。時には、グラフェン、酸化グラフェン、または薄い(〜1〜2 nm)アモルファス炭素層などのグリッド全体に追加の薄い連続支持が適用されることもあります。標準的なcryoEMグリッド(最も一般的には400-200メッシュ銅、穿孔された(1.2 μmの丸い穴は1.3 μm(r1.2/1.3)、または2 μmの炭素(r2/2)で区切られた)カーボン支持が、現在までに報告された多くの異なるパターンが利用可能であるが、カーボンサポートが使用されているが、現在までに報告された構造の大半では、大部分の異なるパターンが使用されているが、現在までに報告されている構造の大半では、炭素サポートが可能である。 導電性の向上と試料の動きの減少を伴う新しいグリッド技術が報告されている25.選択されたグリッドは、それらが親水性をレンダリングし、サンプルアプリケーション26に適したレンダリングするために、グロー放電/プラズマ洗浄処理を受けます。
グロー放電後、次の段階は薄膜形成です。この薄膜は、グリッドから余分な液体を除去するために濾紙を使用して最も一般的に形成される。これは手動で行うことができますが、Vitrobot Mk IV(サーモフィッシャーサイエンティフィック)、EM GP II(ライカ)、CP3(ガタン)など、数多くのプランジ冷凍装置が市販されています。これらのデバイスでは、溶液中のサンプルの3〜5μLがEMグリッドに塗布され、その後、フィルターペーパーを使用して過剰な溶液を消す。グリッドは、薄膜を横切って懸濁し、液体窒素(LN2)で冷却したエタンを~-175°Cにして液体エタンに突き落とす。 凍結すると、グリッドは、撮像の前およびイメージング中に、デシブポイント(-137°C)より低い温度で維持されます。
検体スクリーニングとデータ収集 クライオEMグリッドのガラス化後、次の段階は、グリッドをスクリーニングしてその品質を評価し、グリッドが高解像度データ収集に進むのに適しているかどうかを判断することです。理想的なcryoEMグリッドは、氷の厚さが標本の最も長い次元を収容するのに十分な氷の厚さ(結晶性氷とは対照的)を有し、周囲の氷が得られる画像にできるだけ少ないノイズを与えることを保証する。氷の中の粒子は、生化学と一致する大きさと(既知の場合)形状を有し、理想的には粒子配向のランダムな分布を有する単分散であるべきである。最後に、グリッドには、必要なデータ収集の長さを満たす十分な品質の領域が必要です。試料によっては、最適なグリッドが生成されるまで、ガラス化とスクリーニングの多くの反復が必要な場合があります。幸いにも残念にも、クライオEMグリッド上の粒子分布を変化させるために経験的にテストできる膨大な範囲の変数があります(16,27でレビュー)。本原稿では、膜蛋白質プロジェクト10の代表結果が示されている。
適切なグリッドが特定されると、データ収集を続行できます。生物標本用のクライオ透過型電子顕微鏡のモデルは、高解像度データを自動で収集するために最適化されています。通常、データは 300 kV または 200 kV システムで収集されます。自動データ収集は、EPU(サーモフィッシャーサイエンティフィック)28、レギノン29、JADAS30、SerialEM31,32などのソフトウェアを使用して実現できます。最新の検出器を使用した自動データ収集では、通常、24 時間の期間で生データのテラバイト (TB) が得られます (平均データセットのサイズは 4 TB です)。
COVID-19は世界の大部分で制限されているため(2020年12月の執筆時点)、多くの顕微鏡検査施設がリモートアクセスの提供に移行しました。グリッドが顕微鏡のオートローダーにロードされると、データ収集はリモートで行うことができます。
画像処理とモデル構築 データ収集セッションが通常 0.5 ~ 4 日の場合、コンピューティング リソースの可用性によっては、その後の画像処理に数週間から数か月かかる場合があります。初期画像処理ステップ、すなわち動き補正とコントラスト伝達関数(CTF)の推定は「オンザフライ」33,34で行われるのが標準です。ダウンストリーム処理では、多数のソフトウェア スイートが用意されています。粒子は「摘出」され、顕微鏡写真35,36から抽出される。パーティクルが抽出されると、標準プロトコルは、複数の分類ラウンド(2 次元(2D)と 3 次元(3D)の両方)を通してパーティクルを処理し、特定の領域に焦点を当てて、均質なサブセットのパーティクルに到達することです。この均質な粒子のサブセットを一緒に平均化して、3D再構成を行います。この時点でデータは、CTFの洗練、歪み補正37、ベイジアン研磨38など、可能な限り最高品質の地図を生成するためにさらに補正されることが多い。この画像処理の結果は、目的の生物学的標本の3Dクライオエムマップである。300kVの顕微鏡システムで収集されたデータは、タンパク質複合体のサイズと柔軟性に応じて通常10Åと2 Åの間である、十分な品質のグリッドから「標準」の自動単一粒子実験で到達した解像度範囲。理想的な標本によって、SPAワークフロー5を使用して、〜1.2 Åの解像度に達しました。このプロトコルはEM密度マップの取得に向けたステップを詳述していますが、これが手元に入ると、タンパク質モデルのフィッティングと精製(分解能が3.5Å<場合)またはde novo39構築によってさらに解釈できます。構造決定実験に関連するデータは、EM密度マップ(電子顕微鏡データバンク)40、結果として生じる原子座標(タンパク質データバンク)41および生データセット(電子顕微鏡パブリック画像アーカイブ)42を含むオンラインの公共リポジトリに堆積することができる。
このプロトコルでは、 ポルフィロモラス歯肉から 外膜タンパク質複合体RagAB(〜340kDa)が、高分子複合体10 (EMPIAR-10543)の例として用いられる。cryoEM が新たに追加された場合、iNEXT Discovery や指示などの資金を提供されたアクセス スキームを通じて、サンプルから構造までこのパイプラインを通じたサンプルのサポートが利用可能になり、ピアレビューが行われます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

クライオ電子顕微鏡(cryoEM)は、単一粒子分析(SPA)を介して高分子複合体の構造決定のための強力な技術です。全体的なプロセスは、i)cryoEMグリッドでサポートされている薄膜の標本を活性化することを含む。ii) 粒子分布と氷の品質を評価するために標本をスクリーニング;iii) グリッドが適切な場合は、分析用に単一のパーティクル データセットを収集します。とiv)画像処理は、EM密度マップを生成します。このプロトコルでは、これらの各手順の概要を示し、ワークフロー中にユーザーが変更できる変数と一般的な問題のトラブルシューティングを重点的に説明します。多くの施設で遠隔顕微鏡操作が標準となると、顕微鏡への物理的アクセスが制限される場合に、効率的な操作およびイメージングにおいてユーザを支援するイメージングプロトコルのバリエーションについて説明する。

スクリーニングの際、グリッドはアトラスステージで廃棄することができ、低倍率で解決されたフィーチャはグリッドをデータ取得に適さないとマークします。たとえば、グリッドの大部分が壊れた状態で大きな機械的損傷を受けた場合(図 2A)、またはグリッドが「乾燥」しているように見える場合(図 2B)。このようなグリッドは、グリッドの四角形の端が鮮明で明確に表示されるため、通常は識別可能です。プランジ凍結装置を使用して作られたグリッドの大部分にわたって、氷の勾配が観察される(図2C、D)。粒子分布は、目的の標本に応じて、氷の厚さで劇的に変化する可能性があるため、粒子分布を評価するためにグリッドの正方形の範囲をスクリーニングすることが推奨されます。ツールは、ユーザーが同様または異なる氷の厚さのグリッドの正方形を識別するのに役立つアトラススクリーニングステップ中にEPUソフトウェア内に実装されています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> 図2:スクリーニングセッションからの低倍率の「アトラス」モンタージュの例。A)グリッドの大部分が壊れて大きな被害を受けたグリッド - 収集には適していません。 B)氷のない乾燥グリッド - 収集には適していません。 C)使用できるグリッドの~50%で氷勾配を示すグリッド。 D)グリッドの33%が使用できる氷の勾配。 C および Dの両方が、使用できるグリッドの正方形が収集に適した氷の厚さを有する場合のデータ収集に適しており、かつ収集の最小持続時間(例えば、24時間) Eを満たすのに十分な獲得領域がある場合、氷の厚さの範囲を有するアトラスの例である。F)同じアトラスは、Eで提示されますが、グリッドの正方形は、氷の厚さに応じてEPUソフトウェアによって分類され、着色されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
粒子分布をスクリーニングする際には、予想される結果を正確に把握するために、倍率や全電子線量などの画像生成パラメータがデータ取得時に使用されると予想されるものと類似していることを確認してください。スクリーニング中、理想的な粒子分布は、粒子の配向の範囲を有する単分散である(粒子の形態の標本および既存の知識に応じて、これは確認するのが難しいかもしれない) (図3A)。氷は粒子の最大の次元を収容しながらできるだけ薄くする必要があり、氷が薄すぎると電子ビームで照らされたときに溶ける可能性があります。これにより、顕微鏡写真では過度の動きが発生し、この特性を示す領域は避けるべきです(図3B)。集合的な経験から、この効果は、バッファー内に洗剤がある場合に最も一般的に観察されます。これにより、穴の中心に非常に薄い氷が発生するため、パーティクルを物理的に除外してエッジに向かって強制することができます。この効果は図 3C で見られますが、この場合は極端な例ではなく、これらの画像がデータセットに役立ちます。最後に、氷は、渦満である必要があります。撮影した画像の大部分またはすべてが結晶氷(図3D)を示すグリッド(またはグリッド)の領域をデータ取得から除外します。多くの場合、非渦氷はグリッドの正方形の端で観察されます。読者は、グリッドガラス化16中に変更できる変数の詳細なレビューと、薄膜環境における粒子挙動の説明46,47に関する詳細な情報を参照する。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> 図3:異なる粒子分布を示す代表的な顕微鏡写真。A) さまざまな配向を採用した単分散粒子の「理想的な」分布。 B)電子ビームにばかばると変形する穴の真ん中の氷が過度に薄く、顕微鏡写真で過度の動きを引き起こす。この効果は、洗剤が緩衝液 C)の中心に氷が薄い場合に最も頻繁に観察され、これは物理的に中心から粒子を除外し、穴の端に向かって粒子の混雑を引き起こす。この場合、これらの画像が有用であることを防ぐほど極端ではありませんが、少し厚い領域をスクリーニングする価値があることを示唆しています。 D)氷は、この例の顕微鏡写真のように見える領域上で収集すべきではない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
オンザフライ画像処理は、データ取得のエラーや問題を拾い上げるのに役立ちますので、可能な限り常にお勧めします。例えば、マイクログラフ内の過度の動きは、オートローダーターボポンプがアクティブであることを示すか、氷が電子ビーム内で大きく移動しているひび割れたグリッドの正方形にデータが収集され、グリッドの正方形をスキップする必要があることを示している可能性があります。その場でCTF推定は、(焦点がずれではなく)正の焦点点が適用される状況(CTF推定プログラムとこれらの点を見つけるためのパラメータが使用される)状況を明らかにし、ボルタ位相板48が使用される位相シフトを決定することができる。多くの場合、画像処理パイプラインには、データのグラフィカルな概要 (図 4A) が含まれ、ユーザーが顕微鏡写真の品質をすばやく評価し、データ収集の修正が必要かどうかを判断しやすくなります。
マイクログラフからの粒子の選択は、汚染やグリッド支持フィルムなどの「偽陽性」を避けながら、最適化を必要とすることができます。しかし、crYOLOなどのパーティクルピッカーは、データの「最初のパス」にデフォルトのパラメータを使用して十分に機能することが多く(図4B)、データの品質とダウンストリームの成功の可能性を評価することが容易な2Dクラス平均への進行を可能にします。ほとんどのプロジェクトでは、~> 10kのパーティクルの2D分類は、二次構造の詳細を持つクラスを明らかにし始める必要があります。3D に進むには、通常、2D 分類ステージで、パーティクルの向きの範囲を表すクラスを明らかにする必要があります。好ましい方位が明らかになっている場合、傾いたサンプルを有するサンプル調製16 またはさらなるデータ集録の反復が必要であり得る49。二次構造の詳細を示すクラスはすべて、3D解析に進むために選択する必要がありますが、「ジャンク」粒子は廃棄されます(図4C)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> 図4:初期画像処理手順A) 「オンザフライ」画像処理スクリプトからの出力。 B)例の顕微鏡写真(左)は、crYOLO一般モデルを用いて適切に自動摘出された粒子(右、赤い正方形に囲まれた粒子を有する)スケールバー(白)が50nmである。 C) 赤い四角に捨てられたクラスと、緑色でのさらなる処理のために選択されたパーティクルのクラスを示す2D分類の結果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
小さなサブセットのパーティクルを使用して初期モデルを生成できます(図5A)。この初期モデルは、3D 分類および絞り込みで開始モデルとして使用できます。RagABの場合、データセットには3D分類中に分離できる3つの異なる適合者が含まれていました(図5B)。これらの各クラスに寄与するパーティクルは、独立して処理し、EM密度マップをリファインするために使用でき、さらに解釈やモデル構築の対象となります。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> 図 5: 3D EM 密度マップの生成A) RELIONを使用して生成された典型的な初期モデル。 B)3D分類は、開いた(緑)、開閉(青)、閉じた(紫)の3つの異なる立体状態への粒子の分離を示す5つのクラスにわたる。 C) マスク作成のプロセス。3D 絞り込み(左)からの地図はキメラで視覚化されるべきです。その後、ボリューム ビューアを使用して、マップが不整合な、騒がしい密度 (中央) から解放される最小のしきい値を識別できます。このしきい値は、RELION マスク作成ジョブの初期二値化しきい値として入力されます。マスク出力の例は、グレー (右) で示されています。 D)ラガブ(EMD-10245)のオープンクローズ状態の高解像度EM密度マップは、局所解像度(Å)によってフィルタリングされ、着色された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

単粒子クライオEM分析は、膜タンパク質、アミロイド線維、核酸結合タンパク質およびウイルスを含む幅広い標本に適用される構造生物学者のツールボックスにおける日常的な技術となっています。サンプルの準備が完了し、グリッドが顕微鏡にロードされると、データ収集は、アストベリーバイオストラクチャー研究所やeBICなどの多くのクライオEM施設で遠隔で行うことができます。構造決定を成功させるための主な障壁は、多くの場合、このプロセスを通じて必要な複数の反復を伴うサンプル調製およびグリッドスクリーニング段階にあります。ここでは、リモートグリッドスクリーニングと単粒子データ取得について説明します。顕微鏡のユーザーインターフェイスの自動ローダータブで、矢印を使用してオプションダイアログをタブアウトし、インベントリボタンを押します。これにより、カセット内の各位置を順次チェックして、カートリッジが存在するかどうかを確認します。インベントリは各スロットで順番に実行されます。すべての占有スロットがマップされると、インベントリは停止します。顕微鏡列に転送するグリッドをハイライトし、荷重をクリックします。グリッドがステージに正常にロードされると、スロットラベルは青から黄色に変わります。グリッドをスクリーニングするには、EPUソフトウェアを開きます。準備ページで、取得用光学と設定を選択し、ドロップダウンメニューからアトラスプリセットを選択します。適切なビーム設定プリセットを選択し、パラメータを顕微鏡に押し込むプレスセットを選択します。を押してカラムバルブを開き、インフルエンザの画面を挿入します。ビームが見え、検出器を覆うために十分に広がり、中央に配置されていることを確認します。必要に応じて、ジョイスティックまたは仮想ハンドパネルを使用してグリッドのより薄い領域にナビゲートし、XとY.のステージの動きを制御します。EPU で、アトラスページに移動し、新しいセッションを押します。MRC 画像形式を選択し、スクリーニングセッションを保存するための適切なフォルダ名と場所を入力し、[適用]をクリックします。左側のメニューからスクリーニングを選択します。各グリッドの横にあるチェックボックスをオンにして、アトラスモンタージュを取得し、EPUでスクリーニングセッションを開始します。アトラスはチェックされたグリッドごとに取得され、使用可能なグリッドの正方形は完了時にリストされます。各アトラスは、スクリーニングページでハイライト表示することで表示できます。完了したら、収集したアトラスを確認し、より高い倍率でサンプル品質を評価するのに適したグリッドを特定します。EPU スクリーニングメニューで選択したグリッドをハイライト表示し、サンプルの読み込みをクリックします。アトラススクリーニングメニューから、現在ロードされているグリッドを選択し、グリッド画像上の目的の位置を右クリックして、ここで移動ステージを選択することで、塗りつぶされた穴を含むグリッドの正方形にステージを移動します。EPU準備ページに戻り、グリッドの正方形のプリセットを選択します。EPU 自動機能ページを開き、グリッドの正方形のプリセットでステージ傾斜によって自動ユーセントリックを実行して、サンプルをユーセントリック高さに移動します。EPU の準備では、新しいグリッド正方形のプレビューイメージを取ります。異なる穴の間のグレーの値は、異なる氷の厚さを示しています。右クリックしてステージを移動し、ここでステージを移動して、穴の上にステージを移動します。穴またはユーセント高プリセットを選択し、[プレビュー]をクリックします。データ取得プリセットを選択し、パーティクルを容易に識別できる倍率を設定します。デフォーカスオフセットを負の3~5マイクロメートルに設定します。グリッド全体の粒子分布、配向、汚染の氷の厚さの範囲を再評価するステップを反復処理します。顕微鏡の可用性に応じて、データ収集に直接継続するか、または他のサイトを含む将来の収集のために顕微鏡からグリッドを取り除くことができます。アトラスを設定し、アトラスを取得するグリッドを選択して、スクリーニングから利用できない場合は、アトラスを収集します。アトラスを取得し、出力を表示するには、グリッドの場所をクリックします。アトラスが完成したら、プロジェクトの実験ニーズに従って、ビーム設定のプリセットをそれぞれ定義します。イメージシフトキャリブレーションを実行します。EPU ページ・セッションのセットアップを選択し、新規セッションまたは新規セッションのいずれかを選択して、EPU セッションをセットアップします。新しいセッションを選択すると、以前の設定を使用するオプションを提供するポップアップが表示されます。設定は、前の EPU セッションから自動的にロードされます。または、環境設定から新しいを選択し、保存された環境設定を持つファイルを選択して、この情報を現在のEPUにプリロードします。セッション名に有益な情報を入力します。タイプで、手動を選択します。取得モードでは、収差フリー画像シフトコレクションが利用可能で希望される場合は、正確な穴中心または高速取得を選択します。目的の画像形式を選択し、ストレージフォルダを選択すると、EPUはセッション名のディレクトリを作成します。使用しているグリッド穴の間隔に応じて適切なグリッドを選択し、[適用]を押します。初期グリッドの正方形を選択し、取得テンプレートを設定します。正方形の選択に移動します。すべての正方形が緑色の場合は、左上の[すべて選択解除]をクリックします。タイルを開くには、右クリックして [開く] タイルを選択します。[選択] をクリックし、右クリックして [ステージをグリッドの正方形に移動] を選択して、グリッドの正方形を追加または選択します。穴選択に移動し、自動ユーセントリックを押します。グリッドの正方形のイメージが撮影されるまで待ちます。オートファンクションが失敗した場合は、高さが大幅にオフになっている可能性があります。それはグリッドの正方形の倍率でインフルエンザスクリーンを使用して手動で調節することができる。穴のサイズを測定するには、正しいサイズと間隔で穴の上に黄色い円を移動して調整します。穴を探して押します。穴が正しく見つかったことを確認します。ない場合は、穴のサイズを変更し、もう一度穴を探します。このプロセスが一貫して失敗する場合は、グリッドの正方形の倍率で、より小さい数または明るいスポットサイズに移動することを検討してください。右側のフィルター氷品質ヒストグラムを使用して、穴の選択を調整します。これは、厚い氷と薄い氷のある領域を除外するのに役立ちます。これは、セッション中に選択された将来のグリッドの正方形のために記憶されます。上部の選択メニューのツールを使用して穴の選択を最適化します。たとえば、グリッド バーの近くにある穴を削除をクリックします。テンプレート定義に移動し、取得を押します。[検索]をクリックし、穴を中心にします。ステージシフト後の遅延と画像シフト後の遅延時間を1~5秒に変更し、可能であれば最大画像シフト値を確認します。[取得領域を追加]をクリックし、画像上の任意の場所をクリックします。取得エリアを目的の場所に移動します。右上に焦点を合わせ解除する範囲を追加します。膜タンパク質プロジェクトの典型的な焦点外リストは、負の0.8〜負の3マイクロメートルの焦点外であり、その後、他の獲得領域を追加し、取得領域がビームで二重に露出しないように配置する。[オートフォーカス領域を追加]をクリックし、画像上の任意の場所をクリックします。オートフォーカス領域を穴の周囲のカーボンに移動します。標準的な方法は、AFIS を使用する場合は中心を置いた後、または正方形全体の Z 高さ変動に応じて 5 ~ 15 マイクロメートルごとに焦点を合わせる方法です。[ドリフト測定領域を追加]をクリックします。ドリフト測定は、標準設定として1秒あたり0.05ナノメートルの設定されたしきい値で、グリッド四角形ごとに1回実行されます。ドリフト測定領域は、オートフォーカス領域と直接重なることができます。ドリフトとオートフォーカスエリアが取得エリアと重ならないようにします。正方形の選択に戻り、グリッド上で取得する正方形を選択します。取得エリア数とデータ取得率を使用して、必要な取得エリアの数を予測します。必要な四角形をすべて選択したら、[すべての正方形を準備]を押します。各正方形が収集されたら、グリッドの正方形間を移動し、選択ブラシを使用して穴を微調整します。標本の上のステージの位置に移動し、ユーセントリックな高さを設定するために自動機能を使用します。前述の顕微鏡ソフトウェアを使用して、およびテキストで顕微鏡のアライメントを行います。EPUで目的の絞りを挿入し、中央に配置し、対物レンズの乱視を修正する前に、オートファンクション内でコマフリーアライメントを行います。両方のアライメントが適切な値に収束していることを確認します。自動取得を開始する前に、オートローダーターボポンプの電源がオフで、必要に応じて目的の絞りを挿入してください。自動取得では、実行を開始して自動データ取得を開始します。このプロトコルを使用すると、破損または乾燥したグリッドをアトラスステージでスクリーニングおよび廃棄することができます。氷の勾配は、グリッドの大部分にわたって観察されます。スクリーニング中、理想的な粒子分布は、可視の粒子配向の範囲で単分散されます。氷が薄すぎると、電子線で照らされると溶け、顕微鏡写真で過度の動きを引き起こす可能性があります。これは、バッファー内に洗剤がある場合に最も一般的に観察されます。氷は、画像の大部分が結晶性の氷を示すグリッドの領域が除外されるように、氷をガラス膜にする必要があります。データのグラフィカルな要約は、マイクログラフの品質を評価し、データ収集の修正が必要かどうかを判断するために含まれていました。crYOLOなどのパーティクルピッカーは、データの最初のパスに十分にうまく機能し、2Dクラスの平均化を可能にします。ジャンク粒子を破棄する必要がある間、二次構造の詳細を示すクラスは、3D解析のために選択する必要があります。パーティクルのサブセットを使用して、3D 分類と細分化の初期モデルを生成できます。RagABの場合、データセットには3D分類中に分離できる3つの異なる適合者が含まれていました。データ取得とその後の画像解析のステップでの成功は、スクリーニング段階で適切に最適化されたグリッドの取得と識別に依存していることを覚えておくことが重要です。3D EM密度マップが取得されると、タンパク質モデルの適合と精製、または原子モデルデノボの構築によって、さらに解釈することができます。Cryo-EM単粒子解析は、これまで不可能であった多くのターゲットの構造化された決定を可能にします。特に、これらのワークフローは最近、COVID-19関連の高分子の構造を解くために使用されています。

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