Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horisont 2020-programmet til Europakommisjonen. J B. R. White er finansiert av Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). FEI Titan Krios mikroskoper ble finansiert av University of Leeds (UoL ABSL award) og Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Vi takker M Iadanza for bruken av hans mikrografanalysemanus. Vi anerkjenner Diamond Light Source for tilgang og støtte av cryo-EM-anleggene på Storbritannias nasjonale Electron Bio-imaging Centre (eBIC) finansiert av Wellcome Trust, MRC og BBRSC.

Det rapporteres ingen interessekonflikter.

I denne protokollen har vi beskrevet en grunnleggende rørledning som gjelder for prøver som kan brukes til rutinemessig SPA. Selv om denne filterpapir blottingsmetoden for tynn filmdannelse og vitrifisering utvilsomt er vellykket gitt bruken i de aller fleste SPA-prosjekter til dags dato, kommer den med en rekke ulemper. Disse inkluderer prøvesvekke, de langsomme tidsskalaene (sekunder) som kreves for å danne den tynne filmen og fryse prøven, rapporterte irreproducibility27 og rapporterte negative effekter av å bruke filterpapir for å utslette overflødig væske50. Nylig har nye teknologier blitt utviklet for å forbedre reproduserbarheten av tynn filmproduksjon51,52. Andre teknologier er utviklet som reduserer tiden mellom prøveapplikasjon og vitrifisering53,54,55. Mens filterpapirbaserte metoder for tynn filmdannelse forblir den mest allestedsnærværende metoden for SPA cryoEM prøvepreparering i skrivende stund, kan disse nye teknologiene gi en rekke fordeler når det gjelder effektivitet og reproduserbarhet av rutenett vitrifisering, samt skape nye muligheter til å bringe inn ytterligere eksperimentelle dimensjoner, for eksempel tidsoppløsning og rask blanding før vitrifisering.
Prosessen med nettscreening for de fleste brukere er for tiden en kvalitativ prosess som innebærer oppkjøp av lave forstørrelsesatlaser etterfulgt av å ta bilder med høy forstørrelse over hele rutenettet for å vurdere partikkelfordeling. Selv om dette er en tilstrekkelig robust tilnærming for noen typer prøver, kan det være vanskelig å vurdere for øyet om prøven faktisk er det forskeren håper å bilde eller har en foretrukket orientering, for eksempel med små (<200 kDa) prøver eller hvor lavoppløsningsmorfologien gjør det vanskelig å identifisere for øyet hvis en rekke partikkelfordelinger er til stede. For noen prosjekter er det umulig å avgjøre om prøven er som ønsket, for eksempel hvor en ligand er bundet eller hvor prøven blir screenet for å vurdere om en liten (f.eks. 10 kDa) underenhet fortsatt er til stede i forbindelse med et kompleks. For disse prosjektene vil helautomatiske rørledninger for dataanalyse kombinert med en "kort" 0,5- 1-timers samlinger, som kan gå gjennom bildebehandlingstrinn til 2D-klassifisering eller til og med 3D-klassifisering og raffinement, bidra til å effektivt avgjøre om en lengre samling er berettiget. Disse rørledningene er fortsatt under utvikling og er ikke mye implementert for tiden, men de har potensial til å forbedre effektiviteten av kryoEM rutenettscreening, spesielt for utfordrende prøver.
Forbedringer i direkte elektrondetektorer, samt modifikasjoner i mikroskopi kombinert med fremskritt innen bildebehandling som innsamling av bildeskiftdata, har økt gjennomstrømningen og kvaliteten på bilder som produseres under datainnsamlingen. Denne økningen i datahastigheten som samles inn fremhever behovet for grundig screening av cryoEM-rutenett før mange TB data blir samlet inn.
CryoEM SPA har blitt en virkelig mainstream strukturell biologi teknikk, og i mange tilfeller "gå til" tilnærming for noen klasser av prøver, for eksempel heterogene og labile makromolekylære komplekser. Mens protokollen her beskriver en grunnleggende oversikt over SPA-rørledningen, er hver seksjon som dekkes her (rutenett vitrifisering og screening, kryoEM og bildebehandling) et tema i seg selv og verdig leting under utviklingen av et SPA-prosjekt. Etter hvert som prøveforberedelses- og mikroskopiteknologier utvikler seg, og nye bildebehandlingsalgoritmer og tilnærminger kommer på nettet, vil SPA fortsette å utvikle seg som en rørledning, og hjelpe forskere med å få innsikt i komplekse biologiske systemer.

Enkel partikkel CryoEM For å undersøke livet på et molekylært nivå må vi forstå struktur. Mange teknikker for å sondere proteinstruktur er tilgjengelige, for eksempel NMR, røntgenkrystallografi, massespektrometri og elektronmikroskopi (EM). Til dags dato har de fleste strukturer deponert til Protein Databank (PDB) blitt løst ved hjelp av røntgenkrystallografi. Men fra ~ 2012 og fremover ble kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) en mainstream-teknikk for proteinstrukturbestemmelse og bruken økte dramatisk. Totalt antall EM-kart deponert til Electron Microscopy Databank (EMDB) (per desember 2020) var 13 421 sammenlignet med 1 566 i 2012 (figur 1, www.ebi.co.uk). I 2012 var antall atomkoordinater modellert i kryoEM tetthetskart, avsatt til PDB bare 67, men per desember 2020 har 2309 strukturer blitt deponert så langt, en 35 ganger økning. Denne underliggende veksten i kvaliteten og mengden av kryoEM tetthetskart produsert, noen ganger referert til som "oppløsningsrevolusjonen"1, var forårsaket av en koalescens av fremskritt på flere områder: utvikling av nye kameraer for avbildning kjent som direkte elektrondetektorer; ny programvare; og mer stabile mikroskoper2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Figur 1: Kumulative innleveringer til EMDB fra 2012 til desember 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Single particle analysis (SPA) er et kraftig verktøy for å generere biologisk innsikt i et bredt utvalg av prøvetyper ved å belyse høyoppløselige strukturer av isolerte komplekser5,6 inkludert virus7,8, membranproteiner9,10, spiralformede forsamlinger11 og andre dynamiske og heterogene makromolekylære komplekser12,13, hvis størrelser varierer etter størrelsesorden (fra 39 kDa 14,15 til titalls megadaltonn). Her beskrives en protokoll for en standard rørledning for cryoEM SPA fra prøve til struktur.
Før du tar fatt på denne rørledningen, bør en renset prøve bli utsatt for biokjemisk analyse for å vurdere sjansene for nedstrøms suksess. Forberedelse av en passende prøve er uten tvil den største barrieren mot SPA, spesielt for forbigående og heterogene (både komposisjons- og konformasjonskomplekser). Det makromolekylære komplekse preparatet bør inneholde så få forurensninger som mulig, med tilstrekkelig konsentrasjon til å gi mange partikler i hver kryoEM-mikrograf, og i en buffersammensetning som er godt egnet til kryoEM-analyse. Visse bufferbestanddeler, inkludert sukrose, glyserol og høy (~> 350 mM konsentrasjoner av salter, avhengig av prøvestørrelse, egenskaper og andre bufferbestanddeler) kan forstyrre prosessen med vitrifisering eller redusere signal-til-støy-forholdet i bilder, noe som hindrer strukturbestemmelse16.
Vanligvis bør størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og SDS- PAGE gelanalyse brukes til å vurdere prøverenhet17,18, men sirkulær dikromatisme, funksjonelle analyser, SEC kombinert med multi-vinkel lysspredning, og termiske stabilitetsanalyser er alle nyttige verktøy for kvalitativ analyse av makromolekylære komplekse preparater før kryoemanalyse. Resultatene fra disse biokjemiske analysene kan imidlertid gi liten innsikt i utvalgets strukturelle heterogenitet og dens oppførsel på et kryoEM-nett. Av denne grunn brukes negativ flekk EM rutinemessig som et raskt, billig og kraftig verktøy for å vurdere komposisjons- og konformasjons heterogenitet, og derfor en god måte å fastslå hvilken elutionfraksjon fra en rensing som er mest lovende, eller screening av forskjellige buffersammensetninger19,20. Når en lovende prøve er identifisert, kan vi fortsette til SPA cryoEM-rørledningen. Negativ flekk stemmer ikke alltid overens med de etterfølgende resultatene sett i cryoEM; Noen ganger ser en prøve dårlig ut av negativ flekk, men forbedres når den ses i glassaktig is i cryoEM. Noen ganger ser prøver utmerket ut under negative flekktrinn, men krever betydelig ytterligere optimalisering når du går videre til cryoEM. Men i de fleste tilfeller gir negativ flekk et nyttig kvalitetskontrolltrinn.
Vitrifisering Det harde miljøet i vakuumsystemet til elektronmikroskopet forårsaker både dehydrering og strålingsskader på uløste biologiske prøver21. Derfor, for å avbilde prøven i en innfødt-lignende tilstand, må den biologiske prøven bevares før avbildning. For rensede preparater av makromolekylære komplekser er vitrifisering den valgte metoden for å muliggjøre visualisering ved kryoEM samtidig som atomdetaljene til komplekset bevares. Oppdagelsen av vitrifisering som en metode for prøvepreparering var et grunnleggende fremskritt innen elektronmikroskopi av biologiske prøver, som Dubochet ble anerkjent for i Nobelprisen i kjemi i 2017. Prøvevistrifisering innebærer å skape et tynt lag med løsning som inneholder prøven av interesse, vanligvis titalls nm tykk, suspendert på en cryoEM rutenettstøtte. Den tynne filmen fryses deretter ekstremt raskt i et kryoogen som flytende etan ved ~ -175 ° C. Frysehastigheten er ~ 106 ° C / s, rask nok til at amorf, eller glassaktig is dannes, suspenderer prøven i en tynn, solid film22.
Den første variabelen du må vurdere er cryoEM-rutenettstøtten som er valgt23. Et EM-rutenett består vanligvis av en amorf karbonfilm med perforeringer (enten vanlig eller uregelmessig), over en støttestruktur. Støttestrukturen er vanligvis et sirkulært metallgitter 3,05 mm i diameter, vanligvis laget av kobber, men andre metaller som gull eller molybden (som har foretrukne termiske ekspansjonsegenskaper24) kan brukes. Noen ganger påføres en ekstra tynn, kontinuerlig støtte over rutenettet, for eksempel grafen, grafenoksid eller et tynt (~ 1-2 nm) amorf karbonlag. Mens standard cryoEM-rutenett (vanligvis 400-200 mesh kobber med perforert (1,2 μm runde hull separert med 1,3 μm (r1.2/1.3), eller 2 μm separert med 2 μm karbon (r2/2)) karbonstøtte - selv om mange forskjellige mønstre er tilgjengelige) har blitt brukt i de aller fleste strukturer rapportert til de aller fleste strukturer rapportert å være tilgjengelige) nye nettteknologier med forbedret konduktivitet og redusert prøvebevegelse er rapportert25 . Utvalgte gitter blir utsatt for en glødeutladning / plasmarengjøringsbehandling for å gjøre dem hydrofile og mottagelige for prøveapplikasjon26.
Etter glødutladning er neste trinn tynn filmdannelse. Denne tynne filmen dannes oftest ved hjelp av filterpapir for å fjerne overflødig væske fra rutenettet. Selv om dette kan utføres manuelt, er en rekke dypfrysingsenheter kommersielt tilgjengelige, inkludert Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) og CP3 (Gatan). Med disse enhetene påføres ~ 3-5 μL prøve i oppløsning på EM-rutenettet, etterfulgt av oppblåsthet bort overflødig løsning ved hjelp av filterpapir. Gitteret, med en tynn film suspendert over det, blir deretter kastet i flytende etan avkjølt av flytende nitrogen (LN2) til ~ -175 °C. Når det er frosset, opprettholdes rutenettet ved en temperatur under devitrifiseringspunktet (-137 °C) før og under avbildning.
Prøvescreening og datainnsamling Etter vitrifisering av et cryoEM-rutenett, er neste trinn å screene rutenettet for å vurdere kvaliteten og avgjøre om rutenettet er egnet til å gå videre til datainnsamling med høy oppløsning. Et ideelt kryoEM-rutenett har glassaktig is (i motsetning til krystallinsk is) med istykkelsen akkurat tilstrekkelig til å imøtekomme den lengste dimensjonen av prøven, noe som sikrer at den omkringliggende isen bidrar med så lite støy til det resulterende bildet som mulig. Partiklene i isen skal ha en størrelse og (hvis kjent) form i samsvar med biokjemi, og ideelt sett være monodisperse med en tilfeldig fordeling av partikkelretninger. Til slutt bør rutenettet ha nok områder av tilstrekkelig kvalitet til å tilfredsstille ønsket datainnsamlingslengde. Avhengig av prøven kan dette ta mange gjentakelser av vitrifisering og screening til optimale rutenett produseres. Både heldigvis og dessverre er det et stort utvalg av variabler som empirisk kan testes for å endre partikkelfordeling på cryoEM-rutenett (gjennomgått i 16,27). I dette manuskriptet vises representative resultater for et membranproteinprosjekt10.
Når et passende rutenett er identifisert, kan datainnsamlingen fortsette. Flere modeller av kryooverføringselektronmikroskoper for biologiske prøver er optimalisert for å samle inn høyoppløselige data på en automatisert måte. Vanligvis samles data på 300 kV- eller 200 kV-systemer. Automatisert datainnsamling kan oppnås ved hjelp av programvare som EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 og SerialEM31,32. En automatisert datainnsamling med moderne detektorer resulterer vanligvis i terabyte (TB) av rådata i en 24 timers periode (gjennomsnittlige datasett er ~ 4 TB i størrelse).
På grunn av COVID-19-restriksjonene som er på plass på store deler av verden (skrivetidspunkt desember 2020), har mange mikroskopifasiliteter gått over til å tilby ekstern tilgang. Når rutenettene er lastet inn i autoloaderen til et mikroskop, kan datainnsamling utføres eksternt.
Bildebehandling og modellbygging Der en datainnsamlingsøkt vanligvis kan være 0,5-4 dager, kan påfølgende bildebehandling ta mange uker og måneder, avhengig av tilgjengeligheten av databehandlingsressurser. Det er standard for innledende bildebehandlingstrinn, nemlig bevegelseskorrigering og kontrastoverføringsfunksjon (CTF) estimering for å finne sted 'på farten' 33,34. For nedstrøms behandling er det en mengde programvarepakker tilgjengelig. Partikler "plukkes" og ekstraheres fra mikrografer35,36. Når partikler er ekstrahert, vil en standardprotokoll være å behandle partiklene gjennom flere runder med klassifisering (i både to dimensjoner (2D) og tre dimensjoner (3D) og / eller fokusert på bestemte interesseområder) for å nå en homogen undergruppe av partikler. Denne homogene undergruppen av partikler blir deretter gjennomsnittet sammen for å produsere en 3D-rekonstruksjon. På dette tidspunktet korrigeres data ofte ytterligere for å produsere et kart av høyeste kvalitet som er mulig, for eksempel gjennom CTF-presisering, forvrengningskorrigeringer37 og bayesiansk polering38 . Utfallet av denne bildebehandlingen er et 3D cryoEM-kart over det biologiske eksemplaret av interesse. Oppløsningsområdet nådd i et "standard" automatisert enkeltpartikkeleksperiment fra et rutenett av tilstrekkelig kvalitet, med data samlet inn på et 300 kV mikroskopsystem er vanligvis mellom 10 Å og 2 Å avhengig av størrelsen og fleksibiliteten til proteinkomplekset. Med et ideelt eksemplar er oppløsninger på ~1.2 Å nå nådd ved hjelp av SPA-arbeidsflyter5. Mens denne protokollen detaljer skritt mot å skaffe en EM tetthet kart, når dette er i hånden det kan tolkes videre gjennom montering og raffinering av en protein modell (hvis oppløsning er < 3.5 Å) eller bygge de novo39. Data knyttet til strukturbestemmelseseksperimenter kan deponeres i offentlige depoter på nettet, inkludert EM-tetthetskart (Electron Microscopy Data Bank)40, resulterende atomkoordinater (Protein Data Bank)41 og rådatasett (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
I denne protokollen brukes det ytre membranproteinkomplekset RagAB (~ 340 kDa) fra Porphyromonas gingivalis som et eksempel makromolekylært kompleks10 (EMPIAR-10543). For de som er nye i cryoEM, er støtte for prøver gjennom dette datasamlebåndet fra utvalg til struktur tilgjengelig, underlagt fagfellevurdering, gjennom finansierte tilgangsordninger som iNEXT Discovery og Instruct.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

Kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) er en kraftig teknikk for strukturbestemmelse av makromolekylære komplekser, via enkeltpartikkelanalyse (SPA). Den generelle prosessen innebærer i) vitrifisere prøven i en tynn film støttet på et cryoEM rutenett; ii) screening av prøven for å vurdere partikkelfordeling og iskvalitet; iii) hvis rutenettet er egnet, samle et enkelt partikkeldatasett for analyse; og iv) bildebehandling for å gi et EM tetthetskart. I denne protokollen gis en oversikt over hvert av disse trinnene, med fokus på variablene som en bruker kan endre under arbeidsflyten og feilsøking av vanlige problemer. Når ekstern mikroskopdrift blir standard i mange anlegg, vil variasjoner på bildeprotokoller for å hjelpe brukere med effektiv drift og avbildning når fysisk tilgang til mikroskopet er begrenset, bli beskrevet.

Ved screening kan rutenett kastes på atlasstadiet, der funksjoner som løses ved lav forstørrelse markerer rutenettet som ikke egnet for datainnsamling. Hvis for eksempel et rutenett har vært utsatt for betydelig mekanisk skade med de fleste rutenettsnøser brutt (figur 2A), eller der rutenettet ser ut til å være "tørt", uten glassaktig is (figur 2B). Slike rutenett kan vanligvis identifiseres fordi kantene på rutenettplassene ser skarpe og distinkte ut. Over de fleste gitter laget ved hjelp av den dype fryseanordningen observeres en isgradient (figur 2C,D). Partikkelfordeling, avhengig av prøven av interesse, kan variere dramatisk med istykkelsen, og derfor anbefales det å screene en rekke rutenett firkanter for å vurdere partikkelfordeling. Verktøy har blitt implementert i EPU-programvare under atlasscreeningstrinnet for å hjelpe brukeren med å identifisere rutenetttorg med lignende eller annen istykkelse, noe som kan være spesielt nyttig for brukere som er nye i å undersøke cryoEM-rutenett (figur 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Figur 2: Eksempel på lav forstørrelsesmontasje fra screeningøkter. A) Et rutenett som har fått betydelige skader med de fleste grid firkanter ødelagt - uegnet for innsamling. B) Et tørt gitter uten glassaktig is - uegnet til oppsamling. C) Et rutenett som demonstrerer en isgradient med ~ 50% av rutenettet som kan brukes. D) En isgradient med ~ 33% av rutenettet som kan brukes. Både C og D, er egnet for datainnsamling hvis de brukbare rutenettplassene har en istykkelse som passer for innsamling, og det er nok oppkjøpsområder til å tilfredsstille minimumsvarigheten til en samling (f.eks. 24 timer) E) Et eksempelatlas med utvalg av istykkelser. F) Det samme atlaset presentert i E, men med, rutenett firkanter kategorisert og farget av EPU programvare i henhold til istykkelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Ved screening av partikkelfordeling må du sørge for at bildeparametere, for eksempel forstørrelse og total elektrondose, ligner de som forventes å bli brukt under datainnsamling for å gi et nøyaktig bilde av forventede resultater. Under screening er en ideell partikkelfordeling monodisperse med en rekke partikkelretninger synlige (avhengig av prøven og eksisterende kunnskap om partikkelens morfologi, kan dette være utfordrende å fastslå) (figur 3A). Isen skal være så tynn som mulig mens den imøtekommer partiklenes største dimensjon, hvis isen er for tynn, kan den smelte når den belyses med elektronstrålen. Dette fører til overdreven bevegelse i mikrografen, og områder som viser denne egenskapen bør unngås (figur 3B). Fra kollektiv erfaring observeres denne effekten oftest når det er vaskemiddel i bufferen. Dette kan resultere i veldig tynn is i midten av hullet, og slik at partikler kan utelukkes fysisk og tvinges mot kanten. Denne effekten observeres i figur 3C, men i dette tilfellet er det ikke et ekstremt eksempel, og disse bildene vil fortsatt nyttig bidra til et datasett. Til slutt må isen være glassaktig; utelukke områder av rutenettet (eller rutenettene) der flertallet eller alle bildene som er tatt, viser krystallinsk is (figur 3D) fra datainnsamlingen. Ofte observeres ikke-glassaktig is på kanten av rutenettet. Leserne henvises til detaljerte gjennomganger av variablene som kan endres under rutenett vitrification16 og beskrivelser av partikkeladferd i tynnfilmmiljøet46,47 for ytterligere informasjon.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Figur 3: Representative mikrografer som viser ulike partikkelfordelinger. A) En "ideell" fordeling av monodisperse partikler som vedtar en rekke orienteringer. B) Altfor tynn is midt i hullet som den deformerer ved eksponering for elektronstrålen forårsaker overdreven bevegelse i mikrografen. Denne effekten observeres oftest når vaskemiddel er til stede i bufferen C) Der isen er tynnere i midten av hullet, utelukker dette fysisk partikler fra midten, noe som forårsaker trengsel av partikler mot hullkanten. I dette tilfellet er det ikke ekstremt nok til å forhindre at disse bildene er nyttige, men det antyder at det er verdt å screene litt tykkere områder. D) Is er ikke glasslegemet, data bør ikke samles inn på områder som ser ut som dette eksempelmikrografen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
On-the-fly bildebehandling kan bidra til å plukke opp feil og problemer med datainnsamling, og det anbefales alltid der det er mulig. For eksempel kan overdreven bevegelse i mikrografer indikere at autoloader turbopumpen er aktiv, eller data samles inn på et sprukket rutenett der isen beveger seg betydelig i elektronstrålen, noe som indikerer at rutenettet skal hoppes over. På farten kan CTF-estimering avdekke omstendigheter der et positivt fokuspunkt (i stedet for defokus) påføres (der CTF-estimeringsprogrammer og parametere for å finne disse punktene brukes), og bestemme faseskiftet der en Volta faseplate48 brukes. På rørledningene for behandling av flybilder inneholder ofte et grafisk sammendrag av dataene (figur 4A) for å gjøre det enklere for brukere å vurdere mikrografkvaliteten raskt og avgjøre om det kreves datainnsamlingsendringer.
Valg av partikler fra mikrografer, samtidig som man unngår «falske positiver» som forurensning eller rutenettstøttefilm, kan kreve optimalisering. Imidlertid fungerer partikkelplukkere som crYOLO ofte tilstrekkelig godt ved hjelp av standardparametere for en "første omgang" av dataene (figur 4B), noe som muliggjør progresjon til 2D-klassegjennomsnitt der det kan være lettere å vurdere kvaliteten på dataene og sannsynligheten for nedstrøms suksess. For de fleste prosjekter bør 2D-klassifisering av ~ > 10k partikler begynne å avsløre klasser som har sekundærstrukturdetaljer. For å gå videre til 3D, bør 2D-klassifiseringsfasen vanligvis avsløre klasser som representerer en rekke partikkelretninger. Hvis en foretrukket orientering avsløres, kan det være nødvendig med flere gjentakelser av prøvepreparering16 eller ytterligere datainnsamling med prøven vippet49. Alle klasser som viser sekundærstrukturdetaljer, bør velges for å gå videre til 3D-analyse, mens "søppelpartikler" kastes (figur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Figur 4: Innledende bildebehandlingstrinn. A) Utgang fra et "på farten" bildebehandlingsskript. B) Eksempelmikrograf (venstre) med passende automatisk plukkede partikler identifisert ved hjelp av crYOLO generell modell (høyre, med partikler avgrenset av røde firkanter) Skalastenger (hvit) er 50 nm. C) Resultater fra 2D-klassifisering som viser klasser som ble kassert i den røde firkanten, og klasser hvorfra partikler ble valgt for videre behandling i grønt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
En liten undergruppe av partikler kan brukes til å generere en innledende modell (figur 5A). Denne første modellen kan deretter brukes som startmodell i 3D-klassifisering og raffinement. Når det gjelder RagAB, inneholdt datasettet tre forskjellige konforme som kan separeres under 3D-klassifisering (figur 5B). Partikler som bidrar til hver av disse klassene kan deretter behandles uavhengig og brukes til å avgrense et EM-tetthetskart som deretter kan bli gjenstand for videre tolkning og modellbygging.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Figur 5: Genererer tetthetskart for 3D EM. A) Typisk innledende modell generert ved hjelp av RELION. B) 3D-klassifisering over 5 klasser som viser separasjon av partikler i tre distinkte konformasjonstilstander: åpen åpen (grønn), åpen lukket (blå), lukket lukket (lilla). C) Prosessen med maskeoppretting. Kartet fra 3D-raffinement (venstre) skal visualiseres i chimera. Volumviseren kan deretter brukes til å identifisere den laveste terskelen som kartet er fritt for usammenhengende, støyende tetthet (midten). Denne terskelverdien legges inn som innledende binariseringsterskel i opprettingsjobben for RELION-maske. Et eksempel på maskeutdata vises i grått (til høyre). D) Høyoppløselig EM tetthet kart over åpen lukket tilstand RagAB (EMD-10245), filtrert og farget av lokal oppløsning (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Strukturbestemmelse av makromolekylære komplekser ved hjelp av kryoEM har blitt rutine for visse klasser av proteiner og komplekser. Her oppsummeres denne rørledningen (prøvepreparering, screening, datainnsamling og prosessering), og leserne er rettet mot ytterligere detaljerte ressurser og variabler som kan endres ved mer utfordrende prøver.

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Enpartikkel cryo-EM-analyse har blitt en rutinemessig teknikk i strukturbiologens verktøykasse som gjelder for et bredt spekter av prøver, inkludert membranproteiner, amyloidfibriler, nukleinsyrebindende proteiner og virus. Når prøveprepareringen er fullført og gitteret lastet inn i mikroskopet, kan datainnsamling utføres eksternt i mange cryo-EM-anlegg som Astbury Biostructure Laboratory og eBIC. Store barrierer for vellykket strukturbestemmelse ligger ofte i prøvepreparerings- og rutenettscreeningsstadiene med flere gjentakelser som noen ganger kreves gjennom denne prosessen.Her vil vi demonstrere ekstern nettscreening og innsamling av enkeltpartikkeldata. I kategorien autolaster i mikroskopets brukergrensesnitt, tabuler ut alternativdialogboksen ved hjelp av pilen og trykk på lagerknappen. Dette vil sekvensielt kontrollere hver posisjon i kassetten for å finne ut om det finnes en patron.Beholdningen kjøres sekvensielt på hvert spor. Når alle okkuperte spor er tilordnet, stopper beholdningen. Merk rutenettet som skal overføres til mikroskopkolonnen, og klikk last.Sporetiketten blir fra blå til gul når rutenettet er lastet inn på scenen. Åpne EPU-programvare for å sile rutenettene. Velg anskaffelsesoptikk og innstillinger på forberedelsessiden, og velg deretter atlasforhåndsinnstillingen fra rullegardinmenyen.Velg passende forhåndsinnstillinger for stråleinnstilling, og trykk på set for å skyve parametrene til mikroskopet. Trykk på for å åpne søyleventiler og sette inn influensaskjermen. Kontroller at en bjelke er synlig og tilstrekkelig spredt og sentrert for å dekke detektoren.Om nødvendig navigerer du til et tynnere område av rutenettet ved hjelp av styrespaken eller de virtuelle håndpanelene for å kontrollere scenebevegelser i X og Y.Lift influensaskjermen og ta et bilde ved hjelp av forhåndsvisningsknappen i EPU. I EPU går du til atlassiden og trykker på ny økt. Velg MRC-bildeformatet og skriv inn et passende mappenavn og -plassering for lagring av screeningøkten, og klikk deretter på Bruk.Velg screening fra menyen til venstre. Merk av i avmerkingsboksene ved siden av hvert rutenett for å få kjøpt en atlasmontasje, og start deretter screeningøkten i EPU. Et atlas er anskaffet for hvert kontrollerte rutenett, og tilgjengelige rutenettstorg er oppført etter ferdigstillelse.Hvert atlas kan vises ved å fremheve det på screeningsiden. Når du er ferdig, kan du gå gjennom de innsamlede atlasene og identifisere rutenettene som er egnet for å vurdere prøvekvaliteten ved høyere forstørrelser. det valgte rutenettet på EPU-screeningmenyen, og klikk på Last inn eksempel.Fra atlasscreeningsmenyen velger du rutenettet som er lastet inn for øyeblikket, og flytter scenen til en rutenett firkant som inneholder de fylte hullene ved å høyreklikke over ønsket sted på rutenettbildet og velge flyttetrinn her. Gå tilbake til forberedelsessiden for EPU, og velg forhåndsinnstillingen for rutenettet. Åpne siden for automatiske funksjoner i EPU, og kjør automatisk eusentrisk etter trinn-tilt med rutenettets firkantede forhåndsinnstilling for å flytte prøven til eusentrisk høyde.Ta et nytt forhåndsvisningsbilde av rutenettet i EPU. Legg merke til de grå verdiene på tvers av forskjellige hull som indikerer forskjellige istykkelser. Flytt fasen over et hull ved hjelp av høyreklikk og flytt scenen her.Velg forhåndsinnstillingen for hull eller eusentrisk høyde, og klikk deretter forhåndsvisning. Velg forhåndsinnstilling for datainnsamling og angi en forstørrelse som gjør det enkelt å identifisere partiklene. Sett defokusforskyvningen til negative tre til fem mikrometer.Gå gjennom trinnene for å revurdere en rekke istykkelser for partikkelfordeling, orientering og forurensning over hele rutenettet. Avhengig av mikroskoptilgjengelighet kan du fortsette direkte til datainnsamling eller rutenett kan fjernes fra mikroskopet for fremtidig innsamling, inkludert på andre steder. Samle et atlas hvis man ikke er tilgjengelig fra screening ved å sette opp atlasinnstillinger og velge rutenett for å skaffe atlas.Skaff atlas og klikk på rutenettets plassering for å se utgangen. Når atlaset er fullført, definerer du hver av forhåndsinnstillingene for stråleinnstilling i henhold til prosjektets eksperimentelle behov. Utfør bildeskiftkalibreringer.Konfigurer EPU-økten ved å velge EPU-sideøktoppsettet og deretter velge enten ny økt eller ny fra innstillingene. Etter å ha valgt ny økt, vises en popup som gir et alternativ for å bruke tidligere innstillinger. Innstillingene lastes automatisk fra forrige til gjeldende EPU-økt.Alternativt kan du velge ny fra innstillinger og velge en fil med lagrede innstillinger for å forhåndslaste denne informasjonen til gjeldende EPU. Fyll ut øktnavnet med noe informativt. Velg manuell type.For anskaffelsesmodus velger du nøyaktig hullsentrering eller raskere anskaffelse hvis aberrasjonsfri bildeskiftsamling er tilgjengelig og ønsket. Velg ønsket bildeformat, velg deretter lagringsmappe, og EPU vil opprette en katalog med øktnavnet. Velg riktig rutenett i henhold til hvilken rutenetthullavstand som brukes, og trykk på Apply.Velg en innledende rutenettstorg, og angi en anskaffelsesmal. Gå til det firkantede utvalget. Hvis alle rutene er grønne, klikker du fjern merkingen øverst til venstre.Åpne fliser ved å høyreklikke og deretter velge åpen flis. Legg til eller velg en rutenettstorn ved å klikke merk, høyreklikk og velg flytt trinn til rutenetttorn. Gå til hullvalg og trykk automatisk eusentrisk.Vent til et firkantet rutenettbilde er tatt. Hvis autofunksjonen mislykkes, kan dette skyldes at høyden er betydelig av. Den kan justeres manuelt ved hjelp av influensaskjermen ved rutenettets firkantede forstørrelse.For å måle hullstørrelsen, flytt og juster de gule sirklene slik at de er over hullene med riktig størrelse og avstand. Trykk på finn hull. Kontroller at hullene er funnet riktig.Hvis ikke, endre hullstørrelsen og trykk på finn hull igjen. Hvis denne prosessen mislykkes konsekvent, bør du vurdere å gå til et lavere tall eller en lysere spotstørrelse ved kvadratisk forstørrelse i rutenettet. Bruk filterets histogram for iskvalitet til høyre for å justere hullvalget.Dette kan være nyttig for å utelukke områder med tykk is og tynn is. Dette vil bli husket for fremtidige rutenett firkanter valgt i løpet av økten. Optimaliser hullvalg med verktøyene i den valgte menyen øverst.Klikk for eksempel fjern hull nær rutenettlinjen. Gå til maldefinisjon og trykk hent. Klikk på finn og midtstill hullet.Endre forsinkelsen etter trinnskift og forsinkelse etter bildeskifttider til ett til fem sekunder, og kontroller om tilgjengelig maksimal bildeskiftverdi som ønsket. Klikk på legg til anskaffelsesområde og klikk hvor som helst på bildet. Flytt anskaffelsesområdet til ønsket lokasjon.Legg til defokusområdet øverst til høyre. En typisk defokusliste for et membranproteinprosjekt er negativt 0,8 til negativ tre mikrometer defokus, og legger deretter til andre oppkjøpsområder, og arrangerer dem slik at oppkjøpsområder ikke blir dobbelt eksponert med strålen. Klikk legg til autofokusområde, og klikk hvor som helst i bildet.Flytt autofokusområdet til karbonet som omgir et hull. Standard praksis er å fokusere automatisk etter sentrering når du bruker AFIS eller hver femte til 15 mikrometer avhengig av Z-høydevariasjonen over torget. Klikk legg til målområde for drift.Driftmåling utført én gang per rutenettstorg med en angitt terskel på 0,05 nanometer per sekund som standardinnstilling. Driftsmålingsområdet kan overlappe direkte med autofokusområdet. Sørg for at verken drift eller autofokusområde overlapper med et oppkjøpsområde.Gå tilbake til firkantet valg og velg rutene for anskaffelse på rutenettet. Bruk antall innsamlingsområder og forventet datainnsamlingsrate for å forutsi hvor mange anskaffelsesområder som kreves. Når alle ønskede firkanter er valgt, trykker du på forbered alle rutene.Når hver firkant er samlet, navigerer du mellom rutenettplassene og finjusterer hullene ved hjelp av markeringspenselen. Flytt til et stadiumsted over prøven og bruk automatiske funksjoner for å angi eusentrisk høyde. Utfør mikroskopjusteringer ved hjelp av mikroskopprogramvare som beskrevet tidligere og i teksten.Utfør komafri justering i autofunksjonene før du setter inn og sentrerer objektivåpningen og korrigerer objektivlinsen astigmatisme med EPU. Kontroller at begge justeringene konvergerer på passende verdier. Før du starter den automatiserte anskaffelseskjøringen, må du sørge for at turbopumpen for automatisk lasting er slått av og at objektiv blenderåpning settes inn om nødvendig.I automatisert anskaffelse trykker du på startkjøringen for å starte automatisert datainnsamling. Ved hjelp av denne protokollen kan ødelagte eller tørre rutenett screenes og kastes på atlasstadiet. En isgradering observeres over de fleste nettene.Under screening er en ideell partikkelfordeling monodisperert med en rekke partikkelretninger synlige. Hvis isen er for tynn, kan den smelte når den belyses med elektronstrålen, noe som forårsaker overdreven bevegelse i mikrografen. Dette observeres oftest når det er vaskemiddel i bufferen.Isen må være glasslegemet slik at områder av rutenettet der de fleste bildene viser krystallinsk is ble utelukket. Grafisk oppsummering av dataene ble inkludert for å vurdere mikrografkvalitet og for å avgjøre om det er behov for datainnsamlingsendringer. Partikkelplukkere som crYOLO fungerer tilstrekkelig bra for en første omgang av dataene, noe som muliggjør progresjon til gjennomsnitt av 2D-klasse.Klasser som viser sekundærstrukturdetaljer bør velges for 3D-analyse mens søppelpartikler skal kastes. Et delsett av partikler kan brukes til å generere en innledende modell for 3D-klassifisering og raffinement. Når det gjelder RagAB, inneholdt datasettet tre forskjellige konforme som kan skilles under 3D-klassifisering.Det er viktig å huske at suksess ved datainnsamlingen og påfølgende bildeanalysetrinn er avhengig av å skaffe og identifisere godt optimaliserte rutenett under screeningfasen. Når et 3D EM tetthetskart er oppnådd, kan det tolkes ytterligere ved å montere og raffinere en proteinmodell eller bygge en atommodell de novo. Kryo-EM enpartikkelanalyse muliggjør strukturert bestemmelse av mange mål som ikke var mulig tidligere.Spesielt har disse arbeidsflytene nylig blitt brukt til å løse strukturer av COVID-19-relaterte makromolekyler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuell flekk-og-dypfrysing av biologiske prøver for kryogen elektronmikroskopi med én partikkel

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling av nukleosomkjernepartikler kompleksert med DNA-reparasjonsfaktorer for kryo-elektronmikroskopi strukturell bestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstrahering av modifiserte mikrotubuli fra pattedyrceller for å studere mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse av monolags grafen til kryo-elektronmikroskopigitter for høyoppløselig strukturbestemmelse

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...