Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
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Este trabalho foi apoiado pelo programa iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado pelo programa Horizon 2020 da Comissão Europeia. J B. R. White é financiado pelo Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). Os microscópios FEI Titan Krios foram financiados pela Universidade de Leeds (prêmio UoL ABSL) e Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Agradecemos a M Iadanza pelo uso de seu roteiro de análise de micrografo. Reconhecemos a Diamond Light Source para acesso e suporte às instalações crio-EM no Centro Nacional de Bioimagem eletrônica (eBIC) do Reino Unido financiado pelo Wellcome Trust, MRC e BBRSC.

Nenhum conflito de interesses é relatado.

Neste protocolo, descrevemos um pipeline básico aplicável aos espécimes favoráveis à SPA de rotina. Embora este método de mancha de papel filtro de formação e vitrificação de filme fino seja sem dúvida bem sucedido dado o seu uso na grande maioria dos projetos spa até o momento, ele vem com uma série de desvantagens. Estes incluem desperdício de amostra, as escalas de tempo lentas (segundos) necessárias para formar o filme fino e congelar a amostra, relataram irreproducibilidade27 e relataram efeitos negativos do uso de papel filtro para apagar o excesso de líquido50. Recentemente, novas tecnologias foram desenvolvidas para melhorar a reprodutibilidade da produção de filmes finos51,52. Outras tecnologias foram desenvolvidas que reduzem o tempo entre aplicação amostral e vitrificação53,54,55. Embora os métodos baseados em papel filtro para formação de filmes finos permaneçam o método mais onipresente de preparação de amostras de SPA crioEM no momento da escrita, essas novas tecnologias podem trazer uma série de benefícios em termos de eficiência e reprodutibilidade da vitrificação da grade, bem como criar novas oportunidades para trazer dimensões experimentais adicionais, como resolução de tempo e mistura rápida antes da vitrificação.
O processo de triagem de grade para a maioria dos usuários é atualmente um processo qualitativo que envolve a aquisição de atlas de baixa ampliação seguido de tirar imagens de alta ampliação em toda a rede para avaliar a distribuição de partículas. Embora esta seja uma abordagem suficientemente robusta para alguns tipos de espécimes, pode ser difícil avaliar olho se o espécime é realmente o que o pesquisador está esperando para imagem ou tem uma orientação preferida, por exemplo, com pequenas (<200 kDa) ou onde a morfologia de baixa resolução torna difícil identificar pelo olho se uma gama de distribuições de partículas estão presentes. Para alguns projetos, é impossível determinar se a amostra está como desejada, por exemplo, onde um ligante está vinculado ou onde a amostra está sendo rastreada para avaliar se uma pequena subunidade (por exemplo, 10 kDa) ainda está presente em associação com um complexo. Para esses projetos, pipelines totalmente automatizados para análise de dados combinados com uma coleta 'curta' de 0,5 - 1 h, que podem prosseguir através de etapas de processamento de imagem para classificação 2D ou mesmo classificação e refinamento 3D ajudariam a determinar eficientemente se uma coleta mais longa é justificada. Esses gasodutos ainda estão em desenvolvimento e não são amplamente implementados no momento, mas têm o potencial de melhorar a eficiência da triagem da grade crioEM, especialmente para espécimes desafiadores.
Melhorias nos detectores de elétrons diretos, bem como modificações na microscopia combinadas com avanços no processamento de imagens, como a coleta de dados de mudança de imagem, aumentaram o rendimento e a qualidade das imagens produzidas durante a aquisição de dados. Esse aumento na taxa de dados coletados destaca a necessidade de uma triagem minuciosa das redes crioEM antes de muitos dados de TB serem adquiridos.
O CrioEM SPA tornou-se uma técnica de biologia estrutural verdadeiramente convencional e, em muitos casos, a abordagem "ir para" para algumas classes de espécimes, como complexos macromoleculares heterogêneos e labile. Embora o protocolo aqui descreva uma visão geral básica do pipeline SPA, cada seção aqui coberta (vitrificação e triagem de grade, crioEM e processamento de imagem) é um tópico por si só e digno de exploração durante o desenvolvimento de um projeto SPA. À medida que as tecnologias de preparação de amostras e microscopia avançam, e novos algoritmos e abordagens de processamento de imagens entram em operação, o SPA continuará a se desenvolver como um pipeline, auxiliando os pesquisadores a obter informações sobre sistemas biológicos complexos.

CrioEM de partícula única Para investigar a vida em um nível molecular devemos entender a estrutura. Muitas técnicas para sondar a estrutura proteica estão disponíveis, como NMR, cristalografia de raios-X, espectrometria de massa e microscopia eletrônica (EM). Até o momento, a maioria das estruturas depositadas no Protein Databank (PDB) foram resolvidas com cristalografia de raios-X. No entanto, a partir de ~2012, a microscopia crio-elétron (crioEM) tornou-se uma técnica mainstream para determinação da estrutura proteica e seu uso aumentou drasticamente. O número total de mapas EM depositados no Electron Microscopy Databank (EMDB) (a partir de dezembro de 2020) foi de 13.421 contra 1.566 em 2012 (Figura 1, www.ebi.co.uk). Em 2012, o número de coordenadas atômicas modeladas em mapas de densidade criodento, depositados no PDB era de apenas 67, mas a partir de dezembro de 2020, 2.309 estruturas foram depositadas até agora, um aumento de 35 vezes. Esse crescimento subjacente na qualidade e quantidade de mapas de densidade crioem produzidos, às vezes chamados de "revolução da resolução" 1, foi causado por uma coalescência de avanços em múltiplas áreas: o desenvolvimento de novas câmeras para imagens conhecidas como detectores de elétrons diretos; novo software; e microscópios mais estáveis2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Figura 1: Submissões cumulativas ao EMDB de 2012 a dezembro de 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
A análise de partículas simples (SPA) é uma poderosa ferramenta para gerar insights biológicos em uma ampla variedade de tipos de amostras, elucidando estruturas de alta resolução de complexos isolados5,6 incluindo vírus7,8, proteínas de membrana9,10, conjuntos helicoidais11 e outros complexos macromoleculares dinâmicos e heterogêneos12,13, os tamanhos dos quais variam por ordens de magnitude (a partir de 39 kDa 14,15 a dezenas de megadaltons). Aqui, é descrito um protocolo para um pipeline padrão para o CRIOEM SPA da amostra para a estrutura.
Antes de embarcar neste gasoduto, uma amostra purificada deve ser submetida à análise bioquímica para avaliar suas chances de sucesso a jusante. A preparação de uma amostra adequada é, sem dúvida, a maior barreira para o SPA, particularmente para complexos transitórios e heterogêneos (tanto composicionais quanto conformais). A preparação do complexo macromolecular deve conter o menor número possível de contaminantes, em concentração suficiente para produzir muitas partículas em cada micrografo crioEM, e em uma composição tampão bem adequada à análise crioEM. Certos componentes tampão, incluindo sacarose, glicerol e alto (~> concentrações de 350 mM de sais, dependendo do tamanho da amostra, propriedades e outros componentes tampão) podem interferir no processo de vitrificação ou reduzir a relação sinal-ruído nas imagens, dificultando a determinação da estrutura16.
Normalmente, como mínimo, a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e a análise do gel de PÁGINA SDS-PAGE devem ser usadas para avaliar a pureza da amostra17,18, mas o dichroismo circular, os ensaios funcionais, sec juntamente com dispersão de luz multi angle e ensaios de estabilidade térmica são ferramentas úteis para análise qualitativa de preparações complexas macromoleculares antes da análise crioEM. No entanto, os resultados dessas análises bioquímicas podem produzir pouca percepção sobre a heterogeneidade estrutural da amostra e seu comportamento em uma grade crioem. Por essa razão, a mancha negativa EM é rotineiramente usada como uma ferramenta rápida, barata e poderosa para avaliar a heterogeneidade composicional e conformacional e, portanto, uma boa maneira de verificar qual fração de eluição de uma purificação é mais promissora, ou selecionar diferentes composições tampão19,20. Uma vez identificada uma amostra promissora, podemos prosseguir para o oleoduto crioem SPA. A mancha negativa nem sempre se alinha com os resultados subsequentes observados no crioEM; às vezes uma amostra parece pobre por mancha negativa, mas melhora quando visto em gelo vítreo no crioEM. Em contraste, às vezes as amostras parecem excelentes durante as etapas de manchas negativas, mas requerem uma otimização significativa ao progredir para crioEM. No entanto, na maioria dos casos, a mancha negativa fornece uma etapa útil de controle de qualidade.
Vitrificação O ambiente severo dentro do sistema de vácuo do microscópio eletrônico causa tanto desidratação quanto danos à radiação em espécimes biológicos nãofixados21. Portanto, para a imagem da amostra em um estado nativo, o espécime biológico deve ser preservado antes da imagem. Para preparações purificadas de complexos macromoleculares, a vitrificação é o método de escolha para permitir sua visualização por crioEM, preservando os detalhes atômicos do complexo. A descoberta da vitrificação como método de preparação de amostras foi um avanço fundamental na microscopia eletrônica de espécimes biológicos, para a qual Dubochet foi reconhecido no Prêmio Nobel de Química de 2017. A vitrificação da amostra envolve a criação de uma fina camada de solução contendo o espécime de interesse, tipicamente dezenas de nm de espessura, suspensos em um suporte de grade crioEM. O filme fino é então congelado extremamente rapidamente em um criogen, como o etano líquido a ~-175 °C. A taxa de congelamento é de ~106 °C/s, rápido o suficiente para que formas de gelo amorfa, ou vítreos, suspendendo o espécime em uma película fina e sólida22.
A variável inicial a considerar é o suporte à grade crioEM escolhido23. Uma grade EM normalmente consiste em uma película de carbono amorfa com perfurações (regulares ou irregulares), sobre uma estrutura de suporte. A estrutura de suporte é tipicamente uma grade metálica circular de 3,05 mm de diâmetro, geralmente feita de cobre, mas outros metais como ouro, ou molbênio (que tem propriedades de expansão térmica preferidas24) podem ser usados. Às vezes, um suporte fino e contínuo adicional é aplicado em toda a grade, como grafeno, óxido de grafeno ou uma fina (~1-2 nm) camada de carbono amorfa. Enquanto as grades crioEM padrão (mais comumente 400-200 cobre de malha com perfurado (1,2 μm de orifícios redondos separados por 1,3 μm (r1.2//1.3), ou 2 μm separados por 2 μm de carbono (r2/2)) suporte a carbono- embora muitos padrões diferentes estejam disponíveis) têm sido usados na grande maioria das estruturas relatadas até o momento, novas tecnologias de grade com condutividade aprimorada e movimento reduzido de espécimes foram relatados25 . As grades selecionadas são submetidas a um tratamento de limpeza de descarga de brilho/plasma para torná-las hidrofílicas e favoráveis à aplicação da amostra26.
Após a descarga de brilho, a próxima etapa é a formação de filmes finos. Esta película fina é mais comumente formada usando papel filtro para remover o excesso de líquido da grade. Embora isso possa ser realizado manualmente, uma série de dispositivos de congelamento de mergulho estão disponíveis comercialmente, incluindo o Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) e CP3 (Gatan). Com esses dispositivos, ~3-5 μL de amostra na solução é aplicada à grade EM, seguido por blotting solução de excesso de manchas usando papel filtro. A grade, com uma película fina suspensa através dela, é então mergulhada em etano líquido resfriado por nitrogênio líquido (LN2) a ~-175 °C. Uma vez congelada, a rede é mantida a uma temperatura abaixo do ponto de desvitarificação (-137 °C) antes e durante a imagem.
Triagem de espécimes e coleta de dados Após a vitrificação de uma grade crioEM, o próximo estágio é telar a grade para avaliar sua qualidade e determinar se a grade é adequada para prosseguir para a coleta de dados de alta resolução. Uma grade crioEM ideal tem gelo vítreo (oposto ao gelo cristalino) com a espessura do gelo apenas suficiente para acomodar a maior dimensão do espécime, garantindo que o gelo circundante contribua com o mínimo de ruído para a imagem resultante possível. As partículas dentro do gelo devem ter uma forma de tamanho e (se conhecida) consistente com a bioquímica, e idealmente ser monodisperse com uma distribuição aleatória de orientações de partículas. Finalmente, a rede deve ter áreas suficientes de qualidade suficiente para satisfazer o comprimento desejado de coleta de dados. Dependendo do espécime, isso pode levar muitas iterações de vitrificação e triagem até que as grades ideais sejam produzidas. Felizmente e infelizmente, há uma enorme gama de variáveis que podem ser testadas empiricamente para alterar a distribuição de partículas em grades crioEM (revisadas em 16,27). Neste manuscrito, são mostrados resultados representativos para um projeto de proteína de membrana10.
Uma vez identificada uma grade adequada, a coleta de dados pode prosseguir. Vários modelos de microscópios eletrônicos de transmissão criotransiência para espécimes biológicos são otimizados para coletar dados de alta resolução de forma automatizada. Normalmente, os dados são coletados em sistemas de 300 kV ou 200 kV. A coleta automatizada de dados pode ser obtida utilizando softwares como EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 e SerialEM31,32. Uma coleta automatizada de dados com detectores modernos normalmente resulta em terabytes (TB) de dados brutos em um período de 24 horas (conjuntos de dados médios são ~ 4 TB em tamanho).
Devido às restrições COVID-19 em vigor em grande parte do mundo (tempo de escrita dezembro de 2020), muitas instalações de microscopia mudaram-se para oferecer acesso remoto. Uma vez que as grades tenham sido carregadas no carregador automático de um microscópio, a aquisição de dados pode ser conduzida remotamente.
Processamento de imagens e construção de modelos Quando uma sessão de coleta de dados pode ser tipicamente de 0,5-4 dias, o processamento subsequente de imagens pode levar muitas semanas e meses, dependendo da disponibilidade de recursos de computação. É padrão para etapas iniciais de processamento de imagem, ou seja, correção de movimento e estimativa de função de transferência de contraste (CTF) a ser realizada 'na hora' 33,34. Para o processamento a jusante, há uma infinidade de suítes de software disponíveis. As partículas são 'colhidas' e extraídas de micrografos35,36. Uma vez que as partículas são extraídas, um protocolo padrão seria processar as partículas através de várias rodadas de classificação (em ambas as dimensões (2D) e três dimensões (3D) e/ou focadas em regiões específicas de interesse) para alcançar um subconjunto homogêneo de partículas. Este subconjunto homogêneo de partículas é então mediado para produzir uma reconstrução 3D. Neste ponto, os dados são frequentemente corrigidos para produzir o mapa de maior qualidade possível, por exemplo através do refinamento CTF, correções de distorção37 e polimento bayesiano38 . O resultado deste processamento de imagem é um mapa crioEM 3D do espécime biológico de interesse. A faixa de resolução alcançada em um experimento automatizado de partículas únicas "padrão" a partir de uma grade de qualidade suficiente, com dados coletados em um sistema de microscópio de 300 kV é tipicamente entre 10 Å e 2 Å, dependendo do tamanho e flexibilidade do complexo proteico. Com um espécime ideal, resoluções de ~1.2 Å foram agora alcançadas usando fluxos de trabalho SPA5. Embora este protocolo detalhe os passos para obter um mapa de densidade EM, uma vez que isso esteja em mãos, ele pode ser interpretado ainda mais através do encaixe e refinamento de um modelo de proteína (se a resolução for < 3,5 Å) ou de construção de novo39. Os dados associados aos experimentos de determinação da estrutura podem ser depositados em repositórios públicos on-line, incluindo mapas de densidade EM (Electron Microscopy Data Bank)40, resultando em coordenadas atômicas (Protein Data Bank)41 e conjuntos de dados brutos (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
Neste protocolo, o complexo proteico de membrana externa RagAB (~340 kDa) de Porphyromonas gingivalis é usado como exemplo complexo macromolecular10 (EMPIAR-10543). Para aqueles novos para crioEM, o suporte para amostras através deste pipeline de amostra para estrutura está disponível, sujeito a revisão por pares, através de esquemas de acesso financiados como iNEXT Discovery e Instruct.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

A microscopia crio-elétron (crioEM) é uma técnica poderosa para a determinação estrutural de complexos macromoleculares, através da análise de partículas únicas (SPA). O processo geral envolve i) vitrificar o espécime em um filme fino apoiado em uma grade crioem; ii) triagem da amostra para avaliar a distribuição de partículas e a qualidade do gelo; iii) se a grade for adequada, coletando um único conjunto de dados de partículas para análise; e iv) processamento de imagem para produzir um mapa de densidade EM. Neste protocolo, é fornecida uma visão geral para cada uma dessas etapas, com foco nas variáveis que um usuário pode modificar durante o fluxo de trabalho e na solução de problemas de questões comuns. Com a operação de microscópio remoto se tornando padrão em muitas instalações, serão descritas variações nos protocolos de imagem para auxiliar os usuários em operação eficiente e imagem quando o acesso físico ao microscópio for limitado.

Ao serem rastreadas, as grades podem ser descartadas na fase atlas, onde recursos resolvidos em baixa ampliação marcam a grade como inadequada para aquisição de dados. Por exemplo, se uma grade foi sujeita a danos mecânicos significativos com a maioria dos quadrados de grade quebrados (Figura 2A), ou onde a grade parece estar 'seca', sem gelo vítreo (Figura 2B). Tais grades são tipicamente identificáveis à medida que as bordas dos quadrados da grade parecem afiadas e distintas. Na maioria das grades feitas usando o dispositivo de congelamento de mergulho, observa-se um gradiente de gelo (Figura 2C,D). A distribuição de partículas, dependendo da amostra de interesse, pode variar drasticamente com a espessura do gelo e, portanto, recomenda-se a triagem de uma variedade de quadrados de grade para avaliar a distribuição de partículas. Ferramentas foram implementadas dentro do software EPU durante a etapa de triagem do Atlas para ajudar o usuário a identificar quadrados de grade de espessura de gelo semelhante ou diferente, o que pode ser particularmente útil para usuários que são novos para examinar grades crioEM (Figura 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo de montagens de "atlas" de baixa ampliação das sessões de triagem. A) Uma grade que sofreu danos significativos com a maioria dos quadrados de grade quebrados - inadequados para coleta. B) Uma rede seca sem gelo vitreous - inadequada para coleta. C) Uma grade demonstrando um gradiente de gelo com ~ 50% da grade útil. D) Um gradiente de gelo com ~ 33% da rede útil. Ambos C e D, são adequados para coleta de dados se os quadrados de grade utilizáveis tiverem uma espessura de gelo adequada para coleta, e há áreas de aquisição suficientes para satisfazer a duração mínima de uma coleta (por exemplo, 24 h) E) Um atlas de exemplo com faixa de espessuras de gelo. F) O mesmo atlas apresentado em E, mas com quadrados de grade categorizados e coloridos pelo software EPU de acordo com a espessura do gelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Ao triagem da distribuição de partículas, certifique-se de que os parâmetros de imagem, como ampliação e dose total de elétrons, são semelhantes aos esperados para serem usados durante a aquisição de dados, a fim de fornecer uma imagem precisa dos resultados esperados. Durante a triagem, uma distribuição ideal de partículas é monodisperse com uma gama de orientações de partículas visíveis (dependendo do espécime e do conhecimento existente da morfologia da partícula, isso pode ser desafiador de determinar) (Figura 3A). O gelo deve ser o mais fino possível enquanto acomoda as partículas maior dimensão, se o gelo é muito fino ele pode derreter quando iluminado com o feixe de elétrons. Isso causa movimento excessivo no micrografo, e áreas que exibem essa característica devem ser evitadas (Figura 3B). A partir da experiência coletiva, esse efeito é mais comumente observado quando há detergente no buffer. Isso pode resultar em gelo muito fino no centro do buraco e, portanto, as partículas podem ser fisicamente excluídas e forçadas para a borda. Este efeito é observado na Figura 3C, mas neste caso não é um exemplo extremo e essas imagens ainda contribuiriam de forma útil para um conjunto de dados. Finalmente, o gelo precisa ser vítreo; exclua quaisquer áreas da grade (ou grades) onde a maioria ou todas as imagens tiradas mostram gelo cristalino (Figura 3D) da aquisição de dados. Muitas vezes, o gelo não vitreous é observado na borda dos quadrados de grade. Os leitores são encaminhados para revisões detalhadas das variáveis que podem ser alteradas durante a vitrificação da grade16 e descrições do comportamento de partículas no ambiente de filme fino46,47 para obter mais informações.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Figura 3: Micrografias representativas mostrando diferentes distribuições de partículas. A) Uma distribuição 'ideal' de partículas monodispersas adotando uma gama de orientações. B) Gelo excessivamente fino no meio do buraco que ele deforma após a exposição ao feixe de elétrons causando movimento excessivo no micrografo. Este efeito é mais frequentemente observado quando o detergente está presente no buffer C) Onde o gelo é mais fino no centro do buraco, isso exclui fisicamente partículas do centro, causando aglomeração de partículas em direção à borda do buraco. Neste caso, não é extremo o suficiente para evitar que essas imagens sejam úteis, mas sugere que vale a pena selecionar áreas ligeiramente mais espessas. D) O gelo não é vitreous, os dados não devem ser coletados em áreas que se parecem com este micrografo de exemplo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O processamento de imagens on-the-fly pode ajudar a detectar erros e problemas com a aquisição de dados e, portanto, é sempre recomendado sempre que possível. Por exemplo, o movimento excessivo dentro dos micrografos pode indicar que a bomba turbo do carregador automático está ativa, ou os dados estão sendo coletados em um quadrado de grade rachado onde o gelo está se movendo significativamente no feixe de elétrons, indicando que o quadrado da grade deve ser ignorado. Na mosca, a estimativa do CTF pode revelar circunstâncias em que um ponto de foco positivo (em vez de desfocus) é aplicado (onde programas de estimativa de CTF e parâmetros para encontrar esses pontos são usados) e determinar o turno de fase onde uma placa de fase Volta48 é usada. Nos pipelines de processamento de imagens em tempo real geralmente incluem um resumo gráfico dos dados (Figura 4A) para facilitar que os usuários avaliem rapidamente a qualidade do micrográfico e decidam se são necessárias alterações de coleta de dados.
A seleção de partículas de micrografias, evitando "falsos positivos", como contaminação ou a película de suporte à rede, pode exigir otimização. No entanto, catadores de partículas como o crYOLO muitas vezes funcionam suficientemente bem usando parâmetros padrão para um 'primeiro passe' dos dados (Figura 4B), permitindo a progressão para a classe 2D em média onde pode ser mais fácil avaliar a qualidade dos dados e a probabilidade de sucesso a jusante. Para a maioria dos projetos, a classificação 2D de partículas de ~> 10k deve começar a revelar classes que têm detalhes de estrutura secundária. Para seguir para 3D, a fase de classificação 2D deve normalmente revelar classes que representam uma gama de orientações de partículas. Se for revelada uma orientação preferencial, mais iterações de preparação amostral16 ou aquisição de dados adicionais com a amostra inclinada podem ser necessárias49. Todas as classes que mostram detalhes da estrutura secundária devem ser escolhidas para levar adiante para análise 3D, enquanto partículas de "lixo" são descartadas (Figura 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Figura 4: Etapas iniciais de processamento de imagem. A) Saída de um script de processamento de imagem 'on the fly'. B) Exemplo de micrografo (à esquerda) com partículas adequadamente escolhidas automaticamente identificadas usando o modelo geral crYOLO (à direita, com partículas delimitadas por quadrados vermelhos) As barras de escala (brancas) são de 50 nm. C) Resultados da classificação 2D mostrando classes que foram descartadas no quadrado vermelho, e classes das quais as partículas foram selecionadas para posterior processamento em verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Um pequeno subconjunto de partículas pode ser usado para gerar um modelo inicial (Figura 5A). Este modelo inicial pode então ser usado como um modelo inicial em classificação 3D e refinamento. No caso do RagAB, o conjunto de dados continha três conformadores distintos que podem ser separados durante a classificação 3D (Figura 5B). As partículas que contribuem para cada uma dessas classes podem então ser tratadas de forma independente e usadas para refinar um mapa de densidade EM que pode então estar sujeito a mais interpretação e construção de modelos.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Figura 5: Gerando mapa de densidade 3D EM. A) Modelo inicial típico gerado usando RELION. B) Classificação 3D sobre 5 classes mostrando separação de partículas em três estados conformais distintos: aberto (verde), aberto (azul), fechado (roxo). C) Processo de criação de máscaras. O mapa do refinamento 3D (à esquerda) deve ser visualizado na quimera. O visualizador de volume pode então ser usado para identificar o limiar mais baixo no qual o mapa está livre de densidade desarticulada e noisy (meio). Esse valor limiar é insumo como limiar inicial de binarização no trabalho de criação da Máscara RELION. Uma saída de máscara de exemplo é mostrada em cinza (à direita). D) Mapa de densidade EM de alta resolução do estado aberto de RagAB (EMD-10245), filtrado e colorido pela resolução local (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

A determinação da estrutura dos complexos macromoleculares utilizando o crioEM tornou-se rotina para certas classes de proteínas e complexos. Aqui, este pipeline é resumido (preparação de amostras, triagem, aquisição e processamento de dados) e os leitores são direcionados para recursos e variáveis mais detalhados que podem ser alterados no caso de espécimes mais desafiadores.

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

A análise crio-EM de partículas únicas tornou-se uma técnica de rotina na caixa de ferramentas do biólogo estrutural aplicável a uma ampla gama de espécimes, incluindo proteínas de membrana, fibrilas amiloides, proteínas de ligação de ácido nucleico e vírus. Uma vez concluída a preparação da amostra e as grades carregadas no microscópio, a coleta de dados pode ser realizada remotamente em muitas instalações crio-EM, como o Laboratório de Bioestrutura de Astbury e o eBIC. Grandes barreiras à determinação bem-sucedida da estrutura muitas vezes residem nas etapas de preparação da amostra e triagem da grade com múltiplas iterações às vezes necessárias através desse processo.Aqui, demonstraremos a triagem remota da rede e a aquisição de dados de partículas únicas. Na guia carregador automático da interface do usuário do microscópio, tabe a caixa de opções usando a seta e pressione o botão de inventário. Isso verificará sequencialmente cada posição do para determinar se um cartucho está presente.O inventário será executado em cada slot sequencialmente. Quando todos os slots ocupados forem mapeados, o inventário vai parar. Destaque a grade a ser transferida para a coluna do microscópio e clique na carga.A etiqueta do slot passará de azul para amarelo assim que a grade tiver sido carregada com sucesso no palco. Para exibir as grades, abra o software EPU. Na página de preparação, selecione a óptica de aquisição e as configurações e selecione o predefinido do atlas no menu suspenso.Escolha predefinições de configuração de feixe apropriadas e pressione o conjunto de pressione para empurrar os parâmetros para o microscópio. Pressione para abrir as válvulas da coluna e insira a tela de gripe. Verifique se um feixe está visível e suficientemente espalhado e centrado para cobrir o detector.Se necessário, navegue até uma região mais fina da grade usando o joystick ou painéis de mão virtuais para controlar os movimentos do palco em X e Y.Levante a tela da gripe e tire uma imagem usando o botão de visualização em EPU. Na EPU, vá para a página do Atlas e pressione nova sessão. Selecione o formato de imagem MRC e digite um nome e local de pasta adequados para salvar a sessão de seleção e clique em solicitar.Selecione a triagem no menu à esquerda. Marque as caixas de seleção ao lado de cada grade para ter uma montagem atlas adquirida e, em seguida, inicie a sessão de triagem em EPU. Um atlas é adquirido para cada grade verificada e as praças de grade disponíveis são listadas após a conclusão.Cada atlas pode ser visto destacando-o na página de triagem. Quando concluído, revise os atlas coletados e identifique as grades adequadas para avaliar a qualidade da amostra em ampliações mais elevadas. Destaque a grade escolhida no menu de triagem EPU e clique na amostra de carga.No menu de triagem do atlas, selecione a grade atualmente carregada e mova o palco para um quadrado de grade contendo os orifícios preenchidos clicando com o botão direito do mouse sobre o local desejado na imagem da grade e selecionando o estágio de movimento aqui. Retorne à página de preparação do EPU e selecione a predefinição quadrada da grade. Abra a página de funções automáticas EPU e execute auto-eucentric por inclinação de palco com a predefinição quadrada da grade para mover a amostra para a altura eucêntrica.Na preparação do EPU, faça uma nova imagem de visualização quadrada da grade. Observe os valores cinzentos em diferentes orifícios indicando diferentes espessuras de gelo. Mova o palco sobre um buraco usando o clique com o botão direito e mova o palco aqui.Selecione o orifício ou a predefinição da altura eucêntrica e clique em visualização. Selecione a predefinição de aquisição de dados e defina uma ampliação que permita fácil identificação das partículas. Defina o desfoco deslocado para negativo de três a cinco micrômetros.Iterar através de etapas para reavaliar uma gama de espessura de gelo para distribuição de partículas, orientação e contaminação em toda a rede. Dependendo da disponibilidade de microscópio, continue diretamente à coleta de dados ou redes podem ser removidas do microscópio para coleta futura, inclusive em outros locais. Colete um atlas se não estiver disponível na triagem, configurando as configurações do Atlas e selecionando grade para adquirir o atlas.Adquira o atlas e clique no local da grade para ver a saída. Uma vez que o atlas esteja completo, defina cada uma das predefinições de configuração do feixe de acordo com as necessidades experimentais do projeto. Execute calibrações de mudança de imagem.Configure a sessão EPU selecionando a configuração da sessão de página EPU e, em seguida, selecionando uma nova sessão ou nova das preferências. Depois de selecionar uma nova sessão, um popup aparecerá fornecendo uma opção para usar configurações anteriores. As configurações serão carregadas automaticamente da sessão anterior para a atual EPU.Alternativamente, selecione novas entre as preferências e escolha um arquivo com preferências salvas para pré-carregar essas informações no EPU atual. Preencha o nome da sessão com algo informativo. Em tipo, selecione manual.Para o modo de aquisição, selecione o centro de furos preciso ou a aquisição mais rápida se a coleção de mudança de imagem livre de aberração estiver disponível e desejada. Selecione o formato de imagem desejado e selecione pasta de armazenamento e O EPU criará um diretório com o nome da sessão. Selecione a grade apropriada de acordo com a qual o espaçamento do orifício da grade está sendo usado e pressione a aplicação.Selecione um quadrado de grade inicial e defina um modelo de aquisição. Vá para a seleção quadrada. Se todos os quadrados forem verdes, clique em desmarcar tudo no canto superior esquerdo.Abra as telhas clicando com o botão direito do mouse e, em seguida, selecionando azulejo aberto. Adicione ou escolha um quadrado de grade clicando em selecionar e, em seguida, clicar com o botão direito do mouse e selecionar o estágio de movimento para o quadrado da grade. Vá para a seleção de buracos e pressione auto-eucentric.Espere até que uma imagem quadrada seja tirada. Se a função automática falhar, isso pode ser porque a altura está significativamente desligada. Pode ser ajustado manualmente usando a tela de gripe na ampliação quadrada da grade.Para medir o tamanho do orifício, mova-se e ajuste os círculos amarelos para que eles estejam sobre os orifícios com tamanho correto e espaçamento. Pressione encontrar buracos. Verifique se os buracos foram encontrados corretamente.Se não, mude o tamanho do furo e pressione encontrar buracos novamente. Se esse processo falhar consistentemente, considere mover-se para um número menor ou tamanho de ponto mais brilhante na ampliação quadrada da grade. Use o histograma de qualidade de gelo do filtro à direita para ajustar a seleção do orifício.Isso pode ser útil para excluir áreas com gelo espesso e gelo fino. Isso será lembrado para futuros quadrados de grade selecionados durante a sessão. Otimize a seleção de furos com as ferramentas no menu seleto na parte superior.Por exemplo, clique em remover orifícios próximos à barra de grade. Vá para a definição do modelo e pressione a aquisição. Clique em encontrar e centralizar o buraco.Altere o atraso após o turno e atrase após o tempo de mudança de imagem para um a cinco segundos, em seguida, se disponível, verifique o valor máximo de mudança de imagem é o desejado. Clique em adicionar área de aquisição e clique em qualquer lugar na imagem. Mova a área de aquisição para o local desejado.Adicione o intervalo de defoco no canto superior direito. Uma lista típica de desfoco para um projeto de proteína de membrana é negativa de 0,8 a negativo de desfoco de três micrômetros, em seguida, adicionar outras áreas de aquisição, organizando-as de tal forma que as áreas de aquisição não sejam duplamente expostas com o feixe. Clique em adicionar área de foco automático e clique em qualquer lugar da imagem.Mova a área de foco automático para o carbono em torno de um buraco. A prática padrão é focar automaticamente após o centro ao usar AFIS ou a cada cinco a 15 micrômetros, dependendo da variação de altura Z em todo o quadrado. Clique em adicionar área de medição de deriva.A medição de deriva realizada uma vez por quadrado de grade com um limiar definido de 0,05 nanômetros por segundo como uma configuração padrão. A área de medição de deriva pode se sobrepor diretamente com a área de foco automático. Certifique-se de que nem a área de deriva nem foco automático se sobreponham a uma área de aquisição.Volte para a seleção quadrada e selecione os quadrados para aquisição na grade. Use o número de áreas de aquisição e a taxa esperada de aquisição de dados para prever quantas áreas de aquisição são necessárias. Quando todos os quadrados desejados forem selecionados, pressione preparar todos os quadrados.Uma vez que cada quadrado é coletado, navegue entre os quadrados da grade e ajuste os orifícios usando a escova de seleção. Mova-se para um local de estágio sobre o espécime e use funções automáticas para definir a altura eucêntrica. Execute alinhamentos de microscópio usando software de microscópio descrito anteriormente e no texto.Realize o alinhamento livre de coma dentro das funções automáticas antes de reinserir e centralizar a abertura objetiva e corrigir o astigmatismo da lente objetiva com EPU. Certifique-se de que ambos os alinhamentos convergem em valores adequados. Antes de iniciar a execução automatizada de aquisição, certifique-se de que a bomba turbo do carregador automático esteja desligada e a abertura objetiva seja inserida, se necessário.Na aquisição automatizada, pressione a corrida de inicialização para iniciar a aquisição automatizada de dados. Usando este protocolo, grades quebradas ou secas podem ser rastreadas e descartadas na fase atlas. Um gradiente de gelo é observado na maioria das grades.Durante a triagem, uma distribuição ideal de partículas é monodisperada com uma gama de orientações de partículas visíveis. Se o gelo for muito fino, pode derreter quando iluminado com o feixe de elétrons, causando movimento excessivo no micrografo. Isso é mais comumente observado quando há detergente no buffer.O gelo precisa ser vítreo para que áreas da grade onde a maioria das imagens mostram gelo cristalino foram excluídos. O resumo gráfico dos dados foi incluído para avaliar a qualidade do micrográfico e decidir se são necessárias alterações na coleta de dados. Catadores de partículas como crYOLO funcionam suficientemente bem para uma primeira passagem dos dados, permitindo a progressão para a média da classe 2D.As classes que mostram detalhes da estrutura secundária devem ser escolhidas para análise 3D, enquanto as partículas de lixo devem ser descartadas. Um subconjunto de partículas pode ser usado para gerar um modelo inicial para classificação e refinamento 3D. No caso do RagAB, o conjunto de dados continha três conformadores distintos que podem ser separados durante a classificação 3D.É importante lembrar que o sucesso nas etapas de aquisição de dados e análise de imagem subsequentes dependem da obtenção e identificação de grades bem otimizadas durante a fase de triagem. Uma vez que um mapa de densidade 3D EM é obtido, ele pode ser interpretado ainda mais através da montagem e refinação de um modelo de proteína ou da construção de um modelo atômico de novo. A análise de partículas únicas crio-EM permite a determinação estruturada de muitos alvos que não eram possíveis anteriormente.Notavelmente, esses fluxos de trabalho têm sido recentemente usados para resolver estruturas de macromoléculas relacionadas ao COVID-19.

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