Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Эта работа была поддержана программой iNEXT-Discovery (Grant 871037), финансируемой программой Horizon 2020 Европейской комиссии. J B. R. White финансируется Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). Микроскопы FEI Titan Krios финансировались Университетом Лидса (премия UoL ABSL) и Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Мы благодарим М. Иаданзу за использование его сценария анализа микрофотографии. Мы благодарим Diamond Light Source за доступ и поддержку крио-ЭМ-установок в Национальном центре электронной биовизуализации Великобритании (eBIC), финансируемом Wellcome Trust, MRC и BBRSC.

О конфликте интересов не сообщается.

В этом протоколе мы описали базовый конвейер, применимый к образцам, поддающимся рутинному SPA. Хотя этот метод промокания тонкой пленки и витрификации фильтровальной бумаги, несомненно, является успешным, учитывая его использование в подавляющем большинстве проектов SPA на сегодняшний день, он имеет ряд недостатков. К ним относятся потери образца, медленные временные рамки (секунды), необходимые для формирования тонкой пленки и замораживания образца, сообщения о невоспроизводимости27 и сообщения о негативных последствиях использования фильтровальной бумаги для смывания лишней жидкости50. В последнее время были разработаны новые технологии для улучшения воспроизводимости тонкопленочного производства51,52. Были разработаны и другие технологии, которые сокращают время между нанесением образца и витрификацией53,54,55. В то время как методы тонкопленочного образования на основе фильтровальной бумаги остаются наиболее распространенным методом пробоподготовки SPA cryoEM на момент написания статьи, эти новые технологии могут принести ряд преимуществ с точки зрения эффективности и воспроизводимости витрификации сетки, а также создать новые возможности для привнесения дополнительных экспериментальных измерений, таких как временное разрешение и быстрое смешивание до витрификации.
Процесс скрининга сетки для большинства пользователей в настоящее время является качественным процессом, который включает в себя получение атласов с низким увеличением с последующим получением изображений с высоким увеличением по всей сетке для оценки распределения частиц. Хотя это достаточно надежный подход для некоторых типов образцов, может быть трудно оценить на глаз, действительно ли образец является тем, что исследователь надеется изобразить, или имеет предпочтительную ориентацию, например, с небольшими (<200 кДа) образцами или там, где морфология с низким разрешением затрудняет идентификацию на глаз, если присутствует диапазон распределений частиц. Для некоторых проектов невозможно определить, является ли образец желаемым, например, где лиганд связан или где образец проверяется для оценки того, присутствует ли небольшая (например, 10 кДа) субъединица в связи с комплексом. Для этих проектов полностью автоматизированные конвейеры для анализа данных в сочетании с «короткими» 0,5 - 1-часовыми коллекциями, которые могут проходить через этапы обработки изображений до 2D-классификации или даже 3D-классификации и уточнения, помогут эффективно определить, оправдана ли более длинная коллекция. Эти трубопроводы все еще находятся в стадии разработки и в настоящее время не получили широкого распространения, но они могут повысить эффективность скрининга сетки криоЭМ, особенно для сложных образцов.
Усовершенствования в прямых электронных детекторах, а также модификации в микроскопии в сочетании с достижениями в области обработки изображений, такими как сбор данных о сдвиге изображения, увеличили пропускную способность и качество изображений, полученных во время сбора данных. Это увеличение скорости собираемых данных подчеркивает необходимость тщательного скрининга криоЭМ-сетей перед получением многих ТБ данных.
CryoEM SPA стал по-настоящему распространенным методом структурной биологии, и во многих случаях подходом «перейти к» для некоторых классов образцов, таких как гетерогенные и лабильные макромолекулярные комплексы. В то время как протокол здесь описывает базовый обзор конвейера SPA, каждый раздел, рассматриваемый здесь (витрификация и скрининг сетки, криоЭМ и обработка изображений), является отдельной темой и заслуживает изучения во время разработки проекта SPA. По мере развития технологий подготовки образцов и микроскопии, а также появления новых алгоритмов и подходов к обработке изображений SPA будет продолжать развиваться как конвейер, помогая исследователям в получении понимания сложных биологических систем.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

Криоэлектронная микроскопия (криоЭМ) является мощным методом определения структуры высокомолекулярных комплексов с помощью анализа одиночных частиц (SPA). Общий процесс включает в себя i) остеклование образца в тонкой пленке, поддерживаемой на криоЭМ-сетке; ii) скрининг образца для оценки распределения частиц и качества льда; iii) если сетка подходит, сбор одного набора данных о частицах для анализа; и iv) обработка изображений для получения карты плотности ЭМ. В этом протоколе представлен обзор для каждого из этих шагов с акцентом на переменные, которые пользователь может изменить во время рабочего процесса, и устранение общих проблем. Поскольку удаленная работа микроскопа становится стандартом во многих учреждениях, будут описаны вариации протоколов визуализации, помогающие пользователям в эффективной работе и визуализации, когда физический доступ к микроскопу ограничен.

При скрининге сетки могут быть отброшены на этапе атласа, где объекты, разрешенные при низком увеличении, отмечают сетку как непригодную для сбора данных. Например, если сетка подверглась значительным механическим повреждениям, при этом большинство квадратов сетки было сломано (рисунок 2A), или когда сетка кажется «сухой», без стекловидного льда (рисунок 2B). Такие сетки обычно идентифицируются, поскольку края квадратов сетки кажутся четкими и отчетливыми. На большинстве решеток, выполненных с помощью погружного морозильного устройства, наблюдается градиент льда (рисунок 2C, D). Распределение частиц, в зависимости от интересующего образца, может резко варьироваться в зависимости от толщины льда, и поэтому рекомендуется скрининг ряда квадратов сетки для оценки распределения частиц. На этапе скрининга атласа в программном обеспечении EPU были внедрены инструменты, помогающие пользователю идентифицировать квадраты сетки аналогичной или различной толщины льда, что может быть особенно полезно для пользователей, которые являются новичками в изучении криоЭМ-сетей (рисунок 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Рисунок 2: Пример монтажей «атласа» с низким увеличением из сеансов скрининга. А) Сетка, которая получила значительный ущерб, при этом большинство квадратов сетки сломано - непригодна для сбора. Б) Сухая сетка без стекловидного льда - непригодна для сбора. C) Сетка, демонстрирующая градиент льда с ~ 50% используемой сетки. D) Градиент льда с ~ 33% используемой сетки. Как C , так и D подходят для сбора данных, если пригодные для использования квадраты сетки имеют толщину льда, подходящую для сбора, и имеется достаточно областей сбора для удовлетворения минимальной продолжительности сбора (например, 24 ч) E) Пример атласа с диапазоном толщин льда. F) Тот же атлас, представленный в E, но с квадратами сетки, классифицированными и окрашенными программным обеспечением EPU в соответствии с толщиной льда. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
При скрининге распределения частиц убедитесь, что параметры визуализации, такие как увеличение и общая доза электронов, аналогичны тем, которые, как ожидается, будут использоваться при сборе данных, чтобы обеспечить точную картину ожидаемых результатов. Во время скрининга идеальное распределение частиц является монодисперсным с видимым диапазоном ориентаций частиц (в зависимости от образца и существующих знаний о морфологии частицы, это может быть трудно установить) (рисунок 3A). Лед должен быть как можно более тонким, вмещая частицы наибольшего размера, если лед слишком тонкий, он может растаять при освещении электронным пучком. Это вызывает чрезмерное движение на микрофотографии, и следует избегать областей, которые отображают эту характеристику (рисунок 3B). Исходя из коллективного опыта, этот эффект чаще всего наблюдается, когда в буфере есть моющее средство. Это может привести к очень тонкому льду в центре отверстия, и поэтому частицы могут быть физически исключены и вытеснены к краю. Этот эффект наблюдается на рисунке 3C, но в данном случае это не экстремальный пример, и эти изображения все равно будут полезно вносить свой вклад в набор данных. Наконец, лед должен быть стекловидным; исключить любые области сетки (или сетки), где большинство или все сделанные изображения показывают кристаллический лед (рисунок 3D) из сбора данных. Часто нестеклевидный лед наблюдается на краю квадратов сетки. Для получения дополнительной информации читателям предлагается ознакомиться с подробными обзорами переменных, которые могут быть изменены во время витрификации сетки16, и описаниями поведения частиц в тонкопленочной среде46,47.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Рисунок 3: Репрезентативные микроснимки, показывающие различные распределения частиц. А) «Идеальное» распределение монодисперсных частиц, принимающих диапазон ориентаций. Б) Чрезмерно тонкий лед в середине отверстия, который деформируется при воздействии электронного пучка, вызывающего чрезмерное движение на микрофотографии. Этот эффект чаще всего наблюдается, когда моющее средство присутствует в буфере C) Там, где лед тоньше в центре отверстия, это физически исключает частицы из центра, вызывая скопление частиц к краю отверстия. В этом случае это не достаточно экстремально, чтобы предотвратить эти изображения, но это говорит о том, что стоит отсеивать немного более толстые области. Г) Лед не стекловидный, данные не должны собираться по областям, которые выглядят как этот пример микрофотографии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Обработка изображений на лету может помочь выявить ошибки и проблемы с получением данных, и поэтому всегда рекомендуется, где это возможно. Например, чрезмерное движение в пределах микроснимков может указывать на то, что турбонасос автозагрузчика активен, или данные собираются на трещиноватом квадрате сетки, где лед значительно перемещается в электронном пучке, что указывает на то, что квадрат сетки должен быть пропущен. На лету оценка CTF может выявить обстоятельства, при которых применяется положительная точка фокусировки (а не расфокусировка) (где используются программы и параметры оценки CTF для поиска этих точек), и определить сдвиг фазы, где используется фазовая пластина Volta48. Конвейеры обработки изображений «на лету» часто включают графическое резюме данных (рисунок 4A), чтобы облегчить пользователям быструю оценку качества микрофотографии и решить, требуются ли поправки к сбору данных.
Отбор частиц из микроснимков, избегая при этом «ложных срабатываний», таких как загрязнение или пленка поддержки сетки, может потребовать оптимизации. Тем не менее, средства выбора частиц, такие как crYOLO, часто работают достаточно хорошо, используя параметры по умолчанию для «первого прохода» данных (рисунок 4B), что позволяет перейти к усреднению 2D-классов, где может быть легче оценить качество данных и вероятность последующего успеха. Для большинства проектов 2D-классификация ~> 10k частиц должна начать выявлять классы, которые имеют вторичную структуру деталей. Чтобы перейти к 3D, этап 2D-классификации обычно должен раскрывать классы, представляющие диапазон ориентаций частиц. Если выявлена предпочтительная ориентация, может потребоваться больше итераций подготовки образца16 или дальнейшего сбора данных с наклоном образца49. Все классы, которые показывают детали вторичной структуры, должны быть выбраны для перехода к 3D-анализу, в то время как «мусорные» частицы отбрасываются (рисунок 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Рисунок 4: Начальные этапы обработки изображений. A) Вывод из скрипта обработки изображений «на лету». B) Пример микрофотографии (слева) с соответствующим образом автоматически подобранными частицами, идентифицированными с использованием общей модели crYOLO (справа, с частицами, ограниченными красными квадратами) Шкала (белая) составляет 50 нм. C) Результаты 2D-классификации, показывающие классы, которые были отброшены в красный квадрат, и классы, из которых были выбраны частицы для дальнейшей обработки зеленым цветом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Небольшое подмножество частиц может быть использовано для создания исходной модели (рисунок 5A). Эта начальная модель затем может быть использована в качестве исходной модели в 3D-классификации и уточнении. В случае RagAB набор данных содержал три различных конформера, которые могут быть разделены во время 3D-классификации (рисунок 5B). Частицы, вносящие вклад в каждый из этих классов, затем могут быть обработаны независимо и использованы для уточнения карты плотности ЭМ, которая затем может быть подвергнута дальнейшей интерпретации и построению модели.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Рисунок 5: Создание карты плотности 3D EM. A) Типичная исходная модель, сгенерированная с помощью RELION. B) 3D-классификация по 5 классам, показывающая разделение частиц на три различных конформационных состояния: открыто-открытое (зеленое), открытое-закрытое (синий), закрытое-закрытое (фиолетовое). В) Процесс создания маски. Карта из 3D уточнения (слева) должна быть визуализирована в химере. Затем вьюер томов может быть использован для определения самого низкого порога, при котором карта свободна от разрозненной, шумной плотности (средняя). Это пороговое значение вводится в качестве начального порога бинаризации в задании создания маски RELION. Пример вывода маски показан серым цветом (справа). D) Карта плотности ЭМ высокого разрешения открытого-закрытого состояния RagAB (EMD-10245), отфильтрованная и окрашенная локальным разрешением (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Определение структуры высокомолекулярных комплексов с помощью криоЭМ стало рутиной для определенных классов белков и комплексов. Здесь этот конвейер обобщается (подготовка образцов, скрининг, сбор и обработка данных), и считыватели направляются к более подробным ресурсам и переменным, которые могут быть изменены в случае более сложных образцов.

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Ручное замораживание биологических образцов для одночастичной криогенной электронной микроскопии

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Получение частиц ядра нуклеосом в комплексе с факторами репарации ДНК для определения структуры криоэлектронной микроскопии

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Извлечение модифицированных микротрубочек из клеток млекопитающих для изучения микротрубочек-белковых комплексов методом криоэлектронной микроскопии

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...