Name: single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Detta arbete stöddes av iNEXT-Discovery (Grant 871037) som finansierades av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program. J B. R. White finansieras av Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). FEI Titan Krios mikroskop finansierades av University of Leeds (UoL ABSL award) och Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Vi tackar M Iadanza för användningen av hans mikrografanalysskript. Vi bekräftar Diamond Light Source för åtkomst och stöd till kryo-EM-anläggningarna vid Storbritanniens nationella Electron Bio-imaging Centre (eBIC) som finansieras av Wellcome Trust, MRC och BBRSC.

Inga intressekonflikter rapporteras.

I detta protokoll har vi beskrivit en grundläggande pipeline som är tillämplig på exemplar som är mottagliga för rutinmässiga SPA. Även om denna filterpapper blottningsmetod för tunnfilmsbildning och vitrifikation utan tvekan är framgångsrik med tanke på dess användning i de allra flesta SPA-projekt hittills, kommer det med ett antal nackdelar. Dessa inkluderar provsvinn, de långsamma tidsskalor (sekunder) som krävs för att bilda den tunna filmen och frysa provet, rapporterad irreproduktivitet27 och rapporterade negativa effekter av att använda filterpapper för att utplåna överflödig vätska50. Nyligen har ny teknik utvecklats för att förbättra reproducerbarheten av tunnfilmsproduktion51,52. Annan teknik har utvecklats som minskar tiden mellan provtillämpning och vitrifikation53,54,55. Även om filterpappersbaserade metoder för tunnfilmsbildning fortfarande är den mest allestädes närvarande metoden för SPA cryoEM-provberedning i skrivande stund, kan dessa nya tekniker medföra en rad fördelar när det gäller effektivitet och reproducerbarhet av nätvitrifiering, samt skapa nya möjligheter att få in ytterligare experimentella dimensioner, såsom tidsupplösning och snabb blandning före vitrifikation.
Processen med nätscreening för de flesta användare är för närvarande en kvalitativ process som innebär förvärv av atlaser med låg förstoring följt av att ta bilder med hög förstoring över nätet för att bedöma partikelfördelningen. Även om detta är ett tillräckligt robust tillvägagångssätt för vissa typer av prov, kan det vara svårt att bedöma med ögat om provet verkligen är vad forskaren hoppas kunna avbilda eller har en föredragen orientering, till exempel med små (<200 kDa) prover eller där den lågupplösta morfologin gör det svårt att identifiera med ögat om det finns en rad partikelfördelningar. För vissa projekt är det omöjligt att avgöra om exemplaret är som önskat, till exempel var en ligand är bunden eller var provet screenas för att bedöma om en liten (t.ex. 10 kDa) underenhet fortfarande finns i samband med ett komplex. För dessa projekt skulle helautomatiska pipelines för dataanalys i kombination med en "kort" 0,5- 1-h-samlingar, som kan fortsätta genom bildbehandlingssteg till 2D-klassificering eller till och med 3D-klassificering och förfining, hjälpa till att effektivt avgöra om en längre samling är berättigad. Dessa rörledningar är fortfarande under utveckling och är inte allmänt genomförda för närvarande, men de har potential att förbättra effektiviteten i cryoEM-nätscreening, särskilt för utmanande exemplar.
Förbättringar av direkta elektrondetektorer, liksom modifieringar inom mikroskopi i kombination med framsteg inom bildbehandling såsom insamling av bildskiftsdata, har ökat genomströmningen och kvaliteten på de bilder som produceras vid datainsamling. Denna ökning av den datahastighet som samlas in belyser behovet av noggrann screening av kryoEM-nät innan många TB data förvärvas.
CryoEM SPA har blivit en verkligt mainstream strukturell biologi teknik, och i många fall "gå till" strategi för vissa klasser av exemplar, såsom heterogena och labila makromolekylära komplex. Protokollet här beskriver en grundläggande översikt över SPA-pipelinen, men varje avsnitt som behandlas här (nätvitrifiering och screening, cryoEM och bildbehandling) är ett ämne i sig och värt att utforska under utvecklingen av ett SPA-projekt. I takt med att provberednings- och mikroskopitekniken utvecklas och nya algoritmer och metoder för bildbehandling kommer online kommer SPA att fortsätta att utvecklas som en pipeline, vilket hjälper forskare att få insikt i komplexa biologiska system.

En partikel CryoEM För att undersöka livet på molekylär nivå måste vi förstå struktur. Många tekniker för att undersöka proteinstruktur finns tillgängliga, såsom NMR, röntgenkristallografi, masspektrometri och elektronmikroskopi (EM). Hittills har de flesta strukturer som deponerats på Protein Databank (PDB) lösts med hjälp av röntgenkristallografi. Men från ~ 2012 och framåt blev kryoelektronmikroskopi (cryoEM) en mainstream-teknik för proteinstrukturbestämning och dess användning ökade dramatiskt. Det totala antalet EM-kartor som deponerades på Electron Microscopy Databank (EMDB) (i december 2020) var 13 421 jämfört med 1 566 år 2012 (figur 1, www.ebi.co.uk). År 2012 var antalet atomkoordinater modellerade i kryoEM-densitetskartor, deponerade på PDB bara 67 men i december 2020 har 2 309 strukturer deponerats hittills, en 35-faldig ökning. Denna underliggande ökning av kvaliteten och kvantiteten av kryoEM-densitetskartor som producerades, ibland kallad "upplösningsrevolutionen"1, orsakades av en sammanslagning av framsteg på flera områden: utveckling av nya kameror för avbildning som kallas direkta elektrondetektorer; Ny programvara. och stabilare mikroskop2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Figur 1: Kumulativa inlagor till EMDB från 2012 till december 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Single particle analysis (SPA) är ett kraftfullt verktyg för att generera biologisk insikt i en mängd olika provtyper genom att belysa högupplösta strukturer av isolerade komplex5,6 inklusive virus7,8, membranproteiner9,10, spiralformade sammansättningar11 och andra dynamiska och heterogena makromolekylära komplex12,13, vars storlek varierar beroende på storleksordning (från 39 kDa 14,15 till tiotals megadalton). Här beskrivs ett protokoll för en standardpipeline för cryoEM SPA från exempel till struktur.
Innan detta rörledning påbörjas bör ett renat prov genomgå biokemisk analys för att bedöma dess chanser att lyckas nedströms. Beredning av ett lämpligt prov är utan tvekan det största hindret för SPA, särskilt för övergående och heterogena (både sammansättnings- och konformationella) komplex. Makromolekylära komplexa preparatet bör innehålla så få föroreningar som möjligt, vid tillräcklig koncentration för att ge många partiklar i varje cryoEM-mikrograf och i en buffertkomposition som är väl lämpad för kryoEM-analys. Vissa buffertbeståndsdelar, inklusive sackaros, glycerol och hög (~> 350 mM koncentrationer av salter, beroende på provstorlek, egenskaper och andra buffertbeståndsdelar) kan störa processen för vitrifikation eller minska signal-till-brus-förhållandet i bilder, vilket hindrar strukturbestämning16.
Vanligtvis bör storleksuteslutningskromatografi (SEC) och SDS- PAGE gelanalys användas för att bedöma provrenhet17,18, men cirkulär dichroism, funktionella analyser, SEC i kombination med flervinkelljusspridning och termiska stabilitetsanalyser är alla användbara verktyg för kvalitativ analys av makromolekylära komplexa preparat före kryoEM-analys. Resultaten från dessa biokemiska analyser kan dock ge liten insikt i provets strukturella heterogenitet och dess beteende på ett kryoEM-rutnät. Av denna anledning används negativ fläck EM rutinmässigt som ett snabbt, billigt och kraftfullt verktyg för att bedöma kompositionell och konformationell heterogenitet, och därför ett bra sätt att fastställa vilken elutionsfraktion från en rening som är mest lovande, eller screening av olika buffertkompositioner19,20. När ett lovande prov har identifierats kan vi gå vidare till SPA cryoEM-pipelinen. Negativ fläck överensstämmer inte alltid med de efterföljande resultaten som ses i cryoEM; ibland ser ett prov dåligt ut av negativ fläck men förbättras när det ses i glasaktig is i cryoEM. Däremot ser ibland prover utmärkta ut under negativa fläcksteg men kräver betydande ytterligare optimering när du går vidare till cryoEM. Men i de flesta fall ger negativ fläck ett användbart kvalitetskontrollsteg.
Förglasning Den hårda miljön i elektronmikroskopets vakuumsystem orsakar både uttorkning och strålningsskador på ofixerade biologiska exemplar21. För att avbilda provet i ett inhemskt tillstånd måste därför det biologiska provet bevaras före avbildning. För renade preparat av makromolekylära komplex är vitrifikation den metod som valts för att möjliggöra dess visualisering genom cryoEM samtidigt som de atomiska detaljerna i komplexet bevaras. Upptäckten av vitrifikation som en metod för provberedning var ett grundläggande framsteg inom elektronmikroskopi av biologiska exemplar, för vilket Dubochet uppmärksammades i Nobelpriset i kemi 2017. Provvitrifiering innebär att skapa ett tunt lager av lösning som innehåller det prov av intresse, vanligtvis tiotals nm tjockt, upphängt på ett kryoEM-rutnätsstöd. Den tunna filmen fryses sedan extremt snabbt i en kryogen som flytande etan vid ~-175 °C. Fryshastigheten är ~106 °C/s, tillräckligt snabb för att amorf eller glasaktig is bildas, vilket suspenderar provet i en tunn, fast film22.
Den första variabeln att tänka på är kryoEM-rutnätsstödet som valts23. Ett EM-rutnät består vanligtvis av en amorf kolfilm med perforeringar (antingen regelbundna eller oregelbundna) över en stödstruktur. Stödstrukturen är vanligtvis ett cirkulärt metallnät med en diameter på 3,05 mm, vanligtvis tillverkad av koppar, men andra metaller som guld eller molybden (som har föredragna termiska expansionsegenskaper24) kan användas. Ibland appliceras ytterligare ett tunt, kontinuerligt stöd över nätet, såsom grafen, grafenoxid eller ett tunt (~ 1-2 nm) amorft kolskikt. Medan standard cryoEM-galler (oftast 400-200 mesh koppar med perforerad (1,2 μm runda hål åtskilda av 1,3 μm (r1,2/1,3), eller 2 μm åtskilda av 2 μm kol (r2/2)) har kolstöd - även om många olika mönster finns tillgängliga) använts i de allra flesta strukturer som rapporterats hittills, har ny nätteknik med förbättrad ledningsförmåga . Utvalda galler utsätts för en behandling för rengöring av glöd-urladdning/plasma för att göra dem hydrofila och mottagliga för provtillämpning26.
Efter glödurladdning är nästa steg tunnfilmsbildning. Denna tunna film bildas oftast med filterpapper för att avlägsna överflödig vätska från gallret. Även om detta kan utföras manuellt finns ett antal dykfrysningsanordningar kommersiellt tillgängliga, inklusive Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) och CP3 (Gatan). Med dessa enheter appliceras ~3-5 μL prov i lösning på EM-nätet, följt av att man blottar bort överflödig lösning med filterpapper. Gallret, med en tunn film upphängd över sig, kastas sedan i flytande etan som kyls av flytande kväve (LN2) till ~-175 °C. När gallret har frusits hålls det vid en temperatur under devitrifieringspunkten (-137 °C) före och under avbildningen.
Screening och datainsamling av prov Efter vitrifikation av ett kryoEM-rutnät är nästa steg att screena rutnätet för att bedöma dess kvalitet och avgöra om rutnätet är lämpligt för att gå vidare till högupplöst datainsamling. Ett idealiskt kryoEM-galler har glasaktig is (i motsats till kristallin is) med istjockleken precis tillräcklig för att rymma den längsta dimensionen av provet, vilket säkerställer att den omgivande isen bidrar med så lite ljud till den resulterande bilden som möjligt. Partiklarna i isen ska ha en storlek och (om känd) form som överensstämmer med biokemin, och helst vara monodisperse med en slumpmässig fördelning av partikelorienteringar. Slutligen bör nätet ha tillräckligt med områden av tillräcklig kvalitet för att uppfylla önskad datainsamlingslängd. Beroende på exemplaret kan detta ta många iterationer av vitrifikation och screening tills optimala galler produceras. Både lyckligtvis och tyvärr finns det ett stort antal variabler som kan testas empiriskt för att ändra partikelfördelningen på kryoEM-rutnät (granskas 16,27). I detta manuskript visas representativa resultat för ett membranproteinprojekt10.
När ett lämpligt rutnät har identifierats kan datainsamlingen fortsätta. Flera modeller av kryotransitiva elektronmikroskop för biologiska exemplar är optimerade för att samla in högupplösta data på ett automatiserat sätt. Vanligtvis samlas data in på 300 kV- eller 200 kV-system. Automatiserad datainsamling kan uppnås med hjälp av programvara som EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 och SerialEM31,32. En automatiserad datainsamling med moderna detektorer resulterar vanligtvis i terabyte (TB) rådata under en 24-timmarsperiod (genomsnittliga datamängder är ~ 4 TB i storlek).
På grund av covid-19-restriktionerna på stora delar av världen (i skrivande stund december 2020) har många mikroskopianläggningar flyttat till att erbjuda fjärråtkomst. När näten har laddats in i en mikroskops autoloader kan datainsamlingen utföras på distans.
Bildbehandling och modellbyggnad Om en datainsamlingssession vanligtvis kan vara 0,5-4 dagar kan efterföljande bildbehandling ta många veckor och månader, beroende på tillgängligheten av datorresurser. Det är standard för inledande bildbehandlingssteg, nämligen uppskattning av rörelsekorrigering och kontrastöverföringsfunktion (CTF) som ska äga rum "i farten" 33,34. För bearbetning nedströms finns det en mängd programvarusviter tillgängliga. Partiklar "plockas" och extraheras från mikrografer35,36. När partiklarna har extraherats skulle ett standardprotokoll vara att bearbeta partiklarna genom flera omgångar av klassificering (i båda dimensionerna (2D) och tre dimensioner (3D) och/eller fokuserade på specifika områden av intresse) för att nå en homogen delmängd av partiklar. Denna homogena delmängd av partiklarna beräknas sedan tillsammans för att producera en 3D-rekonstruktion. Vid denna tidpunkt korrigeras ofta data ytterligare för att producera högsta möjliga kvalitetskarta, till exempel genom CTF-förfining, förvrängningskorrigeringar37 och Bayesian polering38 . Resultatet av denna bildbehandling är en 3D cryoEM karta över det biologiska exemplaret av intresse. Upplösningsområdet som uppnås i ett "standard" automatiserat enpartikelexperiment från ett rutnät av tillräcklig kvalitet, med data som samlas in på ett 300 kV mikroskopsystem är vanligtvis mellan 10 Å och 2 Å beroende på proteinkomplexets storlek och flexibilitet. Med ett idealiskt exemplar har upplösningar på ~1,2 Å nu uppnåtts med hjälp av SPA-arbetsflöden5. Även om detta protokoll beskriver steg mot att få en EM-densitetskarta, kan den när den är i handen tolkas ytterligare genom montering och raffinering av en proteinmodell (om upplösningen är < 3,5 Å) eller bygga de novo39. Data som är associerade med experiment för strukturbestämning kan deponeras i offentliga online-databaser, inklusive EM-densitetskartor (Electron Microscopy Data Bank)40, resulterande atomkoordinater (Protein Data Bank)41 och råa datamängder (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
I detta protokoll används det yttre membranproteinkomplexet RagAB (~ 340 kDa) från Porphyromonas gingivalis som ett exempel makromolekylärt komplex10 (EMPIAR-10543). För dem som är nya inom cryoEM är stöd för prover via denna pipeline från exempel till struktur tillgängligt, föremål för inbördes granskning, genom finansierade åtkomst system som iNEXT Discovery och Instruct.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo EM round storage box</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM autogrid boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1084591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoEM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td>Boc</td>
			<td>270595-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; foam dewar</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AG81760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2&#160; storage dewar</td>
			<td>Worthington industries</td>
			<td>HC 34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>10082012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Star labs</td>
			<td>s1111-1706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II lab water</td>
			<td>Suez</td>
			<td>select fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot styrophome container assembly</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot tweesers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72882-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2.8.1.10REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6.15.3.22415REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tia</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5.0.0.2896REL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan krios microscope</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure

Cryo-elektronmikroskopi (cryoEM) är en kraftfull teknik för strukturbestämning av makromolekylära komplex, via enstaka partikelanalys (SPA). Den övergripande processen innebär i) vitrifiera exemplaret i en tunn film som stöds på ett kryoEM-rutnät; ii) Screening av provexemplaret för att bedöma partikelfördelning och iskvalitet, iii) Om gallret är lämpligt, samla in en enda partikeldatauppsättning för analys. och iv) bildbehandling för att ge en EM-densitetskarta. I det här protokollet ges en översikt för vart och ett av dessa steg, med fokus på de variabler som en användare kan ändra under arbetsflödet och felsökning av vanliga problem. I och med att fjärrmikroskopdrift blir standard i många anläggningar kommer variationer på bildprotokoll för att hjälpa användare att effektivt använda och avbilda när den fysiska tillgången till mikroskopet är begränsad att beskrivas.

Vid screening kan rutnät kasseras i atlasstadiet, där funktioner som löses vid låg förstoring markerar rutnätet som inte lämpligt för datainsamling. Till exempel om ett galler har utsatts för betydande mekanisk skada med de flesta rutnätsrutor brutna (figur 2A), eller där gallret verkar vara "torrt", utan glaskroppsis (figur 2B). Sådana rutnät är vanligtvis identifierbara eftersom kanterna på rutnätsrutorna verkar skarpa och distinkta. Över de flesta galler som tillverkas med hjälp av dykfrysningsanordningen observeras en isgradient (figur 2C,D). Partikelfördelningen, beroende på vilket prov som är av intresse, kan variera dramatiskt med istjocklek och därför rekommenderas screening av en rad rutrutor för att bedöma partikelfördelningen. Verktyg har implementerats inom EPU-programvaran under atlasscreeningssteget för att hjälpa användaren att identifiera rutnätsrutor med liknande eller annan istjocklek, vilket kan vara särskilt användbart för användare som är nya för att undersöka kryoEM-nät (figur 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Bild 2: Exempel på "atlasmontage" med låg förstoring från screeningsessioner. A) Ett galler som har lidit betydande skador med de flesta rutnätsrutor trasiga - olämpliga för insamling. B) Ett torrt galler utan glasaktig is - olämpligt för uppsamling. C) Ett rutnät som visar en isgradient med ~ 50% av rutnätet användbart. D) En isgradient med ~ 33% av gallret användbart. Både C och D är lämpliga för datainsamling om de användbara rutorna har en istjocklek som är lämplig för insamling, och det finns tillräckligt med förvärvsområden för att uppfylla den minsta varaktigheten för en insamling (t.ex. 24 h) E) Ett exempelatlas med istjocklekar. F) Samma atlas presenteras i E men med rutnätsrutor kategoriserade och färgade av EPU-programvara enligt istjocklek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Vid screening av partikelfördelning, se till att bildparametrar, såsom förstoring och total elektrondos, liknar dem som förväntas användas vid datainsamling för att ge en korrekt bild av förväntade resultat. Under screeningen är en idealisk partikelfördelning monodispers med en rad synliga partikelorienteringar (beroende på provet och befintlig kunskap om partikelns morfologi kan detta vara utmanande att fastställa) (figur 3A). Isen ska vara så tunn som möjligt samtidigt som den rymmer partiklarnas största dimension, om isen är för tunn kan den smälta när den belyses med elektronstrålen. Detta orsakar överdriven rörelse i mikrografen, och områden som visar denna egenskap bör undvikas (figur 3B). Av kollektiv erfarenhet observeras denna effekt oftast när det finns tvättmedel i bufferten. Detta kan resultera i mycket tunn is i mitten av hålet och därför kan partiklar fysiskt uteslutas och tvingas mot kanten. Den här effekten observeras i figur 3C, men i det här fallet är det inte ett extremt exempel och dessa bilder skulle fortfarande användbart bidra till en data uppsättning. Slutligen måste isen vara glasaktig; exkludera områden i rutnätet (eller rutnäten) där majoriteten eller alla bilder som tagits visar kristallin is (figur 3D) från datainsamling. Ofta observeras icke-glasaktig is vid kanten av gallerrutor. Läsare hänvisas till detaljerade recensioner av variablerna som kan ändras under gallervitrifiering16 och beskrivningar av partikelbeteende i tunnfilmsmiljön46,47 för ytterligare information.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Figur 3: Representativa mikrografer som visar olika partikelfördelningar. A) En "idealisk" fördelning av monodisperspartiklar som antar en rad olika inriktningar. B) Alltför tunn is i mitten av hålet som den deformerar vid exponering för elektronstrålen och orsakar överdriven rörelse i mikrografen. Denna effekt observeras oftast när tvättmedel finns i bufferten C) Där isen är tunnare i mitten av hålet utesluter detta fysiskt partiklar från mitten, vilket orsakar trängsel av partiklar mot hålkanten. I det här fallet är det inte tillräckligt extremt för att förhindra att dessa bilder är användbara, men det tyder på att det är värt att undersöka något tjockare områden. D) Is är inte glasaktigt, data bör inte samlas in på områden som ser ut som detta exempel mikrograf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Bildbehandling i farten kan hjälpa till att plocka upp fel och problem med datainsamling och rekommenderas därför alltid där det är möjligt. Överdriven rörelse inom mikrografer kan till exempel indikera att autoloader turbopumpen är aktiv, eller data samlas in på en sprucken rutnätsruta där is rör sig avsevärt i elektronstrålen, vilket indikerar att rutnätsrutan ska hoppas över. I farten kan CTF-uppskattning avslöja omständigheter där en positiv fokuspunkt (snarare än defokus) tillämpas (där CTF-uppskattningsprogram och parametrar för att hitta dessa punkter används) och bestämma fasförskjutningen där en Volta-fasplatta48 används. I farten innehåller bildbehandlingspipelines ofta en grafisk sammanfattning av uppgifterna (figur 4A) för att göra det lättare för användare att snabbt bedöma mikrografkvaliteten och avgöra om ändringar av datainsamling krävs.
Val av partiklar från mikrografer, samtidigt som man undviker "falska positiva" som förorening eller rutnätsstödfilmen kan kräva optimering. Partikelplockare som crYOLO fungerar dock ofta tillräckligt bra med standardparametrar för ett "första pass" av data (figur 4B), vilket möjliggör progression till 2D-klassgenom genomsnitt där det kan vara lättare att bedöma datakvaliteten och sannolikheten för framgång nedströms. För de flesta projekt bör 2D-klassificering av ~ > 10k partiklar börja avslöja klasser som har sekundära strukturdetaljer. För att gå vidare till 3D bör 2D-klassificeringssteget vanligtvis avslöja klasser som representerar en rad partikelorienteringar. Om en föredragen orientering avslöjas kan fler iterationer av provberedning16 eller ytterligare datainsamling med provet lutat49. Alla klasser som visar sekundär strukturdetaljer bör väljas för att gå vidare till 3D-analys, medan skräppartiklar kasseras (figur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Bild 4: Inledande bildbehandlingssteg. A) Utdata från ett "on the fly"-bildbehandlingsskript. B) Exempel mikrograf (vänster) med lämpligt autoplockade partiklar identifierade med hjälp av crYOLO general modell (höger, med partiklar avgränsade av röda rutor) Skalstänger (vit) är 50 nm. C) Resultat från 2D-klassificering som visar klasser som kasserades i den röda rutan och klasser från vilka partiklar valdes ut för vidare bearbetning i grönt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
En liten delmängd av partiklar kan användas för att generera en första modell (figur 5A). Den här första modellen kan sedan användas som startmodell i 3D-klassificering och förfining. När det gäller RagAB innehöll datauppsättningen tre distinkta konformer som kan separeras under 3D-klassificeringen (figur 5B). Partiklar som bidrar till var och en av dessa klasser kan sedan behandlas självständigt och användas för att förfina en EM-densitetskarta som sedan kan bli föremål för ytterligare tolkning och modellbyggnad.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Bild 5: Generera 3D EM densitetskarta. A) Typisk initial modell som genereras med RELION. B) 3D-klassificering över 5 klasser som visar separation av partiklar i tre distinkta konformationstillstånd: öppen (grön), öppen (blå), sluten (lila). C) Process för att skapa masker. Kartan från 3D-förfining (vänster) ska visualiseras i chimera. Volymvisaren kan sedan användas för att identifiera det lägsta tröskelvärdet vid vilket kartan är fri från osammanhängande, bullrig densitet (mitten). Det här tröskelvärdet matas in som det ursprungliga tröskelvärdet för binarisering i jobbet för att skapa RELION-mask. Ett exempel på maskutdata visas i grått (höger). D) Högupplöst EM-densitetskarta över det öppna slutna tillståndet i RagAB (EMD-10245), filtrerat och färgat efter lokal upplösning (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure at JoVE.com

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Strukturbestämning av makromolekylära komplex med cryoEM har blivit rutin för vissa klasser av proteiner och komplex. Här sammanfattas denna pipeline (provberedning, screening, datainsamling och bearbetning) och läsarna riktas mot ytterligare detaljerade resurser och variabler som kan ändras vid mer utmanande exemplar.

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Enpartikel kryo-EM-analys har blivit en rutinteknik i strukturbiologens verktygslåda som är tillämplig på ett brett spektrum av prover inklusive membranproteiner, amyloidfibriller, nukleinsyrabindande proteiner och virus. När provberedningen är klar och gallren har laddats i mikroskopet kan datainsamlingen utföras på distans i många kryo-EM-anläggningar som Astbury Biostructure Laboratory och eBIC. Stora hinder för framgångsrik strukturbestämning ligger ofta i provberednings- och rutnätsscreeningsstegen med flera iterationer som ibland krävs genom denna process.Här kommer vi att demonstrera fjärrrutnätsscreening och datainsamling med en partikel. På fliken Automatisk inläsare i mikroskopgränssnittet flikar du ut alternativdialogrutan med hjälp av pilen och trycker på lagerknappen. Detta kommer att kontrollera varje position i kassetten sekventiellt för att avgöra om det finns en patron.Inventeringen körs på varje plats sekventiellt. När alla upptagna platser är mappade stoppas inventeringen. Markera rutnätet som ska överföras till mikroskopkolumnen och klicka på läs in.Kortplatsetiketten förvandlas från blått till gult när rutnätet har laddats in på scenen. Om du vill screena rutnäten öppnar du EPU-programvaran. På förberedelsesidan väljer du förvärvsoptik och inställningar och väljer sedan atlasförinställningen på rullgardinsmenyn.Välj lämpliga förinställningar för strålinställning och tryck på set för att trycka parametrarna till mikroskopet. Tryck för att öppna kolonnventiler och sätt in influensaskärmen. Kontrollera att en stråle är synlig och tillräckligt spridd och centrerad för att täcka detektorn.Om det behövs navigerar du till en tunnare del av rutnätet med styrspaken eller de virtuella handpanelerna för att styra stegrörelserna i X och Y.Lyft influensaskärmen och ta en bild med förhandsgranskningsknappen i EPU. Gå till atlassidan i EPU och tryck på ny session. Välj MRC-bildformatet och ange ett lämpligt mappnamn och en lämplig plats för att spara visningssessionen och klicka sedan på Använd.Välj visning i menyn till vänster. Markera kryssrutorna bredvid varje rutnät för att få ett atlasmontage förvärvat och starta sedan screeningsessionen i EPU. En atlas förvärvas för varje kontrollerat rutnät och tillgängliga rutnätsrutor listas när de är klara.Varje atlas kan ses genom att markera den på visningssidan. När de är färdiga granskar du de insamlade atlaserna och identifierar de rutnät som är lämpliga för att bedöma provkvaliteten vid högre förstoringar. Markera det valda rutnätet på EPU-screeningmenyn och klicka på läs in exempel.På atlasvisningsmenyn väljer du det rutnät som för närvarande är inläst och flyttar scenen till en rutnätsruta som innehåller de fyllda hålen genom att högerklicka över önskad plats på rutnätsbilden och välja flytta steg här. Gå tillbaka till EPU-förberedelsesidan och välj rutnätsrutans förinställning. Öppna sidan EPU autofunktioner och kör automatisk eucentrisk av steglutning med rutnätsrutan för att flytta provet till eucentrisk höjd.Ta en ny bild av rutnätsrutan i EPU-förberedelsen. Observera grå värden över olika hål som indikerar olika istjocklekar. Flytta scenen över ett hål med högerklick och flytta scenen här.Välj hålet eller den eucentriska höjdförinställningen och klicka sedan på förhandsgranskning. Välj förinställning för datainsamling och ställ in en förstoring som gör det enkelt att identifiera partiklarna. Ställ in defokusförskjutningen på minus tre till fem mikrometer.Iterera genom steg för att omvärdera en rad istjocklekar för partikelfördelning, orientering och förorening över nätet. Beroende på mikroskopets tillgänglighet kan fortsätta direkt till datainsamling eller rutnät tas bort från mikroskopet för framtida insamling, även på andra platser. Samla in en atlas om en sådan inte är tillgänglig från screening genom att ställa in atlasinställningar och välja rutnät för att hämta atlas.Hämta atlas och klicka på rutnätets plats för att se utdata. När atlasen är klar definierar du var och en av förinställningarna för strålinställning enligt projektets experimentella behov. Utför bildförskjutningskalibreringar.Konfigurera EPU-sessionen genom att välja konfigurationen av EPU-sidsessionen och sedan välja antingen ny session eller ny från inställningar. När du har valt en ny session visas en popup som ger ett alternativ för att använda tidigare inställningar. Inställningarna läses in automatiskt från föregående till den aktuella EPU-sessionen.Du kan också välja nytt från inställningar och välja en fil med sparade inställningar för att förinstallera den här informationen till den aktuella EPU. Fyll i sessionsnamnet med något informativt. Välj manuell i typ.För anskaffningsläge väljer du exakt hålcenterning eller snabbare förvärv om avvikelsefri bildskiftssamling är tillgänglig och önskad. Välj önskat bildformat och välj sedan lagringsmapp och EPU skapar en katalog med sessionsnamnet. Välj lämpligt rutnät beroende på vilket rutnätshålsavstånd som används och tryck på applicera.Välj en första rutnätsruta och ange en förvärvsmall. Gå till fyrkantig markering. Om alla rutor är gröna klickar du på Avmarkera allt längst upp till vänster.Öppna paneler genom att högerklicka och sedan markera öppna paneler. Lägg till eller välj en rutnätsruta genom att klicka på markera och högerklicka och markera flytta steg till rutnätsruta. Gå till hålval och tryck på auto-eucentric.Vänta tills en rutnätsruta är tagen. Om den automatiska funktionen misslyckas kan det bero på att höjden är betydligt av. Den kan justeras manuellt med hjälp av influensaskärmen vid rutnätets kvadratiska förstoring.För att mäta hålstorlek, flytta och justera de gula cirklarna så att de är över hålen med rätt storlek och avstånd. Tryck på hitta hål. Kontrollera att hålen har hittats korrekt.Om inte, ändra hålstorleken och tryck på hitta hål igen. Om den här processen konsekvent misslyckas bör du överväga att flytta till ett lägre antal eller ljusare dekorstorlek vid rutnätets kvadratiska förstoring. Använd filterglaskvalitets histogrammet till höger för att justera hålvalet.Detta kan vara användbart för att utesluta områden med tjock is och tunn is. Detta kommer att komma ihåg för framtida rutnätsrutor som valts under sessionen. Optimera hålvalet med verktygen i den valda menyn högst upp.Klicka till exempel på ta bort hål nära rutnätslisten. Gå till malldefinition och tryck på hämta. Klicka på sök- och mitthål.Ändra fördröjningen efter stegförskjutningen och fördröjningen efter bildförskjutningstiderna till en till fem sekunder, kontrollera sedan om det är tillgängligt att kontrollera att det maximala bildförskjutningsvärdet är som önskat. Klicka på Lägg till förvärvsområde och klicka var som helst på bilden. Flytta förvärvsområdet till önskad plats.Lägg till defokusområdet uppe till höger. En typisk defokuslista för ett membranproteinprojekt är negativ 0,8 till negativ tre mikrometerdefokus, lägg sedan till andra förvärvsområden och ordna dem så att förvärvsområden inte dubbelt exponeras med strålen. Klicka på Lägg till automatiskt fokusområde och klicka var som helst på bilden.Flytta det automatiska fokusområdet till kolet som omger ett hål. Standardpraxis är att automatiskt fokusera efter centrerad när du använder AFIS eller var femte till 15 mikrometer beroende på Z-höjdvariationen över torget. Klicka på Lägg till driftmätningsområde.Driftmätning utförs en gång per rutnätsruta med en fastställd tröskel på 0,05 nanometer per sekund som standardinställning. Driftmätningsområdet kan överlappa direkt med området för automatisk fokusering. Se till att varken drift- eller autofokusområde överlappar ett förvärvsområde.Gå tillbaka till fyrkantigt urval och välj rutorna för förvärv i rutnätet. Använd antalet förvärvsområden och förväntad datainsamlingsgrad för att förutsäga hur många förvärvsområden som krävs. När alla önskade rutor är markerade trycker du på förbered alla rutor.När varje ruta har samlats in navigerar du mellan rutnätsrutorna och finjusterar hålen med markeringsborsten. Flytta till en scenplats över provexemplaret och använd automatiska funktioner för att ställa in eucentrisk höjd. Utför mikroskopjusteringar med hjälp av mikroskopprogramvara som beskrivits tidigare och i texten.Utför komafri justering inom autofunktionerna innan du sätter tillbaka och centrerar målöppningen och korrigerar objektivet astigmatism med EPU. Se till att båda justeringarna konvergerar efter lämpliga värden. Innan du påbörjar den automatiska anskaffningskörningen, se till att turbopumpen för automatisk lastare är avstängd och att objektivöppningen sätts in vid behov.Vid automatiserat förvärv, pressstartskörning för att påbörja automatiserat datainsamling. Med hjälp av detta protokoll kan trasiga eller torra galler screenas och kasseras i atlasstadiet. En isgradient observeras över de flesta galler.Under screeningen monodisperseras en idealisk partikelfördelning med en rad synliga partikelorienteringar. Om isen är för tunn kan den smälta när den belyses med elektronstrålen, vilket orsakar överdriven rörelse i mikrografen. Detta observeras oftast när det finns tvättmedel i bufferten.Isen måste vara glasaktig så områden i rutnätet där majoriteten av bilderna visar kristallin is uteslöts. Grafisk sammanfattning av uppgifterna inkluderades för att bedöma mikrografkvaliteten och för att avgöra om ändringar i datainsamling krävs. Partikelväljare som crYOLO fungerar tillräckligt bra för ett första pass av data, vilket möjliggör progression till 2D-klassgenom genomsnitt.Klasser som visar sekundär strukturdetaljer bör väljas för 3D-analys medan skräppartiklar ska kasseras. En delmängd av partiklar kan användas för att generera en första modell för 3D-klassificering och förfining. När det gäller RagAB innehöll datauppsättningen tre distinkta konformatörer som kan separeras under 3D-klassificeringen.Det är viktigt att komma ihåg att framgång vid datainsamling och efterföljande bildanalyssteg är beroende av att erhålla och identifiera väloptimerade rutnät under screeningstadiet. När en 3D EM densitetskarta har erhållits kan den tolkas ytterligare genom montering och raffinering av en proteinmodell eller genom att bygga en atommodell de novo. Cryo-EM single-particle analys möjliggör strukturerad bestämning av många mål som inte var möjliga tidigare.Dessa arbetsflöden har nyligen använts för att lösa strukturer av COVID-19-relaterade makromolekyler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuell Blot-and-Plunge frysning av biologiska exemplar för enpartikel kryogen elektronmikroskopi

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Beredning av nukleosomkärnpartiklar komplexerade med DNA-reparationsfaktorer för kryoelektronmikroskopi Strukturell bestämning

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extrahera modifierade mikrotubuli från däggdjursceller för att studera mikrotubuli-proteinkomplex med kryoelektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Tillämpning av monolagergrafen på kryoelektronmikroskopinät för högupplöst strukturbestämning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...