Name: zebrafish model of neuroblastoma metastasis
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة R01 CA240323 (S.Z.) من المعهد الوطني للسرطان. منحة W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) من وزارة الدفاع الأمريكية (DoD) ؛ جائزة V Scholar من مؤسسة V لأبحاث السرطان (S.Z.) ومنحة منصة من مركز Mayo للاكتشاف الطبي الحيوي (S.Z.) ؛ وبدعم من مركز Mayo Clinic للسرطان ومركز الطب الفردي (S.Z).

تم تنفيذ جميع طرق البحث باستخدام أسماك الزرد ورعاية/صيانة الحيوانات وفقا للإرشادات المؤسسية في Mayo Clinic.
1. التحضير والحقن المجهري للتركيبات الجينية المحورة لتطوير خط الزرد المحورة وراثيا LMO1 مع الإفراط في التعبير في PSNS
<ol><li>لتطوير استنساخ دخول LMO1-pDONR221 ، تضخيم منطقة...

<ol>
	<li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li><li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+cancer+model.">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).</li><li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li><li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish.">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma.">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis.">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).</li><li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children's+oncology+group's+2013+blueprint+for+research:+neuroblastoma.">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li><li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+model+of+neuroblastoma:+differentiating+stroma-poor+tumors'+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage.">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li><li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma.">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li><li>Tolbert, V. P., Matthay, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+Clinical+and+biological+approach+to+risk+stratification+and+treatment.">Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).</li><li>Maris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuroblastoma.">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis.">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Tao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28B+regulates+transcription+and+potentiates+MYCN-induced+neuroblastoma+through+binding+to+ZNF143+at+target+gene+promotors.">LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).</li><li>Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+zebrafish+transgenesis+for+functional+genomic+analysis+of+candidate+cooperative+genes+in+tumor+pathogenesis.">Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+GAB2+in+neuroblastoma+pathogenesis+through+the+promotion+of+SHP2/MYCN+cooperation.">Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation.</a> Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).</li><li>Zimmerman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification.">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li><li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface.">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Wattrus, S. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+safe+harbor:+The+hematopoietic+stem+cell+niche+in+zebrafish.">Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish.</a> Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).</li><li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish.">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+Zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+staining+of+collagens+type+I,+II+and+III+by+Sirius+Red+and+polarization+microscopy.">Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.</a> Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).</li><li>Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirius+red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue.">Sirius red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).</li><li>Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cancer+in+zebrafish.">In vivo imaging of cancer in zebrafish.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).</li><li>Howe, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).</li><li>Yoganantharjah, P., Gibert, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+the+zebrafish+model+to+aid+in+drug+discovery+and+target+validation.">The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).</li><li>Ignatius, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells,+regional+tumor+heterogeneity,+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell+vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+with+orbital+metastasis:+ophthalmic+presentation+and+role+of+ophthalmologists.">Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists.</a> Eye. 20 (4), 466-470 (2006).</li><li>Papaioannou, G., McHugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+in+childhood:+review+and+radiological+findings.">Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings.</a> Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Amores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+hox+clusters+and+vertebrate+genome+evolution.">Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution.</a> Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).</li><li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map.">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li><li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins.">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li></ol>

يشيع استخدام سمك الزرد في الأبحاث على مدى العقود القليلة الماضية ، وخاصة في أبحاث السرطان ، لأسباب واضحة ، مثل سهولة صيانته ، وتكاثره القوي ، ومزاياه الواضحة للتصوير في الجسم الحي 1،28. يمكن التلاعب بسهولة بنموذج الزرد جنينا بسبب إخصابه الخارجي وتطوره ،...

تم استخدام الزرد على نطاق واسع وتطبيقه على العديد من مجالات البحث ، وخاصة في مجال السرطان. يوفر هذا النموذج العديد من المزايا - مثل تكاثره القوي ، وصيانته الفعالة من حيث التكلفة ، والتصور متعدد الاستخدامات لنمو الورم والانبثاث - وكلها تجعل من الزرد أداة قوية لدراسة والتحقيق في القواعد الخلوية والجزيئية لتكوين الورم والانبثاث. وقد أدت التقنيات الجديدة لرسم خرائط الجينوم على نطاق واسع، والتحول الجنسي، والتعبير المفرط عن الجينات أو الضربة القاضية، وزرع الخلايا، والشاشات الكيميائية إلى زيادة كبيرة في قوة نموذج الزرد1. خلال السنوات القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من خطوط الزرد لدراسة تكوين الأورام والانبثاث لمجموعة متنوعة من أنواع السرطان البشرية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر سرطان الدم وسرطان الجلد والساركوما العضلية المخططة وسرطان الخلايا الكبدية2،3،4،5. بالإضافة إلى ذلك ، تم إنشاء أول نموذج لأسماك الزرد من الورم الأرومي العصبي (NB) عن طريق الإفراط في التعبير عن MICN ، وهو جين ورمي ، في الجهاز العصبي الودي المحيطي (PSNS) تحت سيطرة مروج الدوبامين بيتا هيدروكسيلاز (dβh). مع هذا النموذج ، ثبت أيضا أن ALK المنشط يمكن أن يتآزر مع MYCN لتسريع ظهور الورم وزيادة اختراق الورم في الجسم الحي 6.
NB مشتق من السلالة الودية الكظرية لخلايا القمة العصبية ، وهو سرطان نقيلي للغاية عند الأطفال7. وهو مسؤول عن 10٪ من الوفيات المرتبطة بسرطان الأطفال8. ينتشر NB على نطاق واسع عند التشخيص ، ويمكن تقديمه سريريا على أنه أورام تنشأ في المقام الأول على طول سلسلة العقد الودية والنخاع الكظري من PSNS9,10. يرتبط تضخيم MYCN عادة بالنتائج السيئة في مرضى NB 11,12. وعلاوة على ذلك، تم تحديد LMO1 كجين حساس حاسم للقابلية للإصابة بالفيروس NB في الحالات عالية الخطورة13,14. وجدت الدراسات أن التعبير المشترك المعدل وراثيا ل MYCN و LMO1 في PSNS لنموذج الزرد لا يعزز فقط الظهور المبكر ل NB ، ولكنه يحفز أيضا على ورم خبيث واسع النطاق في الأنسجة والأعضاء التي تشبه المواقع التي شوهدت عادة في المرضى الذين يعانون من NB13 عالية الخطورة. في الآونة الأخيرة ، لوحظ أيضا نمط ظاهري نقيلي آخر من NB في نموذج أحدث لأسماك الزرد من NB ، حيث يتم التعبير عن كل من MYCN و Lin28B ، اللذين يشفران بروتين ربط الحمض النووي الريبي ، تحت سيطرة المروج dβh 16.
غالبا ما يستخدم النهج المعدل وراثيا المستقر في أسماك الزرد لدراسة ما إذا كان الإفراط في التعبير عن جين ذي أهمية يمكن أن يساهم في التطور الطبيعي وإمراض المرض14,15. تم استخدام هذه التقنية بنجاح لإثبات أهمية الجينات والمسارات المتعددة لتكوين الأورام NB 6,16,17,18,19,20. ستقدم هذه الورقة كيف تم إنشاء خط الأسماك المعدلة وراثيا الذي يبالغ في التعبير عن كل من MYCN و LMO1 في PSNS وكيف ثبت أن تعاون هذين الجينين الورميين يسرع من ظهور الورم NB والانبثاث 13. أولا ، تم تطوير الخط المعدل وراثيا الذي يبالغ في التعبير عن EGFP-MYCN تحت سيطرة المروج dβh (خط MYCN المعين) عن طريق حقن بنية dβh-EGFP-MYCN في مرحلة خلية واحدة من أجنة AB من النوع البري (WT) ، كما هو موضح سابقا6,17. تم تطوير خط منفصل معدل وراثيا يبالغ في التعبير عن LMO1 في PSNS (خط LMO1 المعين) عن طريق المشاركة في حقن اثنين من تركيبات الحمض النووي ، dβh-LMO1 و dβh-mCherry ، في أجنة WT في مرحلة الخلية الواحدة13. وقد ثبت سابقا أن تركيبات الحمض النووي المزدوج المحقونة يمكن دمجها في جينوم الأسماك. لذلك ، يتم التعبير عن LMO1 و mCherry في خلايا PSNS للحيوانات المعدلة وراثيا. بمجرد أن تصل أجنة F0 المحقونة إلى مرحلة النضج الجنسي ، يتم تجاوزها مع أسماك WT لتحديد الأسماك الإيجابية ذات التكامل الجيني (الجينات) المحورة. باختصار ، تم فحص ذرية F1 لأول مرة بواسطة المجهر الفلورسنت للتعبير عن mCherry في خلايا PSNS. كما تم تأكيد تكامل الخط الجرثومي للكائن الحي المحور1 في الأسماك إيجابية mCherry من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الجيني والتسلسل. وبعد النجاح في تحديد كل خط معدل وراثيا، تزاوج ذرية الأسماك المحورة وراثيا من نوع MYCN غير المتجانسة والأسماك المعدلة وراثيا (LMO1) لتوليد خط أسماك مركب يعبر عن كل من MYCN و LMO1 (المسمى MYCN; خط LMO1). MYCN الحاملة للورم. ورصد المجهر الفلوري 1 الأسماك المحورة 1 كل أسبوعين بحثا عن أدلة على وجود أورام نقلية في المناطق البعيدة عن الموقع الرئيسي، وهي منطقة الغدة بين الكلى (IRG، مكافئ أسماك الزرد للغدة الكظرية البشرية)13. لتأكيد ورم خبيث من الأورام في MYCN; وطبقت التحليلات الكيميائية النسيجية والنسيجية والنسيجية والكيميائية المناعية للكائنات الحية المحورة 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific / Acros Organic</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose GP2</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>009012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Intense R Detection</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND primary antibody diluent</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND-MAX IHC instrument</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fully automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH211-270H11 BAC clone</td>
			<td>BACPAC resources center (BRFC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope equipped with DP71 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801601</td>
			<td>ready-to-use (no preparation needed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>86-1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Roche Applied Science, IN</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>HHS-32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Avidin D</td>
			<td>Vector</td>
			<td>A-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>4360-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Teknova, Inc.</td>
			<td>K2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>554-13-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome for sectioning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p3E-polyA</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift 
			(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin wax</td>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>39603002</td>
			<td>Parrafin to parafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)</td>
			<td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONR 221 gateway donor vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12536-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONRP4-P1R donor vector</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 0.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirrius red stain kit</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24901-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pME-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26028</td>
			<td>(DBH construct)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>21712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDO Rapid Decalcifier</td>
			<td>Apex Enginerring</td>
			<td>RDO04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP&#174;&#160;6 AI Vacuum Infiltration Processor</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: VIP-6-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical Incorporated</td>
			<td>20513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish model of neuroblastoma metastasis

برزت أسماك الزرد كنموذج حيواني مهم لدراسة الأمراض البشرية ، وخاصة السرطان. جنبا إلى جنب مع تقنيات تحرير الجينات والجينوم القوية المطبقة في نمذجة أسماك الزرد ، فإن سهولة الصيانة والإنتاجية عالية الغلة والتصوير الحي القوي تجعل من الزرد نظاما نموذجيا قيما لدراسة ورم خبيث وقواعد خلوية وجزيئية كامنة وراء هذه العملية في الجسم الحي. تم تطوير أول نموذج للورم الأرومي العصبي لأسماك الزرد (NB) من ورم خبيث عن طريق الإفراط في التعبير عن اثنين من الجينات السرطانية ، MYCN و LMO1 ، تحت سيطرة مروج الدوبامين - بيتا - هيدروكسيلاز (dβh). أدى الإفراط في التعبير المشترك عن MYCN و LMO1 إلى تقليل الكمون وزيادة اختراق الورم الأرومي العصبي ، بالإضافة إلى تسارع الانبثاث البعيد للخلايا السرطانية. ويكرر هذا النموذج الجديد بشكل موثوق العديد من السمات الرئيسية للنموي البشري الخبيث، بما في ذلك مشاركة التعديلات الجينية ذات الصلة سريريا والمرتبطة بالانبثاث؛ التطور الطبيعي والتلقائي للورم الخبيث في الجسم الحي ؛ والمواقع المحفوظة من النقائل. لذلك ، يمتلك نموذج الزرد مزايا فريدة لتشريح العملية المعقدة لورم خبيث في الجسم الحي.

لتحديد ما إذا كان LMO1 يتآزر مع MYCN للتأثير على التسبب في NB ، تم حقن التركيبات المعدلة وراثيا التي تدفع التعبير عن LMO1 (dβh: LMO1 و dβh: mCherry) أو MYCN (dβh: EGFP-MYCN) في خلايا PSNS الخاضعة لسيطرة مروج dβh في أجنة أسماك الزرد 13. وكما هو مبين في الشكل 1...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

تقدم هذه الورقة طريقة تطوير وتوصيف وتتبع في الوقت الفعلي ورم خبيث في نموذج الزرد من الورم الأرومي العصبي ، وتحديدا في خط الزرد المعدل وراثيا مع الإفراط في التعبير عن MYCN و LMO1 ، والذي يتطور ورم خبيث تلقائيا.

نموذج الزرد من ورم أرومي عصبي

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

تم استخدام هذه الطرق لتطوير أول نموذج لسمك الزرد من ورم خبيث في الورم الأرومي العصبي. ولإثبات أن هذا النموذج يمكن أن يلخص بأمانة العديد من ميزات ورم خبيث شوهد في المرضى الذين يعانون من مخاطر عالية من الورم الأرومي العصبي. الميزة الرئيسية لهذا النموذج الزرد النقيلي هي التصوير في الوقت الحقيقي في الجسم الحي لنشر الورم لفهم أفضل متى ، وربما كيف يحدث ورم خبيث.هذه التقنية ليست خاصة بالورم الأرومي العصبي. يمكن تطبيقه على نماذج الزرد لأنواع مختلفة من السرطانات طالما يمكن تحديد الخلايا السرطانية وتعقبها مما يؤدي إلى مجموعة من الاحتمالات. للبدء ، قم بتطوير خط أسماك معدل وراثيا غير متجانس الزيجوت يبالغ في التعبير عن كل من MYCN و LMO1 عن طريق التزاوج بين خطوط MYCN و LMO1 المعدلة وراثيا.في يوم واحد بعد الإخصاب ، استخدم مجهر التألق المجسمة لفرز ذرية التقاطع الخارجي للتعبير عن EGFP ، والذي يقدم كنقاط إيجابية EGFP. بعد الفرز، اعزل الأجنة التي تم فحصها في أطباق بتري منفصلة وصنف الأطباق على أنها إيجابية MYCN أو سلبية MYCN. تصور وفرز الأجنة من كلتا المجموعتين للتعبير عن الكائنات الحية المحورة 1 بعد ثلاثة إلى أربعة أيام من الإخصاب.ابحث عن بقع التألق الحمراء في كل من العقدة العنقية المتفوقة والخلايا العصبية الدوبامينية غير PSNS خاصة في النخاع المستطيل في الدماغ الخلفي. قم بإجراء الفحص قبل أن تصل الأجنة إلى خمسة أيام بعد الإخصاب. ثم عزل الأسماك المصنفة إلى أربع مجموعات من الأنماط الجينية المختلفة ووضع العلامات على أنها MYCN فقط ، LMO1 فقط ، MYCN و LMO1 على حد سواء والنوع البري.رفعها في ظروف متطابقة وفقا للبروتوكولات القياسية. تصور الأورام باستخدام مجهر التألق المجسمة عن طريق تقليب الأسماك بلطف باستخدام ملعقة معدنية على كلا الجانبين الجانبي لرؤية الورم. بعد تحديد الأسماك المحتملة الحاملة للورم ، قم بعزلها في خزان منفصل مع ملصقات مناسبة تتضمن تاريخ الميلاد وتاريخ فحص الورم والنمط الوراثي.في الأسابيع الستة التالية للإخصاب، كرر الخطوات السابقة لفحص الأسماك الحاملة للورم والأسماك غير الحاملة للورم للتأكد من وجود أورام للأسماك التي تم فحصها مسبقا أو تحديد الأسماك الجديدة المحتملة الحاملة للورم. ابحث عن الحجم المستدام أو المتزايد للكتلة الإيجابية الفلورية والأسماك الحاملة للورم المؤكدة. بعد تحديد الأسماك الحاملة للورم ، راقبها كل أسبوعين للحصول على أدلة على هجرة الخلايا السرطانية ، والتي تظهر على شكل كتل ورم إيجابية صغيرة EGFP أو mCherry بعيدة عن الموقع الأساسي لتكوين الورم.اعزل هذه الأسماك في خزانات منفصلة حسب الحاجة وقم بتصنيفها بشكل مناسب للإشارة إلى ورم خبيث محتمل. بعد تفسير MYCN غير المتجانس في أسماك LMO1 ، وأثناء فرز ذريتها ، كان تعبير EGFP MYCN بارزا في الخلايا العصبية الدوبامينية غير PSNS في يوم واحد بعد الإخصاب. في المقابل ، كان تعبير LMO1 بارزا في كل من خلايا PSNS والخلايا العصبية الدوبامينية غير PSNS.تم الكشف عن كتل الورم الإيجابية الفلورية في الأنسجة في الأعضاء ، بعيدا عن موقع الورم الأساسي في الأسماك المعدلة وراثيا المركبة مع الإفراط في التعبير عن كل من MYCN و LMO1 ، ولكن ليس في الأسماك المعدلة وراثيا مع التعبير عن MYCN وحده. يظهر تلطيخ H & E للأقسام الجراحية أن الورم الأولي نشأ من منطقة الغدة بين الكلى ، وهو ما يعادل الزرد للغدة الكظرية البشرية وهو الموقع الأكثر شيوعا للمرض الأولي في مريض الورم الأرومي العصبي. تم الكشف عن كتل الورم البعيدة عن الغدة بين الكلى في مناطق متعددة ، بما في ذلك الجزء البعيد من الكلى والمدار والخياشيم والطحال والجدار الداخلي للغرفة الأذينية للقلب.تم تأكيد سلالة الخلايا العصبية PSNS للخلايا السرطانية في الورم الأساسي وجميع المواقع النقيلية. تم العثور على كميات كبيرة من الكميات المضخمة وزيادة سمك ألياف الكولاجين الملطخة ب PSR في أورام MYCN LMO1 عند مقارنتها بالأورام التي تعبر عن MYCN وحدها. بعد استخدام هذا الإجراء ، يمكن تطبيق فحص الأدوية واختبار علاجات السرطان الجديدة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تطوير عوامل بديلة للوقاية من السرطانات النقيلية وعلاجها.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

فأري موديل التجريبية التنمية الورم الأصلي والبريتوني ورم خبيث<em&gt; عبر</em&gt; مثلي تلقيح مع خلايا المبيض سرطان

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

في فيفو نموذج لاختبار تأثير نقص الأكسجة على الانبثاث ورم

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

الإجراءات الجراحية ومنهجية لنموذج الفئران قبل السريرية<em&gt; دي نوفو</em&gt; سرطان الثديي الانبثاث

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

والوريد البابي حقن نموذج لدراسة الكبد الانبثاث من سرطان الثدي

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

نموذج الرئة اللاخلوي والخلوية لدراسة ورم خبيث

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

التحليل الجزئي للخلايا السرطانية المتداولة للتحليل الجزيئي المصب والتقييم المحتمل المنتشر

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

استخدام تحليل الصور القائم على الكمبيوتر لتحسين القياس الكمي لنقائل الرئة في نموذج سرطان الثدي 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

A Syngeneic العظام العظام سبراغ داولي نموذج الفئران مع بتر للسيطرة على معدل الانبثاث

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...