Name: zebrafish model of neuroblastoma metastasis
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een subsidie R01 CA240323 (S.Z.) van het National Cancer Institute; een subsidie W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) van het Amerikaanse ministerie van Defensie (DoD); een V Scholar award van de V Foundation for Cancer Research (S.Z.) en een Platform Grant van het Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); en ondersteuning van het Mayo Clinic Cancer Center en Center for Individualized Medicine (S.Z.).

Alle onderzoeksmethoden met behulp van zebravissen en dierverzorging / onderhoud werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van Mayo Clinic.
1. Voorbereiding en micro-injectie van transgenconstructies voor de ontwikkeling van LMO1 transgene zebravislijn met overexpressie in PSNS
<ol><li>Om de LMO1-pDONR221-instapkloon te ontwikkelen, versterkt u het coderende gebied van menselijk LMO1 uit cDNA verkregen uit menselijke cellijn met behulp ...

<ol>
	<li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li><li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+cancer+model.">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).</li><li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li><li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish.">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma.">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis.">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).</li><li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children's+oncology+group's+2013+blueprint+for+research:+neuroblastoma.">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li><li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+model+of+neuroblastoma:+differentiating+stroma-poor+tumors'+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage.">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li><li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma.">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li><li>Tolbert, V. P., Matthay, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+Clinical+and+biological+approach+to+risk+stratification+and+treatment.">Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).</li><li>Maris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuroblastoma.">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis.">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Tao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28B+regulates+transcription+and+potentiates+MYCN-induced+neuroblastoma+through+binding+to+ZNF143+at+target+gene+promotors.">LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).</li><li>Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+zebrafish+transgenesis+for+functional+genomic+analysis+of+candidate+cooperative+genes+in+tumor+pathogenesis.">Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+GAB2+in+neuroblastoma+pathogenesis+through+the+promotion+of+SHP2/MYCN+cooperation.">Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation.</a> Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).</li><li>Zimmerman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification.">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li><li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface.">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Wattrus, S. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+safe+harbor:+The+hematopoietic+stem+cell+niche+in+zebrafish.">Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish.</a> Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).</li><li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish.">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+Zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+staining+of+collagens+type+I,+II+and+III+by+Sirius+Red+and+polarization+microscopy.">Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.</a> Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).</li><li>Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirius+red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue.">Sirius red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).</li><li>Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cancer+in+zebrafish.">In vivo imaging of cancer in zebrafish.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).</li><li>Howe, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).</li><li>Yoganantharjah, P., Gibert, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+the+zebrafish+model+to+aid+in+drug+discovery+and+target+validation.">The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).</li><li>Ignatius, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells,+regional+tumor+heterogeneity,+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell+vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+with+orbital+metastasis:+ophthalmic+presentation+and+role+of+ophthalmologists.">Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists.</a> Eye. 20 (4), 466-470 (2006).</li><li>Papaioannou, G., McHugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+in+childhood:+review+and+radiological+findings.">Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings.</a> Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Amores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+hox+clusters+and+vertebrate+genome+evolution.">Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution.</a> Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).</li><li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map.">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li><li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins.">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li></ol>

Zebravis is de afgelopen decennia vaak gebruikt in onderzoek, vooral in kankeronderzoek, om voor de hand liggende redenen, zoals het onderhoudsgemak, robuuste reproductie en duidelijke voordelen voor in vivo beeldvorming1,28. Het zebravismodel kan gemakkelijk embryonaal worden gemanipuleerd vanwege hun externe bevruchting en ontwikkeling, die goed complementair is aan zoogdiermodelorganismen, zoals ratten en muizen, voor grootschalige genetische <sup cla...

Zebravis is op grote schaal gebruikt en toegepast op verschillende onderzoeksgebieden, vooral bij kanker. Dit model biedt vele voordelen - zoals de robuuste reproductie, kosteneffectief onderhoud en veelzijdige visualisatie van tumorgroei en metastase - die zebravissen allemaal een krachtig hulpmiddel maken om de cellulaire en moleculaire bases van tumorigenese en metastase te bestuderen en te onderzoeken. Nieuwe technieken voor grootschalige genoomkartering, transgenese, overexpressie of knock-out van genen, celtransplantatie en chemische schermen hebben de kracht van het zebravismodel enorm vergroot1. In de afgelopen jaren zijn veel zebravislijnen ontwikkeld om tumorigenese en metastase van een verscheidenheid aan menselijke kankers te bestuderen, waaronder maar niet beperkt tot leukemie, melanoom, rabdomyosarcoom en hepatocellulair carcinoom2,3,4,5. Bovendien werd het eerste zebravismodel van neuroblastoom (NB) gegenereerd door overexpressie van MYCN, een oncogen, in het perifere sympathische zenuwstelsel (PSNS) onder controle van de dopamine-bèta-hydroxylase (dβh) promotor. Met dit model werd verder aangetoond dat geactiveerde ALK kan samenwerken met MYCN om het begin van de tumor te versnellen en de tumorpenetratie in vivo6 te verhogen.
NB is afgeleid van de sympathoadrenale afstamming van de neurale kamcellen en is een sterk gemetastaseerde kanker bij kinderen7. Het is verantwoordelijk voor 10% van de pediatrische kankergerelateerde sterfgevallen8. Nb is op grote schaal uitgezaaid bij de diagnose en kan klinisch worden gepresenteerd als tumoren die voornamelijk afkomstig zijn langs de keten van de sympathische ganglia en het bijniermerg van PSNS9,10. MYCN-amplificatie wordt vaak geassocieerd met slechte resultaten bij NB-patiënten11,12. Bovendien is LMO1 geïdentificeerd als een kritisch NB-gevoeligheidsgen in gevallen met een hoog risico13,14. Studies hebben aangetoond dat de transgene coexpressie van MYCN en LMO1 in het PSNS van het zebravismodel niet alleen een eerder begin van NB bevordert, maar ook wijdverspreide metastase induceert voor de weefsels en organen die vergelijkbaar zijn met plaatsen die vaak worden gezien bij patiënten met een hoog risico NB13. Zeer recent is een ander gemetastaseerd fenotype van NB ook waargenomen in een nieuwer zebravismodel van NB, waarin zowel MYCN als Lin28B, coderend voor een RNA-bindend eiwit, overexpressie hebben onder controle van de dβh-promotor16.
De stabiele transgene benadering bij zebravissen wordt vaak gebruikt om te bestuderen of overexpressie van een interessant gen kan bijdragen aan de normale ontwikkeling en ziektepathogenese14,15. Deze techniek is met succes gebruikt om het belang van meerdere genen en routes naar NB tumorigenese6,16,17,18,19,20 aan te tonen. Dit artikel zal introduceren hoe de transgene vislijn die zowel MYCN als LMO1 in het PSNS overexpresseert, werd gecreëerd en hoe werd aangetoond dat de samenwerking van deze twee oncogenen het begin van NB-tumorigenese en metastase versnelt13. Ten eerste werd de transgene lijn die EGFP-MYCN onder controle van de dβh-promotor (aangeduid als MYCN-lijn) overexpressie geeft, ontwikkeld door de dβh-EGFP-MYCN-constructie te injecteren in eencellig stadium van wild-type (WT) AB-embryo's, zoals eerder beschreven6,17. Een afzonderlijke transgene lijn die LMO1 overexpressie geeft in de PSNS (aangeduid als LMO1-lijn) werd ontwikkeld door twee DNA-constructen, dβh-LMO1 en dβh-mCherry, samen te voegen in WT-embryo's in het eencellige stadium13. Eerder is aangetoond dat co-geïnjecteerde dubbele DNA-constructies kunnen worden gecoïntegreerd in het visgenoom; daarom worden LMO1 en mCherry co-expressie gebracht in de PSNS-cellen van de transgene dieren. Zodra de geïnjecteerde F0-embryo's geslachtsrijp waren, werden ze vervolgens gekruist met WT-vissen voor de identificatie van positieve vissen met transgen (s) integratie. Kortom, de F1-nakomelingen werden eerst gescreend door fluorescerende microscopie op mCherry-expressie in de PSNS-cellen. De kiembaanintegratie van LMO1 in mCherry-positieve vissen werd verder bevestigd door genomische PCR en sequencing. Na succesvolle identificatie van elke transgene lijn werden de nakomelingen van heterozygote MYCN- en LMO1-transgene vissen gekruist om een samengestelde vislijn te genereren die zowel MYCN als LMO1 (aangeduid als MYCN; LMO1 lijn). Tumordragende MYCN; LMO1-vissen werden tweewekelijks door fluorescerende microscopie gecontroleerd op het bewijs van gemetastaseerde tumoren in de regio's ver weg van de primaire locatie, interrenaal kliergebied (IRG, zebravisequivalent van menselijke bijnier)13. Om de metastase van tumoren in MYCN te bevestigen; LMO1-vis, histologische en immunohistochemische analyses werden toegepast.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific / Acros Organic</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose GP2</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>009012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Intense R Detection</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND primary antibody diluent</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND-MAX IHC instrument</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fully automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH211-270H11 BAC clone</td>
			<td>BACPAC resources center (BRFC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope equipped with DP71 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801601</td>
			<td>ready-to-use (no preparation needed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>86-1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Roche Applied Science, IN</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>HHS-32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Avidin D</td>
			<td>Vector</td>
			<td>A-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>4360-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Teknova, Inc.</td>
			<td>K2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>554-13-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome for sectioning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p3E-polyA</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift 
			(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin wax</td>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>39603002</td>
			<td>Parrafin to parafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)</td>
			<td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONR 221 gateway donor vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12536-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONRP4-P1R donor vector</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 0.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirrius red stain kit</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24901-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pME-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26028</td>
			<td>(DBH construct)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>21712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDO Rapid Decalcifier</td>
			<td>Apex Enginerring</td>
			<td>RDO04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP&#174;&#160;6 AI Vacuum Infiltration Processor</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: VIP-6-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical Incorporated</td>
			<td>20513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish model of neuroblastoma metastasis

Zebravis is naar voren gekomen als een belangrijk diermodel om menselijke ziekten, met name kanker, te bestuderen. Samen met de robuuste transgene en genoombewerkingstechnologieën die worden toegepast bij zebravismodellering, maken het onderhoudsgemak, de productiviteit met hoge opbrengst en krachtige live beeldvorming de zebravis een waardevol modelsysteem om metastase en cellulaire en moleculaire bases te bestuderen die ten grondslag liggen aan dit proces in vivo. Het eerste zebravis neuroblastoom (NB) model van metastase werd ontwikkeld door overexpressie van twee oncogenen, MYCN en LMO1, onder controle van de dopamine-beta-hydroxylase (dβh) promotor. Co-overexpressie van MYCN en LMO1 leidde tot de verminderde latentie en verhoogde penetrantie van neuroblastomagenese, evenals versnelde metastase op afstand van tumorcellen. Dit nieuwe model herhaalt op betrouwbare wijze veel belangrijke kenmerken van human metastatische NB, waaronder betrokkenheid van klinisch relevante en metastase-geassocieerde genetische veranderingen; natuurlijke en spontane ontwikkeling van metastase in vivo; en geconserveerde plaatsen van metastasen. Daarom heeft het zebravismodel unieke voordelen om het complexe proces van tumormetastase in vivo te ontleden.

Om te bepalen of LMO1 synergetisch werkt met MYCN om de NB-pathogenese te beïnvloeden, werden transgene constructies die de expressie van LMO1 (dβh:LMO1 en dβh:mCherry) of MYCN (dβh:EGFP-MYCN) in de PSNS-cellen onder controle van de dβh-promotor stimuleren, geïnjecteerd in zebravisembryo's13. Zoals geïllustreerd in figuur 1A, werden na de ontwikkeling van stabiele transgene lijnen en valida...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Dit artikel introduceert de methode voor het ontwikkelen, karakteriseren en volgen in real-time van de tumormetastase in het zebravismodel van neuroblastoom, met name in de transgene zebravislijn met overexpressie van MYCN en LMO1, die spontaan metastase ontwikkelt.

Zebravismodel van neuroblastoommetastase

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Deze methoden werden gebruikt om het eerste zebravismodel van neuroblastoommetastase te ontwikkelen. En om aan te tonen dat dit model veel kenmerken van metastase bij patiënten met een hoog risico op neuroblastoom getrouw kan samenvatten. Het belangrijkste voordeel van dit gemetastaseerde zebravismodel is de real-time in vivo beeldvorming van tumorverspreiding om beter te begrijpen wanneer en mogelijk hoe metastase optreedt.Deze techniek is niet specifiek voor neuroblastoom. Het kan worden toegepast op zebravismodellen van verschillende soorten kanker, zolang de tumorcellen kunnen worden geïdentificeerd en gevolgd, wat leidt tot een reeks mogelijkheden. Ontwikkel om te beginnen een heterozygote transgene vislijn die zowel MYCN als LMO1 overexpressie geeft door MYCN- en LMO1-transgene lijnen te kruisen.Gebruik op een dag na de bevruchting een stereoscopische fluorescentiemicroscoop om het nageslacht van outcross te sorteren op EGFP-expressie, die zich presenteert als EGFP-positieve punten. Isoleer na het sorteren de gescreende embryo's in afzonderlijke petrischalen en labelschalen als MYCN-positief of MYCN-negatief. Visualiseer en sorteer embryo's van beide groepen voor LMO1-expressie drie tot vier dagen na de bevruchting.Zoek naar rode fluorescentievlekken in zowel het superieure cervicale ganglion als niet-PSNS dopaminerge neuronale cellen, vooral in de oblongata medulla van de achterhersenen. Voer de screening uit voordat embryo's vijf dagen na de bevruchting bereiken. Isoleer vervolgens gesorteerde vissen in vier groepen van verschillende genotypen en label als alleen MYCN, alleen LMO1, MYCN en LMO1 beide en wildtype.Verhoog ze in identieke omstandigheden volgens standaardprotocollen. Visualiseer tumoren met een stereoscopische fluorescentiemicroscoop door voorzichtig vissen om te draaien met een metalen spatel aan beide laterale zijden om de tumor te bekijken. Na identificatie van de mogelijke tumordragende vissen, isoleer ze in een aparte tank met de juiste labels die de geboortedatum, datum waarop de tumor werd gescreend en genotype bevatten.Herhaal zes weken na de bevruchting eerdere stappen om te screenen op tumordragende vissen en niet-tumordragende vissen om de aanwezigheid van tumoren voor eerder gescreende vissen te bevestigen of nieuwe mogelijke tumordragende vissen te identificeren. Zoek naar de aanhoudende of toegenomen grootte van de fluorescentiepositieve massa en bevestigde tumordragende vissen. Na het identificeren van tumordragende vissen, controleert u ze tweewekelijks op bewijs van tumorcelmigratie, die zich presenteert als kleine EGFP- of mCherry-positieve tumormassa's ver van de primaire plaats van tumorgenese.Isoleer deze vissen indien nodig in afzonderlijke tanks en label op de juiste manier om mogelijke metastase aan te geven. Na het interpreteren van de heterozygote MYCN in LMO1-vissen en tijdens het sorteren van hun nakomelingen, was EGFP MYCN-expressie prominent aanwezig in de niet-PSNS dopaminerge neuronale cellen op één dag na de bevruchting. Daarentegen was de LMO1-expressie prominent aanwezig in zowel PSNS-cellen als niet-PSNS dopaminerge neuronale cellen.Fluorescerende positieve tumormassa's werden gedetecteerd in weefsels in organen, ver weg van de primaire tumorplaats in de samengestelde transgene vis met overexpressie van zowel MYCN als LMO1, maar niet in de transgene vis met de expressie van MYCN alleen. H & E-kleuring van de chirurgische secties toont aan dat de primaire tumor is ontstaan uit het interrenale kliergebied, het zebravisequivalent van de menselijke bijnier, de meest voorkomende plaats van primaire ziekte bij neuroblastoompatiënten. Tumormassa's ver van de interrenale klier werden gedetecteerd in meerdere regio's, waaronder het distale deel van de nier, baan, kieuw, milt en de binnenwand van de atriale kamer van het hart.De PSNS neuroblastenlijn van tumorcellen bij de primaire tumor en alle gemetastaseerde plaatsen werd bevestigd. Aanzienlijk versterkte hoeveelheden en verhoogde dikte van PSR-gekleurde collageenvezels werden gevonden in MYCN LMO1-tumoren in vergelijking met de tumoren die alleen MYCN tot expressie brengen. Na het gebruik van deze procedure kunnen geneesmiddelenscreening en het testen van nieuwe kankertherapieën worden toegepast, wat mogelijk kan leiden tot de ontwikkeling van alternatieve middelen om uitgezaaide kankers te voorkomen en te behandelen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model van de oorspronkelijke tumor Ontwikkeling en peritoneale metastase<em&gt; via</em&gt; Orthotope Inenting met ovariumcarcinoom Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van<em&gt; De Novo</em&gt; Maagkanker Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

Een syngeneïsch orthotopisch osteosarcoom Sprague Dawley Rat-model met amputatie om de metastasesnelheid te beheersen

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...