Name: zebrafish model of neuroblastoma metastasis
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione R01 CA240323 (S.Z.) del National Cancer Institute; una sovvenzione W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (DoD); un V Scholar award dalla V Foundation for Cancer Research (S.Z.) e un Platform Grant dal Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); e i supporti del Mayo Clinic Cancer Center e del Center for Individualized Medicine (S.Z.).

Tutti i metodi di ricerca che utilizzano il pesce zebra e la cura / manutenzione degli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della Mayo Clinic.
1. Preparazione e microiniezione di costrutti transgenici per lo sviluppo della linea LMO1 transgenica zebrafish con sovraespressione in PSNS
<ol><li>Per sviluppare il clone di ingresso LMO1-pDONR221 , amplificare la regione codificante di LMO1 umano dal cDNA ottenuto dalla linea cellul...

<ol>
	<li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li><li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+cancer+model.">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).</li><li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li><li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish.">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma.">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis.">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).</li><li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children's+oncology+group's+2013+blueprint+for+research:+neuroblastoma.">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li><li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+model+of+neuroblastoma:+differentiating+stroma-poor+tumors'+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage.">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li><li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma.">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li><li>Tolbert, V. P., Matthay, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuroblastoma.">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis.">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification.">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li><li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface.">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells,+regional+tumor+heterogeneity,+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Amores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+hox+clusters+and+vertebrate+genome+evolution.">Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution.</a> Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).</li><li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map.">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li><li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins.">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li></ol>

Il pesce zebra è stato comunemente utilizzato nella ricerca negli ultimi decenni, in particolare nella ricerca sul cancro, per ovvi motivi, come la sua facilità di manutenzione, la riproduzione robusta e chiari vantaggi per l'imaging in vivo1,28. Il modello del pesce zebra può essere facilmente manipolato embrionalmente a causa della loro fecondazione e sviluppo esterni, che si integra bene con gli organismi modello dei mammiferi, come ratti e topi, p...

Zebrafish è stato ampiamente utilizzato e applicato a diverse aree di ricerca, in particolare nel cancro. Questo modello offre molti vantaggi, come la sua riproduzione robusta, la manutenzione economica e la visualizzazione versatile della crescita tumorale e delle metastasi, che rendono il pesce zebra un potente strumento per studiare e studiare le basi cellulari e molecolari della tumorigenesi e delle metastasi. Nuove tecniche per la mappatura del genoma su larga scala, la transgenesi, la sovraespressione o il knockout dei geni, il trapianto di cellule e gli schermi chimici hanno aumentato immensamente la potenza del modello di pesce zebra1. Negli ultimi anni, molte linee di zebrafish sono state sviluppate per studiare la tumorigenesi e le metastasi di una varietà di tumori umani, tra cui, ma non solo, leucemia, melanoma, rabdomiosarcoma e carcinoma epatocellulare2,3,4,5. Inoltre, il primo modello di neuroblastoma (NB) di zebrafish è stato generato sovraesprimendo MYCN, un oncogene, nel sistema nervoso simpatico periferico (PSNS) sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). Con questo modello, è stato ulteriormente dimostrato che l'ALK attivato può sinergizzare con MYCN per accelerare l'insorgenza del tumore e aumentare la penetranza tumorale in vivo6.
NB deriva dal lignaggio simpatico-surrenale delle cellule della cresta neurale ed è un tumore altamente metastatico nei bambini7. È responsabile del 10% dei decessi correlati al cancro pediatrico8. Ampiamente metastatizzato alla diagnosi, l'NB può essere presentato clinicamente come tumori che hanno origine principalmente lungo la catena dei gangli simpatici e del midollo surrenale di PSNS9,10. L'amplificazione di MYCN è comunemente associata a scarsi esiti nei pazienti nb11,12. Inoltre, LMO1 è stato identificato come un gene critico di suscettibilità NB nei casi ad alto rischio13,14. Gli studi hanno scoperto che la coespressione transgenica di MYCN e LMO1 nel PSNS del modello zebrafish non solo promuove l'insorgenza precoce di NB, ma induce anche metastasi diffuse ai tessuti e agli organi che sono simili ai siti comunemente osservati nei pazienti con NB13 ad alto rischio. Molto recentemente, un altro fenotipo metastatico di NB è stato osservato anche in un nuovo modello di zebrafish di NB, in cui sia MYCN che Lin28B, che codificano per una proteina legante l'RNA, sono sovraespressi sotto controllo del promotore dβh16.
L'approccio transgenico stabile nel pesce zebra è spesso usato per studiare se la sovraespressione di un gene di interesse potrebbe contribuire al normale sviluppo e alla patogenesi della malattia14,15. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per dimostrare l'importanza di più geni e percorsi per la tumorigenesi NB6,16,17,18,19,20. Questo articolo introdurrà come è stata creata la linea transgenica del pesce che sovraesprime sia MYCN che LMO1 nel PSNS e come è stato dimostrato che la cooperazione di questi due oncogeni accelera l'insorgenza della tumorigenesi NB e delle metastasi13. In primo luogo, la linea transgenica che sovraesprime EGFP-MYCN sotto controllo del promotore dβh (linea MYCN designata) è stata sviluppata iniettando il costrutto dβh-EGFP-MYCN in uno stadio unicellulare di embrioni AB wild-type (WT), come precedentemente descritto6,17. Una linea transgenica separata che sovraesprime LMO1 nel PSNS (linea LMO1 designata) è stata sviluppata coniettando due costrutti di DNA, dβh-LMO1 e dβh-mCherry, in embrioni WT allo stadio di una cellula13. È stato precedentemente dimostrato che i costrutti a doppio DNA coiniettati possono essere cointerificati nel genoma del pesce; pertanto, LMO1 e mCherry sono coespressi nelle cellule PSNS degli animali transgenici. Una volta che gli embrioni F0 iniettati hanno raggiunto la maturità sessuale, sono stati poi superati con pesci WT per l'identificazione di pesci positivi con integrazione transgenica( s). In breve, la prole F1 è stata sottoposta per la prima volta a screening al microscopio fluorescente per l'espressione di mCherry nelle cellule PSNS. L'integrazione germinale di LMO1 nei pesci mCherry-positivi è stata ulteriormente confermata dalla PCR genomica e dal sequenziamento. Dopo aver identificato con successo ciascuna linea transgenica, la progenie di pesci transgenici eterozigoti MYCN e LMO1 è stata incrociata per generare una linea di pesce composta che esprime sia MYCN che LMO1 (designata MYCN; Linea LMO1). MYCN portante tumorale; I pesci LMO1 sono stati monitorati al microscopio fluorescente due volte alla settimana per l'evidenza di tumori metastatici nelle regioni distanti dal sito primario, regione della ghiandola interrenale (IRG, zebrafish equivalente della ghiandola surrenale umana)13. Confermare le metastasi dei tumori in MYCN; Sono state applicate analisi LMO1 per pesci, istologiche e immunoistochimiche.

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		<tr>
			<td>3,3&#8217;-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific / Acros Organic</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose GP2</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>009012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Intense R Detection</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND primary antibody diluent</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND-MAX IHC instrument</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fully automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH211-270H11 BAC clone</td>
			<td>BACPAC resources center (BRFC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope equipped with DP71 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801601</td>
			<td>ready-to-use (no preparation needed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>86-1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Roche Applied Science, IN</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>HHS-32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Avidin D</td>
			<td>Vector</td>
			<td>A-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>4360-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Teknova, Inc.</td>
			<td>K2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>554-13-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome for sectioning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p3E-polyA</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift 
			(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin wax</td>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>39603002</td>
			<td>Parrafin to parafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)</td>
			<td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONR 221 gateway donor vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12536-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONRP4-P1R donor vector</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 0.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirrius red stain kit</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24901-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pME-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26028</td>
			<td>(DBH construct)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>21712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDO Rapid Decalcifier</td>
			<td>Apex Enginerring</td>
			<td>RDO04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP&#174;&#160;6 AI Vacuum Infiltration Processor</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: VIP-6-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical Incorporated</td>
			<td>20513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish model of neuroblastoma metastasis

Il pesce zebra è emerso come un importante modello animale per studiare le malattie umane, in particolare il cancro. Insieme alle robuste tecnologie transgeniche e di editing del genoma applicate nella modellazione del pesce zebra, la facilità di manutenzione, la produttività ad alto rendimento e la potente imaging dal vivo rendono il pesce zebra un prezioso sistema modello per studiare metastasi e basi cellulari e molecolari alla base di questo processo in vivo. Il primo modello di metastasi del neuroblastoma del pesce zebra (NB) è stato sviluppato sovraesprimendo due oncogeni, MYCN e LMO1, sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). MyCN e LMO1 co-sovraespressi hanno portato alla riduzione della latenza e all'aumento della penetranza della neuroblastomagenesi, nonché all'accelerazione delle metastasi a distanza delle cellule tumorali. Questo nuovo modello ribadisce in modo affidabile molte caratteristiche chiave della NB metastatica umana, incluso il coinvolgimento di alterazioni genetiche clinicamente rilevanti e associate a metastasi; sviluppo naturale e spontaneo di metastasi in vivo; e siti conservati di metastasi. Pertanto, il modello zebrafish possiede vantaggi unici per sezionare il complesso processo di metastasi tumorali in vivo.

Per determinare se LMO1 sinergizza con MYCN per influenzare la patogenesi NB, i costrutti transgenici che guidano l'espressione di LMO1 (dβh:LMO1 e dβh:mCherry) o MYCN (dβh:EGFP-MYCN) nelle cellule PSNS sotto controllo del promotore dβh sono stati iniettati negli embrioni di zebrafish13. Come illustrato nella Figura 1A, dopo lo sviluppo di linee transgeniche stabili e la convalida dei loro gen...

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Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Questo documento introduce il metodo per sviluppare, caratterizzare e tracciare in tempo reale le metastasi tumorali nel modello di neuroblastoma zebrafish, in particolare nella linea transgenica zebrafish con sovraespressione di MYCN e LMO1, che sviluppa metastasi spontaneamente.

Zebrafish Modello di Metastasi del Neuroblastoma

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Questi metodi sono stati utilizzati per sviluppare il primo modello di zebrafish di metastasi del neuroblastoma. E per dimostrare che questo modello può ricapitolare fedelmente molte caratteristiche delle metastasi osservate in pazienti ad alto rischio di neuroblastoma. Il vantaggio principale di questo modello metastatico di zebrafish è l'imaging in vivo in tempo reale della diffusione del tumore per capire meglio quando e possibilmente come si verificano le metastasi.Questa tecnica non è specifica per il neuroblastoma. Può essere applicato a modelli di zebrafish di diversi tipi di tumori purché le cellule tumorali possano essere identificate e tracciate portando a una serie di possibilità. Per iniziare, sviluppare una linea di pesce transgenica eterozigote che sovraesprima sia MYCN che LMO1 incrociando linee transgeniche MYCN e LMO1.Ad un giorno dopo la fecondazione, utilizzare un microscopio a fluorescenza stereoscopica per ordinare la progenie di outcross per l'espressione EGFP, che si presenta come punti positivi EGFP. Dopo la cernita, isolare gli embrioni sottoposti a screening in piastre di Petri separate ed etichettare le piastre come MYCN positive o MYCN negative. Visualizza e ordina gli embrioni di entrambi i gruppi per l'espressione di LMO1 da tre a quattro giorni dopo la fecondazione.Cerca macchie di fluorescenza rossa sia nel ganglio cervicale superiore che nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS, specialmente nel midollo allungato del cervello posteriore. Eseguire lo screening prima che gli embrioni raggiungano i cinque giorni dopo la fecondazione. Quindi isolare i pesci ordinati in quattro gruppi di genotipi diversi ed etichettare come solo MYCN, solo LMO1, MYCN e LMO1 entrambi e wild type.Allevarli in condizioni identiche secondo i protocolli standard. Visualizza i tumori con un microscopio a fluorescenza stereoscopica capovolgendo delicatamente il pesce con una spatola metallica su entrambi i lati laterali per visualizzare il tumore. Dopo l'identificazione dei possibili pesci portatori di tumore, isolarli in un serbatoio separato con etichette appropriate che includono la data di nascita, la data in cui il tumore è stato sottoposto a screening e il genotipo.A sei settimane dopo la fecondazione, ripetere i passaggi precedenti per lo screening dei pesci portatori di tumore e dei pesci non portatori di tumore per confermare la presenza di tumori per pesci precedentemente sottoposti a screening o identificare nuovi possibili pesci portatori di tumore. Cerca le dimensioni sostenute o aumentate della massa positiva alla fluorescenza e dei pesci portatori di tumore confermati. Dopo aver identificato i pesci portatori di tumore, monitorarli due volte alla settimana per l'evidenza della migrazione delle cellule tumorali, che si presenta come minuscole masse tumorali EGFP o mCherry positive lontano dal sito primario di genesi del tumore.Isolare questi pesci in vasche separate secondo necessità ed etichettare in modo appropriato per indicare possibili metastasi. Dopo aver interpretato il MYCN eterozigote nei pesci LMO1 e durante l'ordinamento della loro progenie, l'espressione di EGFP MYCN era prominente nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS in un giorno dopo la fecondazione. Al contrario, l'espressione di LMO1 era prominente sia nelle cellule PSNS che nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS.Masse tumorali fluorescenti positive sono state rilevate nei tessuti degli organi, distanti dal sito tumorale primario nel pesce transgenico composto con sovraespressione sia di MYCN che di LMO1, ma non nel pesce transgenico con la sola espressione di MYCN. La colorazione H & E delle sezioni chirurgiche mostra che il tumore primario è sorto dalla regione della ghiandola interrenale, l'equivalente zebrafish della ghiandola surrenale umana che è il sito più comune di malattia primaria nel paziente con neuroblastoma. Masse tumorali distanti dalla ghiandola interrenale sono state rilevate in più regioni, tra cui la porzione distale del rene, l'orbita, la branchia, la milza e la parete interna della camera atriale del cuore.Il lignaggio dei neuroblasti PSNS delle cellule tumorali nel tumore primario e in tutti i siti metastatici è stato confermato. Quantità significativamente amplificate e aumento dello spessore delle fibre di collagene colorate con PSR sono state trovate nei tumori MYCN LMO1 rispetto ai tumori che esprimono mycn da solo. Dopo aver utilizzato questa procedura, è possibile applicare lo screening farmacologico e testare nuove terapie antitumorali, che possono potenzialmente portare allo sviluppo di agenti alternativi per prevenire e curare i tumori metastatici.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Modello murino sperimentale di sviluppo del tumore originale e peritoneale Metastasi<em&gt; via</em&gt; Ortotopico inoculazione con cellule dell&#39;ovaio Carcinoma

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Modello in vivo per la prova Effetto dell&#39;ipossia sul tumore metastasi

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

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Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di<em&gt; De Novo</em&gt; Metastasi del cancro del mammario

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modello del polmone acellulare e cellulari per lo studio di metastasi del tumore

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

Un modello di ratto sprague Dawley ortotopico singenico con amputazione per controllare il tasso di metastasi

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...