Name: zebrafish model of neuroblastoma metastasis
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00
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この研究は、国立がん研究所からの助成金R01 CA240323(S.Z.)によって支援された。米国国防総省(DoD)からの助成金W81XWH-17-1-0498(S.Z.)。V Foundation for Cancer Research(S.Z.)のV奨学生賞とMayo Center for Biomedical Discovery(S.Z.)のプラットフォーム助成金。メイヨークリニックがんセンターと個別化医療センター(S.Z.)からの支援。

ゼブラフィッシュと動物のケア/メンテナンスを使用したすべての研究方法は、メイヨークリニックの施設ガイドラインに準拠して実施されました。
1. PSNSにおいて過剰発現を有する LMO1 トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の開発のための導入遺伝子構築物の調製およびマイクロインジェクション
<ol><li>LMO1-pDONR221エントリークローンを開発するには、...

<ol>
	<li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li><li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+cancer+model.">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).</li><li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li><li>Benjamin, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma.">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis.">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).</li><li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children's+oncology+group's+2013+blueprint+for+research:+neuroblastoma.">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li><li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+model+of+neuroblastoma:+differentiating+stroma-poor+tumors'+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage.">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li><li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma.">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li><li>Tolbert, V. P., Matthay, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuroblastoma.">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis.">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. 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Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+zebrafish+transgenesis+for+functional+genomic+analysis+of+candidate+cooperative+genes+in+tumor+pathogenesis.">Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+GAB2+in+neuroblastoma+pathogenesis+through+the+promotion+of+SHP2/MYCN+cooperation.">Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation.</a> Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).</li><li>Zimmerman, M. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Amores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+hox+clusters+and+vertebrate+genome+evolution.">Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution.</a> Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).</li><li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map.">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li><li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins.">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li></ol>

ゼブラフィッシュは、メンテナンスの容易さ、堅牢な再生、in vivoイメージングの明確な利点などの明白な理由から、過去数十年間、特にがん研究で一般的に使用されてきました1,28。ゼブラフィッシュモデルは、大規模な遺伝学的研究のために、ラットやマウスなどの哺乳類モデル生物をうまく補完する外部受精および発達のために、胚的に...

ゼブラフィッシュは広く使用されており、特に癌において、いくつかの研究分野に適用されています。このモデルは、堅牢な再生、費用対効果の高いメンテナンス、腫瘍の成長と転移の汎用性の高い視覚化など、多くの利点を提供し、ゼブラフィッシュを腫瘍形成と転移の細胞および分子基盤を研究および調査するための強力なツールにします。大規模なゲノムマッピング、トランスジェネシス、遺伝子の過剰発現またはノックアウト、細胞移植、および化学スクリーニングのための新しい技術は、ゼブラフィッシュモデルの力を非常に増強しました1。過去数年間、白血病、黒色腫、横紋筋肉腫、肝細胞癌を含むがこれらに限定されない様々なヒト癌の腫瘍形成および転移を研究するために、多くのゼブラフィッシュ系統が開発されてきた2,3,4,5。さらに、神経芽細胞腫(NB)の最初のゼブラフィッシュモデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で末梢交感神経系(PSNS)において癌遺伝子であるMYCNを過剰発現させることによって生成された。このモデルでは、活性化ALKがMYCNと相乗作用して腫瘍発症を加速し、vivoでの腫瘍浸透度を高めることができることがさらに実証されました6。
NBは神経堤細胞の交感神経副腎系譜に由来し、小児において転移性の高い癌である7。小児がん関連死の10%を占めています8。診断時に広く転移したNBは、主にPSNS9,10の交感神経節および副腎髄質の鎖に沿って起源とする腫瘍として臨床的に提示され得る。MYCN増幅は、NB患者における転帰不良と一般的に関連している11、12。さらに、LMO1は高リスク症例において重要なNB感受性遺伝子として同定されている13,14。ゼブラフィッシュモデルのPSNSにおけるMYCNとLMO1のトランスジェニック共発現は、NBの早期発症を促進するだけでなく、高リスクNB13患者で一般的に見られる部位に類似した組織および器官への広範な転移を誘導することも研究によって見出された。ごく最近、NBの新しいゼブラフィッシュモデルでもNBの別の転移表現型が観察されており、RNA結合タンパク質をコードするMYCNとLin28Bの両方がdβhプロモーターの制御下で過剰発現している16。
ゼブラフィッシュにおける安定したトランスジェニックアプローチは、目的の遺伝子の過剰発現が正常な発育および疾患の病因に寄与するかどうかを研究するためによく使用されます14,15。この技術は、NB腫瘍形成に対する複数の遺伝子および経路の重要性を実証するために首尾よく使用されている6、16、17、18、19、20。本稿では、PSNSにおいてMYCNとLMO1の両方を過剰発現するトランスジェニックフィッシュラインがどのように作られたのか、そしてこれら2つのがん遺伝子の協力がNB腫瘍形成と転移の発症を加速させることがどのように実証されたかを紹介します13。まず、dβhプロモーターの制御下でEGFP-MYCNを過剰発現するトランスジェニック株(MYCN株と命名)を、先に説明したように、dβh-EGFP-MYCN構築物を野生型(WT)AB胚の1細胞段階に注入することによって開発した6,17。PSNSでLMO1を過剰発現する別のトランスジェニック株(LMO1株と命名)は、2つのDNA構築物dβh-LMO1と dβh-mCherryをWT胚に1細胞段階で同時注入することによって開発された13。共注入された二重DNA構築物が魚のゲノムに共統合され得ることが以前に実証されている。したがって、LMO1およびmCherryは、トランスジェニック動物のPSNS細胞において共発現される。注入されたF0胚が性的成熟に達すると、それらはWT魚と交配され、導入遺伝子が組み込まれた陽性魚の同定が行われた。簡単に説明すると、F1の子孫を、PSNS細胞におけるmCherry発現について蛍光顕微鏡によって最初にスクリーニングした。mCherry陽性魚類におけるLMO1の生殖細胞系列の組み込みを、ゲノムPCRおよびシーケンシングによってさらに確認した。各トランスジェニック系統の同定に成功した後、ヘテロ接合型MYCNおよびLMO1トランスジェニック魚の子孫を交配して、MYCNおよびLMO1の両方を発現する複合魚系統(MYCNと命名;LMO1 行)。担癌性MYCN;LMO1魚類を隔週で蛍光顕微鏡によりモニターし、原発部位から離れた領域、腎間領域(IRG、ヒト副腎のゼブラフィッシュと同等)における転移性腫瘍の証拠について13。MYCNにおける腫瘍の転移を確認するために;LMO1魚類、組織学的および免疫組織化学的分析を適用した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific / Acros Organic</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose GP2</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>009012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Intense R Detection</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND primary antibody diluent</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND-MAX IHC instrument</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fully automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH211-270H11 BAC clone</td>
			<td>BACPAC resources center (BRFC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope equipped with DP71 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801601</td>
			<td>ready-to-use (no preparation needed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>86-1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Roche Applied Science, IN</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>HHS-32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Avidin D</td>
			<td>Vector</td>
			<td>A-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>4360-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Teknova, Inc.</td>
			<td>K2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>554-13-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome for sectioning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p3E-polyA</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift 
			(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin wax</td>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>39603002</td>
			<td>Parrafin to parafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)</td>
			<td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONR 221 gateway donor vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12536-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONRP4-P1R donor vector</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 0.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirrius red stain kit</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24901-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pME-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26028</td>
			<td>(DBH construct)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>21712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDO Rapid Decalcifier</td>
			<td>Apex Enginerring</td>
			<td>RDO04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP&#174;&#160;6 AI Vacuum Infiltration Processor</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: VIP-6-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical Incorporated</td>
			<td>20513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish model of neuroblastoma metastasis

ゼブラフィッシュは、ヒトの疾患、特に癌を研究するための重要な動物モデルとして浮上している。ゼブラフィッシュのモデリングに適用される堅牢なトランスジェニックおよびゲノム編集技術に加えて、メンテナンスの容易さ、高収率の生産性、および強力なライブイメージングにより、ゼブラフィッシュは、このプロセスの根底にある転移および細胞および分子基盤をインビボで研究するための貴重なモデルシステムとなっています。転移の最初のゼブラフィッシュ神経芽細胞腫(NB)モデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で、2つの癌遺伝子、MYCNおよびLMO1を過剰発現させることによって開発された。MYCNおよびLMO1を共発現させることは、神経芽細胞腫形成の潜伏期間の減少および浸透度の増加、ならびに腫瘍細胞の遠隔転移の加速をもたらした。この新しいモデルは、臨床的に関連する遺伝子改変および転移関連遺伝子改変の関与を含む、ヒト転移性NBの多くの重要な特徴を確実に繰り返している。インビボでの転移の自然および自発的な発生;転移の保存された部位。したがって、ゼブラフィッシュモデルは、インビボでの腫瘍転移の複雑なプロセスを解剖するユニークな利点を有する。

LMO1がMYCNと相乗作用してNBの病因に影響を及ぼすかどうかを決定するために、dβhプロモーターの制御下にあるPSNS細胞におけるLMO1(dβh:LMO1およびdβh:mCherry)またはMYCN(dβh:EGFP-MYCN)のいずれかの発現を駆動するトランスジェニック構築物をゼブラフィッシュ胚に注入した13。 図1Aに例示されるように、安定...

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Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

本稿では、神経芽細胞腫のゼブラフィッシュモデル、特に自発的に転移を発症する MYCN および LMO1の過剰発現を伴うトランスジェニックゼブラフィッシュ系統における腫瘍転移をリアルタイムで発生、特徴付け、および追跡する方法を紹介する。

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

これらの方法は、神経芽細胞腫転移の最初のゼブラフィッシュモデルを開発するために使用された。そして、このモデルが神経芽細胞腫のリスクが高い患者に見られる転移の多くの特徴を忠実に再現できることを実証する。この転移性ゼブラフィッシュモデルの主な利点は、腫瘍播種をリアルタイムでin vivoでイメージングして、転移がいつ、そしておそらくどのように起こるかをよりよく理解できることです。この技術は神経芽細胞腫に特有のものではありません。これは、腫瘍細胞が同定され、追跡され、一連の可能性につながる限り、多様なタイプの癌のゼブラフィッシュモデルに適用することができる。まず、MYCNとLMO1トランスジェニック系統を交配させることによって、MYCNとLMO1の両方を過剰発現するヘテロ接合型トランスジェニック魚系統を開発する。受精後のある日、実体蛍光顕微鏡を使用して、EGFP発現のためのアウトクロスの子孫を分類し、EGFP陽性点として提示する。選別後、スクリーニングした胚を別々のペトリ皿に単離し、皿をMYCN陽性またはMYCN陰性としてラベル付けする。受精後3~4日でLMO1発現について両群の胚を可視化・選別する。上頸部神経節と非PSNSドーパミン作動性神経細胞の両方、特に後脳の延髄質に赤い蛍光斑点を探してください。胚が受精後5日に達する前にスクリーニングを行う。次に、選別した魚を異なる遺伝子型の4つのグループに分離し、MYCNのみ、LMO1のみ、MYCNおよびLMO1の両方および野生型としてラベル付けする。標準プロトコルに従って同じ条件でそれらを育てます。両側の金属ヘラで魚を優しくひっくり返して実体蛍光顕微鏡で腫瘍を可視化し、腫瘍を表示します。可能性のある腫瘍性魚を同定した後、生年月日、腫瘍がスクリーニングされた日付、および遺伝子型を含む適切なラベルでそれらを別のタンクに単離する。受精後6週間で、前のステップを繰り返して、担がん魚と非担がん魚をスクリーニングし、以前にスクリーニングした魚の腫瘍の存在を確認するか、または新しい可能性のある担がん魚を同定する。蛍光陽性塊の持続または増加したサイズを探し、腫瘍を有する魚を確認した。担がん魚を同定した後、腫瘍細胞遊走の証拠について隔週でそれらを監視しますが、これは腫瘍発生の原発部位から遠く離れた小さなEGFPまたはmCherry陽性腫瘍塊として提示されます。必要に応じてこれらの魚を別々のタンクに隔離し、転移の可能性を示すために適切にラベルを付けます。LMO1魚類におけるヘテロ接合型MYCNを解釈した後、それらの子孫を選別しながら、受精後1日で非PSNSドーパミン作動性神経細胞においてEGFP MYCN発現が顕著であった。対照的に、LMO1発現は、PSNS細胞および非PSNSドーパミン作動性ニューロン細胞の両方で顕著であった。蛍光陽性腫瘍塊は、MYCNおよびLMO1の両方の過剰発現を有する化合物トランスジェニック魚の原発腫瘍部位から離れた器官の組織において検出されたが、MYCN単独の発現を有するトランスジェニック魚では検出されなかった。手術切片のH&E染色は、原発性腫瘍が神経芽細胞腫患者における原発疾患の最も一般的な部位であるヒト副腎と同等のゼブラフィッシュである腎間領域から生じたことを示している。腎間腺から離れた腫瘍塊は、腎臓の遠位部、眼窩、えら、脾臓、および心臓の心房室の内壁を含む複数の領域で検出された。原発巣および全ての転移部位における腫瘍細胞のPSNS神経芽細胞系統が確認された。有意に増幅された量およびPSR染色コラーゲン線維の厚さの増加は、MYCNのみを発現する腫瘍と比較した場合、MYCN LMO1腫瘍において見出された。この手順を使用した後、薬物スクリーニングおよび新規がん治療法の試験を適用することができ、転移性がんを予防および治療するための代替薬剤の開発につながる可能性があります。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

オリジナル腫瘍の開発のマウス実験モデルと腹膜転移<em&gt;経由で</em卵巣癌細胞で&gt;同所接種

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

腫瘍転移に対する低酸素のテストの効果のためのインビボモデル

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;乳がん転移

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

無細胞性と細胞の肺転移モデル

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...