Name: zebrafish model of neuroblastoma metastasis
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa R01 CA240323 (S.Z.) do Instituto Nacional de Câncer; uma subvenção W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) do Departamento de Defesa dos Estados Unidos (DoD); um prêmio V Scholar da V Foundation for Cancer Research (S.Z.) e uma Bolsa de Plataforma do Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); e suportes do Mayo Clinic Cancer Center e Centro de Medicina Individualizada (S.Z.).

Todos os métodos de pesquisa utilizando zebrafish e cuidados/manutenção animal foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Clínica Mayo.
1. Preparação e microinjeção de construções transgênicas para o desenvolvimento da linha de zebrafish transgênico LMO1 com superexpressão em PSNS
<ol><li>Para desenvolver o clone de entrada LMO1-pDONR221 , amplie a região de codificação do LMO1 humano a partir de cDNA obtido a partir da lin...

<ol>
	<li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li><li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+cancer+model.">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).</li><li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li><li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish.">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma.">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis.">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).</li><li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children's+oncology+group's+2013+blueprint+for+research:+neuroblastoma.">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li><li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+model+of+neuroblastoma:+differentiating+stroma-poor+tumors'+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage.">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li><li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma.">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li><li>Tolbert, V. P., Matthay, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuroblastoma.">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis.">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification.">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li><li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface.">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirius+red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue.">Sirius red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).</li><li>Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cancer+in+zebrafish.">In vivo imaging of cancer in zebrafish.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).</li><li>Howe, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells,+regional+tumor+heterogeneity,+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Amores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+hox+clusters+and+vertebrate+genome+evolution.">Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution.</a> Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).</li><li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map.">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li><li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins.">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li></ol>

O zebrafish tem sido comumente utilizado em pesquisas nas últimas décadas, especialmente em pesquisas sobre câncer, por razões óbvias, como sua facilidade de manutenção, reprodução robusta e claras vantagens para a imagem in vivo1,28. O modelo de zebrafish pode ser facilmente manipulado embrionáriamente devido à sua fertilização e desenvolvimento externo, o que complementa bem aos organismos modelos de mamíferos, como ratos e camundongos, p...

O zebrafish tem sido amplamente utilizado e aplicado em diversas áreas de pesquisa, especialmente no câncer. Este modelo oferece muitas vantagens - como sua reprodução robusta, manutenção econômica e visualização versátil do crescimento tumoral e metástase- tudo isso faz do zebrafish uma ferramenta poderosa para estudar e investigar as bases celulares e moleculares de tumorigênese e metástase. Novas técnicas para mapeamento de genomas em larga escala, transgênese, superexpressão ou nocaute de genes, transplante de células e telas químicas aumentaram imensamente o poder do modelo de zebrafish1. Nos últimos anos, muitas linhas de zebrafish foram desenvolvidas para estudar tumorigênese e metástase de uma variedade de cânceres humanos, incluindo, mas não se limitando à leucemia, melanoma, rabdomiossarcoma e carcinoma hepatocelular2,3,4,5. Além disso, o primeiro modelo de zebrafish de neuroblastoma (NB) foi gerado pela superexpressão mycn, um oncogene, no sistema nervoso simpático periférico (PSNS) sob controle do promotor dopamina-beta-hidroxilase (dβh). Com este modelo, foi demonstrado ainda que a ALK ativada pode sinergizar com MYCN para acelerar o aparecimento do tumor e aumentar a penetração do tumor no vivo6.
NB é derivado da linhagem simpática das células da crista neural, e é um câncer altamente metastático em crianças7. É responsável por 10% das mortes relacionadas ao câncer pediátrico8. Amplamente metástase no diagnóstico, a NB pode ser clinicamente apresentada como tumores originários principalmente ao longo da cadeia da gânglio simpático e da medula adrenal de PSNS9,10. A amplificação do MYCN está comumente associada a desfechos ruins em pacientes com NB11,12. Além disso, o LMO1 foi identificado como um gene crítico de suscetibilidade de NB em casos de alto risco13,14. Estudos descobriram que a coexpressão transgênica de MYCN e LMO1 no PSNS do modelo de zebrafish não só promove o início precoce do RN, mas também induz metástase generalizada aos tecidos e órgãos semelhantes aos locais comumente vistos em pacientes com NB13 de alto risco. Muito recentemente, outro fenótipo metastático de NB também foi observado em um modelo mais recente de zebrafish de NB, no qual tanto MYCN quanto Lin28B, codificando uma proteína de ligação de RNA, são superexpressos sob controle do promotor dβh16.
A abordagem transgênica estável no zebrafish é frequentemente usada para estudar se a superexpressão de um gene de interesse poderia contribuir para o desenvolvimento normal e a patogênese da doença14,15. Esta técnica tem sido usada com sucesso para demonstrar a importância de múltiplos genes e caminhos para a tumorigênese do RN6,16,17,18,19,20. Este artigo introduzirá como a linha de peixes transgênicos que sobreexpressa tanto o MYCN quanto o LMO1 no PSNS foi criada e como foi demonstrado que a cooperação desses dois oncogenes acelera o surgimento da tumorigênese e metástase do NB13. Primeiro, a linha transgênica que sobreexpressa o EGFP-MYCN sob controle do promotor dβh (linha MYCN designada) foi desenvolvida injetando a construção dβh-EGFP-MYCN em um estágio de uma célula de embriões AB do tipo selvagem (WT), como descrito anteriormente6,17. Uma linha transgênica separada que sobreexpressa lMO1 na linha PSNS (designada LMO1) foi desenvolvida por cunhar duas construções de DNA, dβh-LMO1 e dβh-mCherry, em embriões WT no estágio de uma célula13. Foi demonstrado anteriormente que construções de DNA duplo coinjetados podem ser cunhadas no genoma do peixe; portanto, LMO1 e mCherry são coexpressos nas células PSNS dos animais transgênicos. Uma vez que os embriões F0 injetados atingiram a maturidade sexual, eles foram então superados com peixes WT para a identificação de peixes positivos com integração transgene(s). Resumidamente, a prole F1 foi examinada pela primeira vez por microscopia fluorescente para expressão mCherry nas células PSNS. A integração germinal de LMO1 em peixes mCherry-positivo foi confirmada ainda por PCR genômico e sequenciamento. Após a identificação bem sucedida de cada linha transgênica, a prole de peixes transgênicos HEterozigous MYCN e LMO1 foram interladas para gerar uma linha de peixes compostos expressando tanto MYCN quanto LMO1 (denominada MYCN; Linha LMO1). MYCN portador de tumor; Os peixes LMO1 foram monitorados por microscopia fluorescente quinzenalmente para a evidência de tumores metastáticos nas regiões distantes do local primário, região da glândula interrenal (IRG, zebrafish equivalente à glândula adrenal humana)13. Confirmar a metástase dos tumores no MYCN; Foram aplicadas análises histológicas e imunohistoquímicas de peixes LMO1, histológicas e imunohistoquímicas.

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		<tr>
			<td>3,3&#8217;-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific / Acros Organic</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose GP2</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>009012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Intense R Detection</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND primary antibody diluent</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND-MAX IHC instrument</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fully automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH211-270H11 BAC clone</td>
			<td>BACPAC resources center (BRFC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope equipped with DP71 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801601</td>
			<td>ready-to-use (no preparation needed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>86-1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Roche Applied Science, IN</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>HHS-32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Avidin D</td>
			<td>Vector</td>
			<td>A-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>4360-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Teknova, Inc.</td>
			<td>K2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>554-13-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome for sectioning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p3E-polyA</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift 
			(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin wax</td>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>39603002</td>
			<td>Parrafin to parafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)</td>
			<td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONR 221 gateway donor vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12536-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONRP4-P1R donor vector</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 0.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirrius red stain kit</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24901-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pME-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26028</td>
			<td>(DBH construct)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>21712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDO Rapid Decalcifier</td>
			<td>Apex Enginerring</td>
			<td>RDO04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP&#174;&#160;6 AI Vacuum Infiltration Processor</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: VIP-6-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical Incorporated</td>
			<td>20513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish model of neuroblastoma metastasis

O zebrafish emergiu como um importante modelo animal para estudar doenças humanas, especialmente o câncer. Juntamente com as robustas tecnologias transgênicas e de edição de genomas aplicadas na modelagem de zebrafish, a facilidade de manutenção, produtividade de alto rendimento e poderosa imagem ao vivo fazem do zebrafish um valioso sistema modelo para estudar metástase e bases celulares e moleculares subjacentes a esse processo in vivo. O primeiro modelo de metástase do neuroblastoma de zebrafish (NB) foi desenvolvido superexpressando dois oncogenes, MYCN e LMO1, sob controle do promotor de dopamina-beta-hidroxilase (dβh). O MYCN e o LMO1 co-superexpressos levaram à redução da latência e ao aumento da penetração da neuroblastomagênese, bem como à metástase distante acelerada das células tumorais. Este novo modelo reitera de forma confiável muitas características-chave da NB metastática humana, incluindo o envolvimento de alterações genéticas clinicamente relevantes e associadas à metástase; desenvolvimento natural e espontâneo da metástase in vivo; e locais conservados de metástases. Portanto, o modelo de zebrafish possui vantagens únicas para dissecar o complexo processo de metástase tumoral in vivo.

Para determinar se o LMO1 sinergiza com MYCN para afetar a patogênese NB, construções transgênicas que impulsionam a expressão de LMO1 (dβh:LMO1 e dβh:mCherry) ou MYCN (dβh:EGFP-MYCN) nas células PSNS sob controle do promotor dβh foram injetadas em embriões de zebrafish13. Conforme ilustrado na Figura 1A, após o desenvolvimento de linhas transgênicas estáveis e a validação de seus ...

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Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Este artigo introduz o método de desenvolver, caracterizar e rastrear em tempo real a metástase tumoral no modelo de zebrafish de neuroblastoma, especificamente na linha de zebrafish transgênico com superexpressão de MYCN e LMO1, que desenvolve metástase espontaneamente.

Modelo de Zebrafish de Metástase neuroblastoma

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Esses métodos foram utilizados para desenvolver o primeiro modelo de zebrafish de metástase neuroblastoma. E para demonstrar que esse modelo pode recapitular fielmente muitas características da metástase observadas em pacientes com alto risco de neuroblastoma. A principal vantagem desse modelo metastático de zebrafish é a imagem in vivo em tempo real da disseminação do tumor para entender melhor quando, e possivelmente como a metástase ocorre.Esta técnica não é específica para neuroblastoma. Pode ser aplicado a modelos de zebrafish de diversos tipos de câncer, desde que as células tumorais possam ser identificadas e rastreadas levando a uma série de possibilidades. Para começar, desenvolva uma linha de peixes transgênicos heterozigosos que expresse tanto MYCN quanto LMO1, intercalando linhas transgênicas MYCN e LMO1.Em um dia pós-fertilização, use um microscópio de fluorescência estereoscópica para classificar a progênidade do outcross para a expressão EGFP, que apresenta como pontos positivos EGFP. Após a classificação, isole embriões selecionados em pratos Petri separados e rotule pratos como MYCN positivo ou MYCN negativo. Visualize e classifique embriões de ambos os grupos para expressão LMO1 de três a quatro dias após a fertilização.Procure por manchas de fluorescência vermelha tanto no gânglio cervical superior quanto nas células neuronais não PSNS dopaminérgicas, especialmente na medula oblongata do cérebro traseiro. Realize a triagem antes que os embriões atinjam cinco dias após a fertilização. Em seguida, isole os peixes classificados em quatro grupos de genótipos diferentes e rotule apenas como MYCN, somente LMO1, MYCN e LMO1, ambos e tipo selvagem.Elevá-los em condições idênticas de acordo com os protocolos padrão. Visualize tumores com um microscópio de fluorescência estereoscópica lançando peixes suavemente com uma espátula metálica em ambos os lados laterais para ver o tumor. Após a identificação do possível peixe portador de tumor, isole-os em um tanque separado com rótulos apropriados que incluem a data de nascimento, data em que o tumor foi examinado e genótipo.Com seis semanas após a fertilização, repita etapas anteriores para a triagem de peixes portadores de tumores e peixes sem tumores para confirmar a presença de tumores para peixes previamente examinados ou identificar novos possíveis peixes portadores de tumores. Procure o tamanho sustentado ou aumentado da massa positiva da fluorescência e peixes com tumor confirmados. Depois de identificar peixes portadores de tumores, monitore-os quinzenalmente para obter evidências de migração de células tumorais, que apresentam como pequenas massas tumorais EGFP ou mCherry positivas longe do local principal da gênese tumoral.Isole esses peixes em tanques separados conforme necessário e rotule adequadamente para indicar possíveis metástases. Depois de interpretar o HEterozigos MYCN em peixes LMO1, e ao classificar sua descendência, a expressão EGFP MYCN foi proeminente nas células neuronais não PSNS dopaminérgicas em um dia após a fertilização. Em contraste, a expressão LMO1 foi proeminente em ambas as células PSNS e células neuronais não PSNS.Massas tumorais positivas fluorescentes foram detectadas em tecidos em órgãos, distantes do local do tumor primário no composto de peixes transgênicos com superexpressão tanto do MYCN quanto do LMO1, mas não apenas nos peixes transgênicos com a expressão de MYCN. A coloração de H&E das seções cirúrgicas mostra que o tumor primário surgiu da região da glândula interrenal, o equivalente a zebrafish da glândula suprarrenal humana que é o local mais comum da doença primária no paciente neuroblastoma. Massas tumorais distantes da glândula interrenal foram detectadas em várias regiões, incluindo a porção distal do rim, órbita, brânquia, baço e a parede interna da câmara atrial do coração.A linhagem neuroblasto do PSNS de células tumorais no tumor primário e todos os locais metastáticos foi confirmada. Quantidades significativamente amplificadas e aumento da espessura das fibras de colágeno manchadas de PSR foram encontradas em tumores MYCN LMO1 quando comparados com os tumores que expressam apenas MYCN. Após o uso desse procedimento, podem ser aplicadas terapias de rastreamento e teste de novos cânceres, o que pode potencialmente levar ao desenvolvimento de agentes alternativos para prevenir e tratar cânceres metastáticos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Pesquisa do câncer

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de<em&gt; De Novo</em&gt; Metástase do câncer mamário

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

Um modelo de rato de osteossarcoma ortotópico sintérico sprague dawley com amputação para controlar a taxa de metástase

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...