Name: zebrafish model of neuroblastoma metastasis
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом R01 CA240323 (S.Z.) от Национального института рака; грант W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) от Министерства обороны США (DOD); награда V Scholar от V Фонда исследований рака (S.Z.) и грант платформы от Центра биомедицинских открытий Майо (S.Z.); и поддержка со стороны Онкологического центра клиники Майо и Центра индивидуализированной медицины (S.Z.).

Все методы исследования с использованием рыбок данио и ухода за животными были выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами клиники Майо.
1. Подготовка и микроинъекция трансгенных конструкций для разработки трансгенной линии рыбок данио LMO1</em...

<ol>
	<li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li><li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+cancer+model.">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).</li><li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li><li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish.">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma.">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis.">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).</li><li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children's+oncology+group's+2013+blueprint+for+research:+neuroblastoma.">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li><li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+model+of+neuroblastoma:+differentiating+stroma-poor+tumors'+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage.">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li><li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma.">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li><li>Tolbert, V. P., Matthay, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+Clinical+and+biological+approach+to+risk+stratification+and+treatment.">Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).</li><li>Maris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuroblastoma.">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis.">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Tao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28B+regulates+transcription+and+potentiates+MYCN-induced+neuroblastoma+through+binding+to+ZNF143+at+target+gene+promotors.">LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).</li><li>Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+zebrafish+transgenesis+for+functional+genomic+analysis+of+candidate+cooperative+genes+in+tumor+pathogenesis.">Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+GAB2+in+neuroblastoma+pathogenesis+through+the+promotion+of+SHP2/MYCN+cooperation.">Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation.</a> Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).</li><li>Zimmerman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification.">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li><li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface.">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Wattrus, S. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+safe+harbor:+The+hematopoietic+stem+cell+niche+in+zebrafish.">Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish.</a> Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).</li><li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish.">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+Zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+staining+of+collagens+type+I,+II+and+III+by+Sirius+Red+and+polarization+microscopy.">Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.</a> Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).</li><li>Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirius+red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue.">Sirius red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).</li><li>Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cancer+in+zebrafish.">In vivo imaging of cancer in zebrafish.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).</li><li>Howe, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).</li><li>Yoganantharjah, P., Gibert, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+the+zebrafish+model+to+aid+in+drug+discovery+and+target+validation.">The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).</li><li>Ignatius, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells,+regional+tumor+heterogeneity,+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell+vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+with+orbital+metastasis:+ophthalmic+presentation+and+role+of+ophthalmologists.">Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists.</a> Eye. 20 (4), 466-470 (2006).</li><li>Papaioannou, G., McHugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+in+childhood:+review+and+radiological+findings.">Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings.</a> Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Amores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+hox+clusters+and+vertebrate+genome+evolution.">Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution.</a> Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).</li><li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map.">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li><li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins.">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li></ol>

Рыбки данио широко использовались в исследованиях в течение последних нескольких десятилетий, особенно в исследованиях рака, по очевидным причинам, таким как простота обслуживания, надежное размножение и явные преимущества для визуализации in vivo1,28.</sup...

Рыбки данио широко используются и применяются в нескольких областях исследований, особенно при раке. Эта модель предоставляет множество преимуществ, таких как ее надежное размножение, экономически эффективное поддержание и универсальная визуализация роста опухоли и метастазирования - все это делает рыбок данио мощным инструментом для изучения и исследования клеточных и молекулярных основ опухолевого генеза и метастазирования. Новые методы крупномасштабного картирования генома, трансгенеза, сверхэкспрессии или нокаута генов, трансплантации клеток и химических экранов значительно увеличили мощность модели рыбок данио1. За последние несколько лет было разработано много линий рыбок данио для изучения опухолевого генеза и метастазирования различных видов рака человека, включая, но не ограничиваясь, лейкемией, меланомой, рабдомиосаркомой и гепатоцеллюлярной карциномой2,3,4,5. Кроме того, первая модель нейробластомы рыбок данио (NB) была получена путем сверхэкспрессии MYCN, онкогена, в периферической симпатической нервной системе (PSNS) под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). С помощью этой модели было дополнительно продемонстрировано, что активированный ALK может синергировать с MYCN для ускорения начала опухоли и увеличения пенетрантности опухоли in vivo6.
NB получен из симпатоадреналовой линии клеток нервного гребня и является высокометастатическим раком у детей7. Он ответственен за 10% детских смертей, связанных с раком8. Широко метастазируемый при постановке диагноза, NB может быть клинически представлен как опухоли, в основном происходящие по цепочке симпатических ганглиев и мозгового вещества надпочечников PSNS9,10. Амплификация MYCN обычно связана с плохими исходами у пациентов с NB11,12. Кроме того, LMO1 был идентифицирован как критический ген чувствительности к NB в случаях высокого риска13,14. Исследования показали, что трансгенная коэкспрессия MYCN и LMO1 в PSNS модели рыбок данио не только способствует более раннему началу NB, но и индуцирует широко распространенные метастазы в ткани и органы, которые похожи на участки, обычно наблюдаемые у пациентов с высоким риском NB13. Совсем недавно другой метастатический фенотип NB также наблюдался в более новой модели NB рыбок данио, в которой как MYCN, так и Lin28B, кодирующие РНК-связывающий белок, чрезмерно экспрессируются под контролем промотора dβh16.
Стабильный трансгенный подход у рыбок данио часто используется для изучения того, может ли чрезмерная экспрессия интересующего гена способствовать нормальному развитию и патогенезу заболевания14,15. Этот метод был успешно использован для демонстрации важности нескольких генов и путей к опухолевому NB 6,16,17,18,19,20. В этой статье будет представлено, как была создана трансгенная рыбья линия, которая чрезмерно экспрессирует как MYCN, так и LMO1 в PSNS, и как было продемонстрировано, что сотрудничество этих двух онкогенов ускоряет начало опухолевого NB и метастазирования13. Во-первых, трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует EGFP-MYCN под контролем промотора dβh (обозначенная линией MYCN), была разработана путем инъекции конструкции dβh-EGFP-MYCN в одноклеточную стадию эмбрионов AB дикого типа (WT), как описано ранее6,17. Отдельная трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует LMO1 в PSNS (обозначенная линией LMO1), была разработана путем коинъекции двух конструкций ДНК, dβh-LMO1 и dβh-mCherry, в эмбрионы WT на стадии одной клетки13. Ранее было продемонстрировано, что коинъекционные двойные конструкции ДНК могут быть коинтегрированы в геном рыбы; поэтому LMO1 и mCherry совместно экспрессируются в клетках PSNS трансгенных животных. Как только введенные эмбрионы F0 достигали половой зрелости, их затем скрещивали с рыбой WT для идентификации положительных рыб с интеграцией трансгенов. Короче говоря, потомство F1 было впервые проверено флуоресцентной микроскопией на экспрессию mCherry в клетках PSNS. Интеграция зародышевой линии LMO1 у mCherry-положительных рыб была дополнительно подтверждена геномной ПЦР и секвенированием. После успешной идентификации каждой трансгенной линии потомство гетерозиготных трансгенных рыб MYCN и LMO1 скрещивалось для получения составной рыбной линии, экспрессирующей как MYCN, так и LMO1 (обозначенный MYCN; Линия LMO1). Опухоленосный MYCN; Рыбу LMO1 контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии раз в две недели на предмет наличия метастатических опухолей в областях, удаленных от первичного участка, области межпочечной железы (IRG, эквивалент надпочечников человека)13. Для подтверждения метастазирования опухолей в MYCN; Применены рыбный LMO1, гистологический и иммуногистохимический анализы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific / Acros Organic</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose GP2</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>009012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Intense R Detection</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND primary antibody diluent</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND-MAX IHC instrument</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fully automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH211-270H11 BAC clone</td>
			<td>BACPAC resources center (BRFC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope equipped with DP71 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801601</td>
			<td>ready-to-use (no preparation needed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>86-1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Roche Applied Science, IN</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>HHS-32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Avidin D</td>
			<td>Vector</td>
			<td>A-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>4360-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Teknova, Inc.</td>
			<td>K2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>554-13-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome for sectioning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p3E-polyA</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift 
			(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin wax</td>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>39603002</td>
			<td>Parrafin to parafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)</td>
			<td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONR 221 gateway donor vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12536-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONRP4-P1R donor vector</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 0.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirrius red stain kit</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24901-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pME-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26028</td>
			<td>(DBH construct)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>21712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDO Rapid Decalcifier</td>
			<td>Apex Enginerring</td>
			<td>RDO04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP&#174;&#160;6 AI Vacuum Infiltration Processor</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: VIP-6-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical Incorporated</td>
			<td>20513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish model of neuroblastoma metastasis

Рыбки данио стали важной животной моделью для изучения заболеваний человека, особенно рака. Наряду с надежными трансгенными технологиями и технологиями редактирования генома, применяемыми в моделировании рыбок данио, простота обслуживания, высокая продуктивность и мощная живая визуализация в целом делают рыбок данио ценной модельной системой для изучения метастазов и клеточных и молекулярных основ, лежащих в основе этого процесса in vivo. Первая модель метастазирования нейробластомы рыбок данио (NB) была разработана путем сверхэкспрессии двух онкогенов, MYCN и LMO1, под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). Ко-сверхэкспрессированные MYCN и LMO1 приводили к снижению латентности и усилению пенетрантности нейробластомагенеза, а также ускорению отдаленного метастазирования опухолевых клеток. Эта новая модель достоверно повторяет многие ключевые особенности метастатического НБ человека, включая участие клинически значимых и связанных с метастазами генетических изменений; естественное и спонтанное развитие метастазов in vivo; и сохраненные участки метастазов. Поэтому модель рыбок данио обладает уникальными преимуществами для рассечения сложного процесса метастазирования опухоли in vivo.

Чтобы определить, взаимодействует ли LMO1 с MYCN для воздействия на патогенез NB, трансгенные конструкции, которые управляют экспрессией LMO1 (dβh: LMO1 и dβh: mCherry) или MYCN (dβh: EGFP-MYCN) в клетках PSNS под контролем промотора dβh, были введены эмбрионам рыбок данио13.<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

В данной работе представлен метод разработки, характеристики и отслеживания в режиме реального времени метастазирования опухоли в модели нейробластомы рыбок данио, в частности в трансгенной линии рыбок данио с гиперэкспрессией MYCN и LMO1, которая развивает метастазирование спонтанно.

Модель метастазов нейробластомы рыбок данио

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Эти методы были использованы для разработки первой модели метастазирования нейробластомы рыбок данио. И продемонстрировать, что эта модель может точно повторить многие особенности метастазирования, наблюдаемые у пациентов с высоким риском развития нейробластомы. Основным преимуществом этой метастатической модели рыбок данио является визуализация диссеминации опухоли в режиме реального времени in vivo, чтобы лучше понять, когда и, возможно, как происходит метастазирование.Этот метод не является специфическим для нейробластомы. Он может быть применен к моделям рыбок данио различных видов рака, если опухолевые клетки могут быть идентифицированы и отслежены, что приводит к множеству возможностей. Для начала разработайте гетерозиготную трансгенную рыбью линию, чрезмерно экспрессирующую как MYCN, так и LMO1 путем скрещивания трансгенных линий MYCN и LMO1.В один день после оплодотворения используйте стереоскопический флуоресцентный микроскоп, чтобы отсортировать потомство ауткросса для экспрессии EGFP, которая представляет собой положительные точки EGFP. После сортировки изолируйте просоченные эмбрионы в отдельные чашки Петри и пометьте чашки как MYCN положительные или MYCN отрицательные. Визуализируйте и сортируйте эмбрионы обеих групп для экспрессии LMO1 через три-четыре дня после оплодотворения.Ищите красные флуоресцентные пятна как в верхнем шейном ганглии, так и в не-PSNS дофаминергических нейронных клетках, особенно в продолговатом мозге заднего мозга. Проведите скрининг до того, как эмбрионы достигнут пяти дней после оплодотворения. Затем выделите отсортированную рыбу на четыре группы различных генотипов и пометьте только MYCN, только LMO1, MYCN и LMO1 и дикий тип.Поднимайте их в одинаковых условиях по стандартным протоколам. Визуализируйте опухоли с помощью стереоскопического флуоресцентного микроскопа, осторожно переворачивая рыб металлическим шпателем с обеих боковых сторон, чтобы увидеть опухоль. После идентификации возможных опухоленосных рыб выделите их в отдельный резервуар с соответствующими метками, которые включают дату рождения, дату скрининга опухоли и генотип.Через шесть недель после оплодотворения повторите предыдущие шаги для скрининга на опухоленосных рыб и рыб, не неоносных, чтобы подтвердить наличие опухолей для ранее проверенных рыб или выявить новых возможных опухоленосных рыб. Ищите устойчивый или увеличенный размер флуоресцентной положительной массы и подтвержденных опухоленосных рыб. После выявления опухоленосных рыб два раза в неделю контролируйте их за доказательствами миграции опухолевых клеток, которая представляет собой крошечные EGFP или mCherry положительные опухолевые массы, удаленные от первичного места генеза опухоли.Выделите этих рыб в отдельные резервуары по мере необходимости и нанесите соответствующую маркировку, чтобы указать на возможные метастазы. После интерпретации гетерозиготного MYCN у рыб LMO1 и при сортировке их потомства экспрессия EGFP MYCN была заметна в дофаминергических нейрональных клетках без PSNS в один день после оплодотворения. Напротив, экспрессия LMO1 была заметна как в клетках PSNS, так и в не-PSNS дофаминергических нейрональных клетках.Флуоресцентные положительные опухолевые массы были обнаружены в тканях органов, удаленных от первичного участка опухоли у сложных трансгенных рыб с гиперэкспрессией как MYCN, так и LMO1, но не у трансгенных рыб с экспрессией только MYCN. Окрашивание H & E хирургических участков показывает, что первичная опухоль возникла из области межпочечной железы, эквивалента рыбки данио надпочечников человека, которая является наиболее распространенным местом первичного заболевания у пациентов с нейробластомой. Опухолевые массы, удаленные от межпочечной железы, были обнаружены в нескольких областях, включая дистальную часть почки, орбиту, жабры, селезенку и внутреннюю стенку предсердной камеры сердца.Подтверждена линия нейробластов PSNS опухолевых клеток при первичной опухоли и всех метастатических участках. Значительно увеличенные количества и увеличенная толщина окрашенных PSR коллагеновых волокон были обнаружены в опухолях MYCN LMO1 по сравнению с опухолями, экспрессирующими только MYCN. После использования этой процедуры может быть применен скрининг лекарств и тестирование новых методов лечения рака, что потенциально может привести к разработке альтернативных агентов для профилактики и лечения метастатического рака.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Мышиные Экспериментальная модель самобытного развития опухолевого и перитонеальный метастаз<em&gt; с помощью</em&gt; Ортотопическая Заражение клеток карциномы яичников

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

В Vivo модели для тестирования влияния гипоксии на метастазирование опухолей

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Хирургические процедуры и методология для модели доклинической мужи<em&gt; Де Ново</em&gt; Метастазы рака молочной железы

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Воротной вены для инъекций модель для изучения печени метастазирования рака молочной железы

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Бесклеточной и клеточных легких модель для изучения метастазов опухоли

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Микроманипуляции циркулирующей опухолевой клетки для молекулярного анализа вниз по течению и метастатического потенциального оценивания

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Использование компьютерного анализа изображений для улучшения количественной оценки метастазов легких в модели рака молочной железы 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

Модель сингенной ортотопической остеосаркомы Sprague Dawley Rat с ампутацией для контроля скорости метастазирования

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...