Name: zebrafish model of neuroblastoma metastasis
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden R01 CA240323 (S.Z.) hibesi ile desteklendi; Amerika Birleşik Devletleri Savunma Bakanlığı'ndan (DoD) W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) hibesi; V Kanser Araştırmaları Vakfı'ndan (S.Z.) V Scholar ödülü ve Mayo Biyomedikal Keşif Merkezi'nden (S.Z.) platform hibesi; ve Mayo Clinic Kanser Merkezi ve Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi'nden (S.Z.) destek almaktadır.

Zebra balığı ve hayvan bakımı/bakımı kullanılarak yapılan tüm araştırma yöntemleri Mayo Clinic'teki kurumsal yönergelere uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.
1. PSNS'de aşırı ifade ile LMO1 transgenik zebra balığı hattının geliştirilmesi için transgene yapılarının hazırlanması ve mikroenjeksiyonu
<ol><li>LMO1-pDONR221 giriş klonunu geliştirmek için, pcr kullanarak insan hücre hattından elde edilen cDNA'dan insan LMO1'in kodlama...

<ol>
	<li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li><li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+cancer+model.">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).</li><li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li><li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish.">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma.">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis.">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).</li><li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children's+oncology+group's+2013+blueprint+for+research:+neuroblastoma.">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li><li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+model+of+neuroblastoma:+differentiating+stroma-poor+tumors'+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage.">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li><li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma.">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li><li>Tolbert, V. P., Matthay, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+Clinical+and+biological+approach+to+risk+stratification+and+treatment.">Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).</li><li>Maris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuroblastoma.">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis.">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Tao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28B+regulates+transcription+and+potentiates+MYCN-induced+neuroblastoma+through+binding+to+ZNF143+at+target+gene+promotors.">LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).</li><li>Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+zebrafish+transgenesis+for+functional+genomic+analysis+of+candidate+cooperative+genes+in+tumor+pathogenesis.">Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+GAB2+in+neuroblastoma+pathogenesis+through+the+promotion+of+SHP2/MYCN+cooperation.">Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation.</a> Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).</li><li>Zimmerman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification.">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li><li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface.">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Wattrus, S. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+safe+harbor:+The+hematopoietic+stem+cell+niche+in+zebrafish.">Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish.</a> Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).</li><li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish.">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+Zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li><li>Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+staining+of+collagens+type+I,+II+and+III+by+Sirius+Red+and+polarization+microscopy.">Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.</a> Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).</li><li>Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirius+red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue.">Sirius red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).</li><li>Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cancer+in+zebrafish.">In vivo imaging of cancer in zebrafish.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).</li><li>Howe, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).</li><li>Yoganantharjah, P., Gibert, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+the+zebrafish+model+to+aid+in+drug+discovery+and+target+validation.">The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).</li><li>Ignatius, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells,+regional+tumor+heterogeneity,+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell+vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+with+orbital+metastasis:+ophthalmic+presentation+and+role+of+ophthalmologists.">Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists.</a> Eye. 20 (4), 466-470 (2006).</li><li>Papaioannou, G., McHugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+in+childhood:+review+and+radiological+findings.">Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings.</a> Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Amores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+hox+clusters+and+vertebrate+genome+evolution.">Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution.</a> Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).</li><li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map.">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li><li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins.">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li></ol>

Zebra balığı, son birkaç on yıldır, özellikle kanser araştırmalarında, bakım kolaylığı, sağlam üremesi ve in vivo görüntüleme için açık avantajları gibi bariz nedenlerden dolayı yaygın olarak kullanılmaktadır1,28. Zebra balığı modeli, büyük ölçekli genetik çalışmalar için sıçanlar ve fareler gibi memeli model organizmaları iyi tamamlayan dış döllenmeleri ve gelişimleri nedeniyle embriyonik olarak kolayca manip...

Zebra balığı, özellikle kanserde çeşitli araştırma alanlarına yaygın olarak kullanılmış ve uygulanmıştır. Bu model, sağlam üremesi, uygun maliyetli bakımı ve tümör büyümesi ve metastazının çok yönlü görselleştirilmesi gibi birçok avantaj sağlar- bunların hepsi zebra balığını tümöregenez ve metastazın hücresel ve moleküler bazlarını incelemek ve araştırmak için güçlü bir araç haline getirir. Büyük ölçekli genom haritalama, transgenez, genlerin aşırı ifade edilmesi veya nakavt edilmesi, hücre nakli ve kimyasal ekranlar için yeni teknikler zebra balığı modelinin gücünü son derece artırmıştır1. Son birkaç yıl içinde, lösemi, melanom, rabdomyosarkom ve hepatosellüler karsinom2,3,4,5 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli insan kanserlerinin tümörjenezi ve metastazını incelemek için birçok zebra balığı hattı geliştirilmiştir. Ek olarak, nöroblastom (NB) ilk zebra balığı modeli, dopamin-beta-hidroksilaz (dβh) promotörünün kontrolü altındaki periferik sempatik sinir sisteminde (PSNS) bir onkogen olan MYCN'nin aşırı ifade edilmesiyle üretildi. Bu model ile aktif ALK'nın tümör başlangıcını hızlandırmak ve in vivo6'daki tümör penetrance'ını artırmak için MYCN ile sinerjiye sahip olabileceği daha da gösterilmiştir.
NB, nöral kret hücrelerinin sympathoadrenal soyundan türetilmiştir ve çocuklarda oldukça metastatik bir kanserdir7. Pediatrik kansere bağlı ölümlerin %10'undan sorumludur8. Tanıda yaygın olarak metastaz yapılan NB, klinik olarak öncelikle sempatik gangliyon zinciri ve PSNS9,10'un adrenal medullası boyunca ortaya çıkan tümörler olarak sunulabilir. MYCN amplifikasyonu genellikle NB hastalarında kötü sonuçlarla ilişkilidir11,12. Ayrıca LMO1, yüksek riskli olgularda kritik NB duyarlılık geni olarak tanımlanmıştır13,14. Çalışmalar, zebra balığı modelinin PSNS'sinde MYCN ve LMO1'in transgenik koexpressasyonunun sadece NB'nin daha erken başlamasını teşvik etmekle kalmayıp, aynı zamanda yüksek riskli NB13 hastalarında yaygın olarak görülen bölgelere benzeyen doku ve organlara yaygın metastaz yaptığını buldu. Çok yakın zamanda, bir RNA bağlayıcı proteini kodlayan MYCN ve Lin28B'nin dβh promotörü16'nın kontrolü altında aşırı ifade edildiği daha yeni bir zebra balığı NB modelinde NB'nin başka bir metastatik fenotipi de gözlenmiştir.
Zebra balıklarındaki kararlı transgenik yaklaşım genellikle ilgi çekici bir genin aşırı ekspresyonunun normal gelişime ve hastalık patogenezine katkıda bulunup bulunamayacağını incelemek için kullanılır14,15. Bu teknik, NB tümörjenezis6,16,17,18,19,20'ye giden birden fazla gen ve yolun önemini göstermek için başarıyla kullanılmıştır. Bu makale, PSNS'de hem MYCN hem de LMO1'i aşırı ifade eden transgenik balık hattının nasıl oluşturulduğunu ve bu iki onkogenin işbirliğinin NB tümörjenezi ve metastaz13'ün başlangıcını nasıl hızlandırdığının nasıl gösterildiğini tanıtacaktır. İlk olarak, dβh promotörünün (mycn hattı olarak belirlenmiş) kontrolü altındaki EGFP-MYCN'yi aşırı ifade eden transgenik hat, dβh-EGFP-MYCN yapısı daha önce açıklandığı gibi vahşi tip (WT) AB embriyolarının tek hücreli aşamasına enjekte ederek geliştirilmiştir6,17. PSNS'de LMO1'i (LMO1 hattı olarak belirlenmiş) aşırı ifade eden ayrı bir transgenik hat, dβh-LMO1 ve dβh-mCherry olmak üzere iki DNA yapısı tek hücreli aşamada WT embriyolarına dönüştürülerek geliştirilmiştir13. Daha önce, sikkelenmiş çift DNA yapılarının balık genomuna kazınabileceği gösterilmiştir; bu nedenle, LMO1 ve mCherry transgenik hayvanların PSNS hücrelerinde birlikte ifade edilir. Enjekte edilen F0 embriyoları cinsel olgunluğa ulaştığında, transgene(ler) entegrasyonu ile pozitif balıkların tanımlanması için WT balıklarıyla aşıldılar. Kısaca, F1 yavruları ilk olarak PSNS hücrelerinde mCherry ekspresyolü için floresan mikroskopi ile tarandı. LMO1'in mCherry pozitif balıklara germline entegrasyonu genomik PCR ve dizileme ile daha da doğrulandı. Her transgenik hattın başarılı bir şekilde tanımlanmasından sonra, heterozipöz MYCN ve LMO1 transgenik balıklarının soyu, hem MYCN hem de LMO1'i ifade eden bileşik bir balık hattı oluşturmak için iç içe geçti (MYCN olarak belirlenmiştir; LMO1 hattı). Tümör taşıyan MYCN; LMO1 balıkları, birincil bölgeye uzak bölgelerde metastatik tümörlerin, interrenal bez bölgesinin (IRG, insan adrenal bezine eşdeğer zebra balığı eşdeğeri) kanıtı için iki haftada bir floresan mikroskopi ile izlendi 13. MYCN'deki tümörlerin metastazını doğrulamak için; LMO1 balıkları, histolojik ve immünohistokimyasal analizler uygulandı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific / Acros Organic</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose GP2</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>009012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Intense R Detection</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND primary antibody diluent</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND-MAX IHC instrument</td>
			<td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fully automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH211-270H11 BAC clone</td>
			<td>BACPAC resources center (BRFC)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope equipped with DP71 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801601</td>
			<td>ready-to-use (no preparation needed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>86-1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Roche Applied Science, IN</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>HHS-32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Avidin D</td>
			<td>Vector</td>
			<td>A-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>4360-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Teknova, Inc.</td>
			<td>K2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td>
			<td>554-13-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome for sectioning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p3E-polyA</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift 
			(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin wax</td>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>39603002</td>
			<td>Parrafin to parafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)</td>
			<td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONR 221 gateway donor vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12536-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDONRP4-P1R donor vector</td>
			<td>&#160;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a generous gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 0.5%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirrius red stain kit</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24901-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pME-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26028</td>
			<td>(DBH construct)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>21712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDO Rapid Decalcifier</td>
			<td>Apex Enginerring</td>
			<td>RDO04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP&#174;&#160;6 AI Vacuum Infiltration Processor</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: VIP-6-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical Incorporated</td>
			<td>20513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish model of neuroblastoma metastasis

Zebra balığı, başta kanser olmak üzere insan hastalıklarını incelemek için önemli bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmıştır. Zebra balığı modellemesinde uygulanan sağlam transgenik ve genom düzenleme teknolojilerinin yanı sıra, bakım kolaylığı, yüksek verimli üretkenlik ve güçlü canlı görüntüleme, zebra balığını metastaz ve bu sürecin altında bulunan hücresel ve moleküler temelleri vivo olarak incelemek için değerli bir model sistemi haline getirir. Metastazın ilk zebra balığı nöroblastom (NB) modeli, dopamin-beta-hidroksilyaz (dβh) promotörünün kontrolü altında iki onkogen, MYCN ve LMO1 aşırı ifade ederek geliştirilmiştir. Birlikte ifade edilen MYCN ve LMO1, nöroblastomagenezisin gecikmesinin azalmasına ve penetrancesinin artmasına ve tümör hücrelerinin uzak metastazlarının hızlanmasına yol açtı. Bu yeni model, klinik olarak ilgili ve metastazla ilişkili genetik değişikliklerin katılımı da dahil olmak üzere insan metastatik NB'nin birçok temel özelliklerini güvenilir bir şekilde yineler; metastaz in vivo doğal ve spontan gelişimi; ve metastaz sitelerini korumuş. Bu nedenle, zebra balığı modeli, tümör metastazının karmaşık sürecini in vivo olarak parçalamak için benzersiz avantajlara sahiptir.

LMO1'in NB patogenezini etkilemek için MYCN ile sinerji oluşturup oluşturmadığını belirlemek için, dβh promotörünün kontrolündeki PSNS hücrelerinde LMO1 (dβh:LMO1 ve dβh:mCherry) veya MYCN (dβh:EGFP-MYCN) ekspresyonunun yönlendirici transgenik yapıları zebra balığı embriyolarına enjekte edildi13. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, kararlı transgenik çizgilerin geliştirilm...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis at JoVE.com

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Bu makale, nöroblastom zebra balığı modelinde, özellikle kendiliğinden metastaz geliştiren MYCN ve LMO1'in aşırı ifade edilmesiyle transgenik zebra balığı hattında tümör metastazını gerçek zamanlı olarak geliştirme, karakterize etme ve izleme yöntemini tanıtır.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Bu yöntemler nöroblastom metastazının ilk zebra balığı modelini geliştirmek için kullanılmıştır. Ve bu modelin nöroblastom riski yüksek hastalarda görülen metastazın birçok özelliğine sadık bir şekilde yeniden sahip olabileceğini göstermek için. Bu metastatik zebra balığı modelinin ana avantajı, metastazın ne zaman ve muhtemelen nasıl oluştuğunu daha iyi anlamak için tümör yayılımının gerçek zamanlı in vivo görüntülemesidir.Bu teknik nöroblastom için özel değil. Tümör hücreleri tanımlanabildiği ve bir dizi olasılığa yol açan izlenebildiği sürece çeşitli kanser türlerinin zebra balığı modellerine uygulanabilir. Başlamak için, MYCN ve LMO1 transgenik çizgilerini melezleyerek hem MYCN hem de LMO1'i aşırı ifade eden heterozipöz transgenik bir balık hattı geliştirin.Döllenmeden sonra bir günde, EGFP pozitif noktaları olarak sunulan EGFP ekspresyasyonu için outcross soyunu sıralamak için stereoskopik bir floresan mikroskobu kullanın. Sıraladıktan sonra, taranmış embriyoları ayrı Petri kaplarına izole edin ve bulaşıkları MYCN pozitif veya MYCN negatif olarak etiketlendir. Döllenmeden üç ila dört gün sonra LMO1 ekspresyasyonu için her iki grubun embriyolarını görselleştirin ve sıralayın.Özellikle arka beynin oblongata medullasında hem üstün servikal ganglion hem de PSNS olmayan dopaminerjik nöronal hücrelerde kırmızı floresan lekeler arayın. Embriyolar döllenmeden beş gün sonrasına ulaşmadan önce taramayı gerçekleştirin. Daha sonra sıralanmış balıkları farklı genotiplerden oluşan dört gruba ayırın ve etiket yalnızca MYCN, yalnızca LMO1, MYCN ve LMO1 hem de vahşi tip olarak etiketlendirilir.Standart protokollere göre aynı koşullarda yükseltin. Tümörü görüntülemek için her iki yan tarafında metal bir spatula ile balıkları hafifçe çevirerek stereoskopik floresan mikroskopla tümörleri görselleştirin. Olası tümör taşıyan balıkların tanımlanmasından sonra, onları doğum tarihini, tümörün tarandığı tarihi ve genotipi içeren uygun etiketlerle ayrı bir tankta izole edin.Döllenmeden altı hafta sonra, daha önce taranmış balıklar için tümörlerin varlığını doğrulamak veya yeni olası tümör taşıyan balıkları tanımlamak için tümör taşıyan balıkları ve tümör olmayan balıkları taramak için önceki adımları tekrarlayın. Floresan pozitif kütlenin ve onaylanmış tümör taşıyan balıkların sürekli veya artan boyutunu arayın. Tümör taşıyan balıkları tanımladıktan sonra, tümör genesis birincil bölgesinden uzakta küçük EGFP veya mCherry pozitif tümör kitleleri olarak ortaya çıkan tümör hücre göçü kanıtı için onları iki haftada bir izleyin.Bu balıkları gerektiğinde ayrı tanklara izole edin ve olası metastazları belirtmek için uygun şekilde etiketlenin. LMO1 balıklarında heterozipöz MYCN'yi yorumladıktan ve soylarını sıralarken, EGFP MYCN ekspresyumu, Döllenme sonrası bir günde PSNS olmayan dopaminerjik nöronal hücrelerde belirgindi. Buna karşılık, LMO1 ekspresyolü hem PSNS hücrelerinde hem de PSNS olmayan dopaminerjik nöronal hücrelerde belirgindi.Organlardaki dokularda floresan pozitif tümör kitleleri, bileşik transgenik balıklarda primer tümör bölgesinden uzak, hem MYCN hem de LMO1'in aşırı ekspresyonu ile tespit edildi, ancak sadece MYCN ekspresyonu ile transgenik balıklarda saptanmamıştır. Cerrahi bölümlerin H&E lekesi, primer tümörün nöroblastom hastasında primer hastalığın en yaygın yeri olan insan böbrek üstü bezinin zebra balığı eşdeğeri olan interrenal bez bölgesinden ortaya çıktığını göstermektedir. Böbrekler arası bezden uzak tümör kitleleri, böbreğin distal kısmı, yörüngesi, solungaç, dalak ve kalbin atriyal odasının iç duvarı dahil olmak üzere birden fazla bölgede tespit edildi.Primer tümördeki tümör hücrelerinin PSNS nöroblast soyu ve tüm metastatik bölgeler doğrulandı. MYCN LMO1 tümörlerinde sadece MYCN'yi ifade eden tümörlere kıyasla önemli ölçüde artmış miktarlar ve PSR lekeli kollajen liflerinin kalınlığında artış saptanmıştır. Bu prosedürden sonra, metastatik kanserleri önlemek ve tedavi etmek için alternatif ajanların geliştirilmesine yol açabilecek yeni kanser tedavileri ilaç taraması ve test edilebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Orijinal Tümör Geliştirme Murin Deneysel Modeli ve Periton Metastaz<em&gt; yoluyla</emYumurtalık Kanseri Hücreleri ile&gt; Ortotopik aşılama

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Nicelleştirilmesini Geliştirmek Için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

Metastaz Oranını Kontrol Etmek için Amputasyonlu Syngeneic Ortotopik Osteosarkom Sprague Dawley Sıçan Modeli

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...