Name: microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

North Carolina State University, Department of Entomology and Plant Pathology, maakt deel uit van een team dat DARPA's Insect Allies Program ondersteunt. De standpunten, meningen en/of bevindingen zijn die van de auteurs en mogen niet worden geïnterpreteerd als vertegenwoordigers van de officiële standpunten of het beleid van het ministerie van Defensie of de Amerikaanse overheid. De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben. MDL, DR en AEW bedachten het project en zorgden voor financieringsacquisitie, projectadministratie en middelen. FC, WK, NG en MDL bedachten en ontwierpen de micro-injectie-experimenten; OH bedacht en ontwierp de eierlegmethode. FC en WK voerden de experimenten uit; FC en WK analyseerden de resultaten; en FC, WK, NG en MDL schreven het manuscript. De auteurs willen Kyle Sozanski en Victoria Barnett speciaal bedanken voor hun hulp bij het in stand houden van P. maidis kolonies.

1. Opfok op kolonieniveau van P . maidis volwassenen
<ol><li>Plant minimaal vier potten maïs per week per opfokkooi, met 3-4 zaden per pot. Groei in een insectenvrije omgeving.</li>
	<li>Wanneer planten ~ 5 weken oud zijn, plaats ze dan in een kooi van 30 cm x 30 cm x 60 cm.</li>
	<li>Verkrijg een voldoende hoeveelheid P. maidis-volwassenen (~ 500) uit een onderzoekslaboratorium of in het wild en plaats in een insectenbestendige kooi met 9-12 maïsplanten (3-4 potten).</li>
	<li>Houd de kolonie in een ininsectenkweekincubator op 25 °C (± 1 °C), met een luchtvochtigheid van ten minste 70% en een lichtcyclus van 14:10.</li>
	<li>Om een leeftijdsgekalibreerde kolonie te genereren, verwijdert u alle initiële volwassenen na vier dagen eieren leggen en laat u de embryo's die in de kooi zijn gelegd op natuurlijke wijze uitkomen en verouderen.</li>
	<li>Verplaats 5 weken oude P. maidis-insecten (volwassenen) naar verse maïsplanten voor wekelijkse subcultuur door te verzamelen met een aspirator (figuur 1). Laat de volwassenen vervolgens los in een schone kooi met verse maïsplanten. Om een constante aanvoer van jonge volwassenen voor experimentele doeleinden te behouden, bereidt u elke week verse leeftijdsgekalibreerde kooien voor.</li>
	<li>Geef de potten in de kooien twee keer per dag water. Knip regelmatig stengels, verwijder rottend plantmateriaal en vervang het indien nodig door verse maïspotten. OPMERKING: Met goed onderhoud kan een kolonie ~ 5 weken duren (d.w.z. lang genoeg voor embryo's die in de kooi worden gelegd om volwassen te worden).</li>
</ol>2. Eierlegkamer op basis van agarose
<ol><li>Maak eierverzamelschalen (ovipositiemedium) door 1% w/v agarose in water in schone petrischaaltjes van 100 mm x 15 mm te gieten. Bewaar het ovipositiemedium bij 4 °C nadat het is gestold.</li>
	<li>Bereid 10% w / v sucrose-oplossing voor het voeden van de volwassenen. Bewaar de sucrose-oplossing bij -20 °C gedurende maximaal een maand.</li>
	<li>Maak een kamer om de volwassenen vast te houden door een gat in de bodem van een beker van 1 oz te snijden (zie de materiaaltabel) en een scherm over het gat te lijmen voor luchtuitwisseling (figuur 2).</li>
	<li>Snijd plastic paraffine wax film in 5 cm x 5 cm vierkanten; Zet 2 vierkanten opzij voor elk kopje.</li>
	<li>Verzamel ~ 15 1 week oude volwassen vrouwtjes uit een leeftijdsgekalibreerde P. maidis-kolonie. Om vrouwtjes te selecteren, onderzoekt u de ventrale kant van de buik en zoekt u naar de legboor, die meestal donkerder is dan de rest van de buik (figuur 3). Houd volwassenen maximaal een uur in een conische injectieflacon van 15 ml als u meerdere eierlegkamers opzet. Koel de insecten kort op ijs voorafgaand aan het seksen en breng ze over naar de volwassen container. OPMERKING: Dit onderzoek kan zonder microscoop worden uitgevoerd. Volwassen vrouwtjes die tijd hebben gehad om te voeden en te paren, hebben meestal ook grotere buiken dan volwassen mannetjes en zijn volgzamer; daarom kunnen ze gemakkelijker worden geselecteerd uit een kooipopulatie.</li>
	<li>Breng de vrouwtjes over in een volwassen container en sluit de beker af met 1 laag plastic paraffinewasfilm door deze gelijkmatig 3-4 keer de oorspronkelijke grootte uit te rekken (figuur 4A, B).</li>
	<li>Breng 400 μL 10% m/v sucrose-oplossing aan op de bovenkant van de plastic paraffinewasfilmafdichting en voeg een tweede laag plastic paraffinewasfilm toe, waarbij de plastic paraffinewasfilm precies zoals hierboven wordt uitgerekt (figuur 4C, D). OPMERKING: De sandwich van uitgerekte plastic paraffinewasfilm zet de sucrose-oplossing onder druk, wat erg belangrijk is voor volwassen voeding, maar zal niet voorkomen dat vrouwtjes hun legboor helemaal doorboren in het ovipositiemedium.</li>
	<li>Plaats de volwassen kamer op een eieropvangschaal met de plastic paraffinefilmzijde direct op het ovipositiemedium en wikkel de hele eierlegkamer met plasticfolie zonder de luchtgaten te bedekken, omdat deze nodig zijn voor luchtuitwisseling (figuur 5).</li>
	<li>Incubeer elke eierlegkamer bij 25 °C met 70% vochtigheid en een lichtcyclus van 14:10.</li>
	<li>Vervang dagelijks de sandwich van plastic paraffinewasfilm en 10% w / v sucrose-oplossing en verwijder al het water dat zich in de beker ophoopt.</li>
</ol>3. Embryoverzameling en uitlijning in een omgeving met een hoge luchtvochtigheid
<ol><li>Installeer een micromicroscoopgebaseerd microinjectiesysteem in een bevochtigde ruimte of kap (bevochtigde kap; Figuur 6) om ervoor te zorgen dat de werkomgeving ten minste 70% vochtigheid bereikt tijdens het micro-injectieproces.</li>
	<li>Controleer het ovipositiemedium op eieren na de gewenste legperiode. Doe dit in een bevochtigde kap of een andere vochtige omgeving. OPMERKING: De legperiode die meestal wordt gebruikt, was 's nachts, van 18.00 tot 10.00 uur, en duurde ~ 16 uur.</li>
	<li>Als er eieren in de agarose worden gelegd, gebruik dan een fijne tang om ze voorzichtig uit te graven en plaats ze op het oppervlak van de agarose om ze vochtig te houden (figuur 7A).</li>
	<li>Breng een strook van 1 mm x 15 mm dubbelzijdige tape aan op een coverslip van 22 mm x 30 mm (figuur 7B). Plaats de afdekslip met de tapezijde naar boven op het ovipositiemedium (figuur 7C).</li>
	<li>Pak elk afzonderlijk ei van het agaroppervlak en ga met een fijne borstel naar de dubbelzijdige tape. Verwijder alle eieren die volledig wit zijn of een zwarte kleur hebben. Gezonde eieren zullen de semi-transparante zijn.</li>
	<li>Leg de banaanvormige eieren op hun kant, waarbij het grotere uiteinde op de dubbelzijdige tape is geplakt (figuur 7D). OPMERKING: Bewaar de eieren altijd in een omgeving met een hoge luchtvochtigheid, zoals een petrischaal gegoten met een laag van 1% agar op de bodem.</li>
</ol>4. Bereiding van CRISPR-reagentia en injectienaalden
<ol><li>Trek kwartsnaalden met behulp van een Flaming/Brown type micropipette puller.</li>
	<li>Schuine de kwartsnaalden af met een micropipetafschuinder.</li>
	<li>Gebruik dubbelzijdig plakband om getrokken naalden vast te zetten in een doorzichtige container, zoals een petrischaaltje, totdat ze klaar zijn voor gebruik.</li>
	<li>Bereid de injectieoplossing door 0,5 μl Cas9-eiwit (5 μg/μl stockoplossing) en 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl stockoplossing; zie de materiaaltabel) te combineren met 1 μl fenolrode buffer in een eindvolume van 5 μl. Om deeltjes neer te slaan die de naald kunnen verstoppen, vortex de oplossing kort en centrifugeer gedurende 3 minuten op maximale snelheid.</li>
	<li>Vul de injectienaald op en zorg ervoor dat het injectiemengsel in de buurt van het taps toelopende uiteinde van de naald blijft. Verwijder eventuele bubbels uit de punt van de naald.</li>
	<li>Plaats de teruggevulde naald voorzichtig in de naaldhouder en draai de roestvrijstalen kraag vast om de naald stevig op zijn plaats te houden tijdens micro-injectie.</li>
	<li>Genereer een betrouwbare stroom injectieoplossing uit de naald door de afgeschuinde punt voorzichtig te strelen met een fijne, bevochtigde verfkwast, terwijl u met het injectiesysteem uitbarstingen van luchtdruk aan de naald geeft. OPMERKING: De naald is klaar voor injectie wanneer het injectiemengsel de punt in kleine hoeveelheden kan verlaten.</li>
</ol>5. Microinjectie en zorg na injectie
<ol><li>Bereid een microinjectieplatform door een schone petrischaal van 100 mm x 15 mm te vullen met 1% agar om een vlakke laag agar te vormen die gelijk is met de bovenkant van de schaal.</li>
	<li>Plaats een eerder geprepareerde coverslip met ~25 embryo's op het agarplatform (figuur 8A). OPMERKING: Alle injectiestappen moeten worden uitgevoerd in een bevochtigde kap (~ 70% vochtigheid).</li>
	<li>Controleer de injectiedruk door de naaldpunt in een druppel water te plaatsen en de injectiecyclus te starten. OPMERKING: Een kleine hoeveelheid injectieoplossing moet in het water worden verspreid als de drukinstelling correct is (figuur 8B).</li>
	<li>Steek de naald in het grotere uiteinde van het embryo en nader vanaf de linkerkant van de dekplaat (figuur 8C). Breng de injectie-oplossing in het ei en trek de naald er snel uit.</li>
	<li>Nadat alle eieren zijn geïnjecteerd, plaatst u de dekplaat op het oppervlak van een nieuwe 1% agarschaal en brengt u de schaal over naar een vochtigheidskamer (figuur 9).</li>
</ol>6. Broeden en uitkomen van embryo's
<ol><li>Zet de broedkamer gedurende 6 dagen in een broedmachine van 25 °C.</li>
	<li>Breng eventuele overlevende embryo's met schoon water en een fijne borstel over in een petrischaal van 35 mm x 10 mm met met water bevochtigd filterpapier dat de bodem van de schaal bedekt. Sluit de petrischaal af met plastic paraffinewasfilm en houd deze op 25 °C om de embryo's uit te laten komen. Begin met het controleren van de embryo's 6 dagen na de injectie op overleving. OPMERKING: De eerste instar nimfen beginnen rond dag 8 uit te komen.</li>
	<li>Breng nimfen met een fijne kwast over op een petrischaaltje met bladknipsels. Bedek de schaal en sluit af met plastic paraffinewasfilm.</li>
	<li>Incubeer de verzegelde schaal met jongen op bladstekken gedurende 48 uur bij 25 °C.</li>
	<li>Breng alle 2 dagen oude nimfen over van een injectieronde naar een opfokkooi met maïsplanten met behulp van een fijne borstel. Als injectees met zichtbaar fenotype in voldoende aantallen worden teruggevonden, kweek ze dan afzonderlijk om het herstel van de doeleigenschap in de volgende generatie te maximaliseren. Voer anders massaal paring uit van alle injectees. OPMERKING: Plaats de jongen voorzichtig in de krans van de maïsplant om beschutting te bieden en te zorgen voor een goede luchtvochtigheid van hun directe omgeving.</li>
	<li>Kweek de insecten in de hierboven beschreven omstandigheden en zorg voor de juiste temperatuur, vochtigheid en regelmatige overdrachten naar verse maïsplanten.</li>
	<li>Screen nakomelingen op verwachte fenotypen. Plaats individuen die het gewenste fenotype vertonen in hun eigen kooi om homozygote lijnen vast te stellen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Namba, R., Higa, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+studies+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+in+Hawaii.">Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii.</a> Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).</li><li>Singh, B. U., Seetharama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+interactions+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+Ashm.(Homoptera:+Delphacidae)+in+maize+and+sorghum+agroecosystems.">Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems.</a> Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).</li><li>Tsai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+a+corn+disease+in+Florida+transmitted+by+Peregrinus+maidis.">Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis.</a> Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).</li><li>Chelliah, S., Basheer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+studies+of+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+(Araeopidae:+Homoptera)+on+sorghum.">Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum.</a> Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).</li><li>Lastra, J., Esparza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+vesicular+stomatitis+virus+in+the+leafhopper+Peregrinus+maidis+(Ashm.),+a+vector+of+a+plant+rhabdovirus.">Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus.</a> Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).</li><li>Nault, L. R., Ammar, E. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leafhopper+and+planthopper+transmission+of+plant+viruses.">Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).</li><li>Ammar, E. -. D., Tsai, C. -. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+acquisition+and+titer+of+Maize+mosaic+rhabdovirus+in+its+vector,+Peregrinus+maidis+(Hemiptera:+Delphacidae).">Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae).</a> Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).</li><li>Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+residual+effects+of+seven+insecticides+on+Dalbulus+maidis+(Homoptera:+Cicadellidae)+and+Peregrinus+maidis+(Homoptera:+Delphacidae).">Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae).</a> Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).</li><li>Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+RNAi+methods+for+Peregrinus+maidis,+the+corn+planthopper.">Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper.</a> PloS One. 8 (8), 70243 (2013).</li><li>Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technology:+concerning+RNA-guided+gene+drives+for+the+alteration+of+wild+populations.">Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations.</a> Elife. 3, 03401 (2014).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+maize+mosaic+virus+to+planthopper+vectors+by+microinjection+increases+infection+efficiency+and+facilitates+functional+genomics+experiments+in+the+vector.">Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector.</a> Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).</li><li>Kimelman, D., Martin, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+patterning+in+early+development:+three+strategies.">Anterior-posterior patterning in early development: three strategies.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).</li><li>Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+insect+development:+to+the+hemimetabolous+paradigm.">Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 20 (4), 355-361 (2010).</li><li>Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCs+of+eye+color+in+Tribolium+castaneum:+orthologs+of+the+Drosophila+white,+scarlet,+and+brown+Genes.">The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes.</a> Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).</li><li>Xue, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+knockout+of+two+eye+pigmentation+genes+in+the+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(Hemiptera:+Delphacidae).">CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase.">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).</li><li>Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera,+embryos+for+germline+transformation,+or+CRISPR/Cas9+genome+editing.">Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).</li><li>Brent, C. S., Hull, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+eye+coloration+genes+in+the+western+tarnished+plant+bug+(Lygus+hesperus+Knight).">RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).</li><li>Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ABCs+of+eye+color+in+Helicoverpa+armigera+with+CRISPR/Cas9-induced+mutations.">Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas+systems+in+genome+editing:+methodologies+and+tools+for+sgRNA+design,+off-target+evaluation,+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects.">CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Eierlegkwaliteit en voeding Onlangs verkregen onderzoekers die werkten met een verwante soort, Nilaparvata lugens, de eieren die ze gebruikten voor micro-injecties rechtstreeks van het blad, waarbij de geïnjecteerde eieren in het bladweefsel bleven totdat ze uitkwamen17. Hoewel deze op bladeren gebaseerde methode een meer natuurlijke omgeving bood voor embryonale ontwikkeling, verhoogde het ook de kans op infecties en op eischade tijdens het verwijderingsproces. Het kunstmatige ovipositiesysteem dat hier wordt gepresenteerd, zorgt voor een meer uniforme omgeving en vermindert de kans op schade aan de eieren door hantering. Door de ovipositiebekers op vrijdag op te zetten, werd het grootste deel van de oviposited eieren verzameld tijdens een typische werkweek, ten voordele van degenen die het micro-injectiewerk deden. Een voorbehoud bij deze methode is echter dat het gebrek aan voedingsstoffen in het 10% sucrose-oplossingsdieet uiteindelijk de gezondheid van de insecten zal beïnvloeden, en vrouwtjes in de kopjes beginnen meestal al na 10 dagen af te sterven. De eikwaliteit begint ook na 6 dagen af te nemen, zoals blijkt uit een toename van dode of ongezond uitziende eieren. Als gevolg hiervan is het belangrijk om selectief te zijn van de eieren die worden gebruikt voor micro-injecties en om de vrouwtjes niet na dag 6 te houden.
Overlevingskans en luchtvochtigheid Twee factoren lijken van cruciaal belang te zijn voor de embryonale overleving door het micro-injectieproces. Het meest uitdagende aspect van het hanteren van P. maidis-embryo's is voorkomen dat ze uitdrogen na verwijdering uit het ovipositiemedium en tijdens micro-injectie . Omdat de eieren meestal in plantenweefsel worden gelegd, missen ze een adequate schaal om uitdroging te voorkomen. Zelfs in de bevochtigde kap gingen hele sets eieren verloren door uitdroging. Een te hoge luchtvochtigheid kan echter ook van invloed zijn op de micro-injecties als water zich ophoopt op de dubbelzijdige tape of op de scope. Helaas was uitdroging van eieren meestal niet gemakkelijk op te merken tijdens het micro-injectieproces en ze leken vaak normaal tot 2 of 3 dagen later, toen ze volledig transparant werden en geen tekenen van ontwikkeling vertoonden.
Ook de kwaliteit van de naald blijkt een belangrijke rol te spelen bij de overleving. De naald moet worden afgeschuind om onnodige schade aan het ei te minimaliseren. Wanneer de naald is geblokkeerd, met behulp van de opruimfunctie op de injector terwijl u de punt van de naald voorzichtig streelt met een bevochtigde verfkwast (zie stap 4.7), wordt de naald meestal teruggebracht naar een functionele toestand. Hoe dan ook, het wordt aanbevolen om slechts kleine hoeveelheden injectie-oplossing (~ 0,25 μL) in elke naald te doen en om de paar dia's (~ 50-60 eieren) over te schakelen naar een nieuwe naald om ervoor te zorgen dat de naaldkwaliteit gedurende het injectieproces wordt gehandhaafd.
Succesvolle generatie van een knock-out fenotype Om de geslachtscellen met succes te transformeren, moeten embryo-micro-injecties meestal zo vroeg mogelijk vóór de cellularisatie worden uitgevoerd. Afhankelijk van de insectensoort varieert het tijdvenster voor het voltooien van de micro-injecties van slechts een paar uur tot zo lang als een volledige dag14,15,20. Het is nog onduidelijk wanneer P. maidis embryo's cellularisatie ondergaan. Cas9-gemedieerde knock-out werd getest op embryo's zo jong als 4 uur na het leggen van eieren (pel) tot maar liefst 16 uur pel, en de verwachte fenotypes werden waargenomen in alle experimenten, wat suggereert dat alle micro-injecties werden uitgevoerd binnen het precellurisatievenster.
De P. maidis ortholoog van het oogkleurgen, wit, werd geselecteerd omdat het knock-out fenotype naar verwachting gemakkelijk te screenen zou zijn bij injectees vanwege zijn cel-autonome aard. Inderdaad, zoals verwacht, waren zowel mozaïek als totale knock-outs duidelijk identificeerbaar bij embryo's die het injectiemengsel met Cas9 en gids-RNA's ontvingen. Helaas kwamen er geen injectees met volledige knock-out uit en een massale paring van overlevende injectees slaagde er niet in om witogige nakomelingen te genereren. Een mutantenlijn werd later echter met succes gegenereerd door zich te richten op een ander gen (Klobasa et al., in uitvoering). Dit zou suggereren dat het falen om een witte mutantlijn vast te stellen hoogstwaarschijnlijk te wijten is aan off-target effecten (d.w.z. Cas9 die belangrijke regio's elders in het genoom snijdt) die een nauw verbonden dodelijke mutatie genereren, of aan een onvoorspelbare kritische rol voor wit in P. maidis.
Fenotypische en moleculaire gegevens (figuur 8 en figuur 9) bevestigen dat een significante knock-out in de witte locus werd gecreëerd in een monster van geïnjecteerde embryo's, wat zou resulteren in totaal verlies van genfunctie. Bovendien, hoewel mutaties in wit levensvatbaar zijn bij sommige soorten, is er een precedent voor verminderde witte activiteit die schadelijk is21,22. Dat gezegd hebbende, off-target effecten kunnen niet volledig worden uitgesloten. Het voorspellen van waarschijnlijke off-targets vereist nauwkeurige genoomsequentiegegevens23, wat de huidige toestand van genomische bronnen in P. maidis op dit moment onmogelijk maakt. Hoe dan ook, met deze nieuwe methoden kan het testen van andere doelgenen vol vertrouwen worden gedaan, zelfs in de richting van meer traditionele transgenese in een poging om nieuwe genetische hulpmiddelen naar deze verderfelijke plaag te brengen.

De maïsplanthopper, Peregrinus maidis, is een economisch belangrijke plaag van maïs 1,2,3. Ze veroorzaken directe fysieke schade aan de plant, zowel tijdens het voeden met hun piercing-zuigende monddelen, als tijdens de voortplanting wanneer ze hun embryo's rechtstreeks in plantenweefsel leggen 2,4. Ondanks de vele routes van directe schade aan gewassen, is de grootste impact die deze insecten hebben op de gezondheid van gewassen indirect, door op te treden als de vector van maïsmozaïekvirus (MMV) en maïsstreepvirus 5,6. MMV is in staat om zich te vermenigvuldigen in het lichaam van zijn P. maidis-vector, waardoor het virus gedurende hun hele leven in individuele insecten kan blijven bestaan, zodat ze het virus kunnen blijven verspreiden naar nieuwe waardplanten 7,8. De meest voorkomende methoden voor het bestrijden van P. maidis, en dus de virussen die het vectort, zijn insecticiden.
Helaas heeft wanbeheer van deze producten geleid tot de ontwikkeling van resistentie in het doelplaagorganisme en tot vervuiling van het milieu9. Daarom zijn nieuwe strategieën nodig om gewasverliezen door deze combinatie van insecten en virussen te verminderen. Eerder werk toonde aan dat RNA-interferentie (RNAi) een effectieve controlemethode zou kunnen zijn voor P. maidis omdat ze gevoelig zijn voor downregulatie in genexpressie, zelfs bij inname van dubbelstrengs RNA (dsRNA)10. De meest effectieve manier om dsRNA in het veld toe te dienen, is echter via de planten waarmee de insecten zich voeden; Vandaar dat gewassen nog steeds vatbaar kunnen zijn voor virussen die de insecten al bij zich dragen. Met de komst van CRISPR / Cas9-genoombewerking zijn nieuwe ongediertebestrijdingsstrategieën mogelijk, waaronder Cas9-gebaseerde gene drive11,12, die kan worden gebruikt om de grootte van een plaagpopulatie te verkleinen, of om die populatie te vervangen door individuen die resistent zijn tegen de virussen die ze vectoren.
De ontwikkeling en inzet van elk type gen-aandrijfsysteem vereist echter de ontwikkeling van transgene technieken. Dergelijke methoden waren niet nodig voor het uitvoeren van RNAi-experimenten bij P. maidis omdat dsRNA's en/of siRNA's verondersteld worden celmembranen te kunnen passeren vanwege de efficiëntie van RNAi in P. maidis10,13. Dit geldt niet voor de DNA's en/of eiwitten die worden gebruikt in traditionele transgenese of in Cas9-gebaseerde genbewerking, die beide een voorloper zouden zijn van het creëren van insecten die een gene drive dragen. Om genbewerking of andere vormen van kiembaantransformatie te bereiken, worden deze DNA's en eiwitten idealiter micro-geïnjecteerd in embryo's tijdens het syncytiele blastodermstadium, voorafgaand aan wanneer het insectenembryo cellulariseert. Timing is van cruciaal belang, omdat de syncytiele fase het vroegste deel van de ontwikkeling is14,15. Omdat P. maidis-vrouwtjes hun eieren bij voorkeur in plantenweefsel leggen, kan het extraheren van voldoende hoeveelheden precellulaire embryo's voor micro-injecties arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Daarom werden nieuwe technieken ontwikkeld om P. maidis-embryo's snel te verzamelen en te micro-injecteren voorafgaand aan cellularisatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 oz Containers</td>
			<td>Dart</td>
			<td>P100N</td>
			<td>Adult container for egg-laying setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-103</td>
			<td>Serves as collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-106</td>
			<td>For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>For handling planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspirator</td>
			<td>Fischer Technical</td>
			<td>LAV-3</td>
			<td>Vacuum for aspirating larger numbers of insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Spectrum LED Lights</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>GLP24FS/19W/LED</td>
			<td>Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>A36498</td>
			<td>Endonuclease for cutting planthopper genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Vinyl Tubing</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.</td>
			<td>Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn planthoppers</td>
			<td>North Carolina State University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Dr. Anna Whitfield&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch Double Sided Tape</td>
			<td>NA</td>
			<td>Holding eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early Sunglow corn</td>
			<td>Park Seed Company</td>
			<td>05093-PK-N</td>
			<td>Corn for rearing planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epTIPS Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjection System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td>Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Drosophila Agar</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>66-103</td>
			<td>Substrate for everything except egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4731</td>
			<td>Egg handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose LE Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-102</td>
			<td>Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifyer</td>
			<td>Homedics</td>
			<td>UHE-CM45</td>
			<td>For providing humidity in humidified hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>For holding injected embryos until hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing cages</td>
			<td>Bioquip (special order)</td>
			<td>Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)</td>
			<td>Cage for planthoppers on corn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Planthopper screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12-5</td>
			<td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td>For positioning microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td>For beveling injection needles / Used &#39;fine&#39; graded plate at 20&#176; angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>GT100 X-Y Gliding Table</td>
			<td>For positioning and moving embryos under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Paint Brush</td>
			<td>Testor #2 8733</td>
			<td>Sold in 3 pack 281206</td>
			<td>Fine paintbrushes for embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI-7</td>
			<td>For holding the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I41VLH3C8</td>
			<td>Rearing injectees until hatch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy Vector System I cloning kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>Cloning Pm white target site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides or coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-549-3</td>
			<td>Hold eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4200</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Glad ClingWrap Plastic Wrap</td>
			<td>NA</td>
			<td>Wrap the entire egg-laying chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>QF100-50-10</td>
			<td>For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen (White Organza Fabric)</td>
			<td>Joann Fabrics</td>
			<td>16023889</td>
			<td>For covering the adult container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>To make 10% sucorose solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing

De maïsplanthopper, Peregrinus maidis, is een plaag van maïs en een vector van verschillende maïsvirussen. Eerder gepubliceerde methoden beschrijven de triggering van RNA-interferentie (RNAi) in P. maidis door micro-injectie van dubbelstrengs RNA's (dsRNA's) in nimfen en volwassenen. Ondanks de kracht van RNAi zijn fenotypes die via deze techniek worden gegenereerd van voorbijgaande aard en missen ze langdurige Mendeliaanse overerving. Daarom moet de gereedschapskist van P. maidis worden uitgebreid met functionele genomische hulpmiddelen die de productie van stabiele mutante stammen mogelijk maken, waardoor de deur wordt geopend voor onderzoekers om nieuwe bestrijdingsmethoden in te zetten tegen deze economisch belangrijke plaag. In tegenstelling tot de dsRNA's die voor RNAi worden gebruikt, passeren de componenten die worden gebruikt in CRISPR / Cas9-gebaseerde genoombewerking en kiembaantransformatie echter niet gemakkelijk celmembranen. Als gevolg hiervan moeten plasmide-DNA's, RNA's en / of eiwitten in embryo's worden geïnjecteerd voordat het embryo cellulariseert, waardoor de timing van de injectie een kritieke factor voor succes is. Daartoe werd een op agarose gebaseerde legmethode ontwikkeld om embryo's van P. maidis-vrouwtjes met relatief korte tussenpozen te kunnen oogsten. Hierin worden gedetailleerde protocollen verstrekt voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire P. maidis-embryo's met CRISPR-componenten (Cas9-nuclease dat is gecomplexeerd met gids-RNA's), en resultaten van Cas9-gebaseerde gen knock-out van een P. maidis oogkleurgen, wit, worden gepresenteerd. Hoewel deze protocollen CRISPR/Cas9-genoombewerking in P. maidis beschrijven, kunnen ze ook worden gebruikt voor het produceren van transgene P. maidis via kiembaantransformatie door simpelweg de samenstelling van de injectie-oplossing te veranderen.

De legkamer voor eieren is speciaal ontworpen om P. maidis-vrouwtjes in staat te stellen zich te voeden terwijl ze in een beschermend medium zitten waaruit hun eieren gemakkelijk kunnen worden teruggewonnen. Met behulp van deze methode werden voldoende hoeveelheden precellulaire embryo's teruggevonden voor micro-injectie met DNA, RNA en/of eiwitten. Volwassen P. maidis-vrouwtjes leggen meestal eieren in het bladweefsel van de maïsplanten, waardoor het een uitdaging is om in korte tijd voldoende eieren te krijgen, omdat het veel bladdissectie vereist. De kunstmatige eierlegomgeving biedt een oplossing om deze problemen te overwinnen. Zoals te zien is in tabel 1, werden in 4 weken tijd 6.483 eieren verzameld van in totaal 645 vrouwtjes. Vrouwtjes beginnen meestal met het leggen van eieren na dag 2 en leveren de meeste eieren van dag 4 tot dag 6. De ovipositieactiviteit vertraagde op dag 9. Elke ovipositiekamer werd op vrijdag opgezet en van zondag tot de volgende zondag gecontroleerd op eieren. Volgens dit schema konden de meeste eieren worden verzameld voor micro-injecties tijdens de werkweek.
De eerste praktische toepassing van dit eilegsysteem was het testen van de werkzaamheid van Cas9-gemedieerde gen knock-out, met behulp van de P. maidis ortholoog van het oogkleurgen, wit (Pmw), als doelwit. Van mutaties in wit is bekend dat ze leiden tot aanzienlijk verlies van oogpigmentatie bij andere insectensoorten, en wit is celautonoom, waardoor mutaties kunnen worden gedetecteerd bij geïnjecteerde individuen16,17. Om de kans te vergroten dat zelfs een kleine mutatie kan leiden tot functieverlies, werden gids-RNA's ontworpen om binnen het gebied van de ATP-bindende cassette te snijden, wat nodig is voor witte functie16. P. maidis-embryo's werden geïnjecteerd met ofwel 20% fenolrood (injectiebuffer), injectiebuffer met Cas9 in een eindconcentratie van 800 ng / μL (Cas9-controle), of Cas9 in injectiebuffer samen met drie gids-RNA's toegevoegd in een concentratie van elk 400 ng / μL. De combinatie van drie geleiders binnen één injectiemix was bedoeld om de kansen op het genereren van mutanten verder te maximaliseren, zowel door een grote deletie te creëren als door te compenseren voor de mogelijkheid dat een enkele gids niet effectief zou kunnen zijn voor het snijden. De ontwikkelingssnelheden voor elke behandeling waren vergelijkbaar (tabel 2), waarbij 50-60% van de geïnjecteerde personen tekenen van ontwikkeling vertoonde. De uitkomstpercentages voor de buffer- en Cas9-controles waren ook vergelijkbaar; de broedpercentages van individuen die de driegeleidersmix kregen, waren echter relatief lager. Op dit moment is het onduidelijk of de verminderde overleving het gevolg is van het verlies van de witte functie of het gevolg van onbedoelde gevolgen van de driegeleidersmix, zoals off-target effecten (zie de discussiesectie). Geen van de personen met volledig verlies van oogpigmentatie (d.w.z. volledige knock-out) kwam echter uit en geen van de nakomelingen van geïnjecteerde personen had witte ogen. De on-target werkzaamheid van Cas9-gebaseerde mutagenese werd op twee manieren geverifieerd. Eerst werden injectees gescreend op verlies van oogpigmentatie.
Van de 71 geleide-geïnjecteerde individuen die zich ontwikkelden, vertoonden 23 een zekere mate van pigmentverlies (figuur 10) en 9 van die individuen kwamen uit, wat resulteerde in een knock-outpercentage van ≥32%. Bij beide controlebehandelingen werd geen oogpigmentverlies waargenomen. Ten tweede werden chromosomale mutaties bevestigd via polymerasekettingreactie (PCR)18 en sequencing19. Omdat een mutantenlijn niet kon worden teruggevonden, werd genomisch DNA geanalyseerd uit pools van embryo's die waren geïnjecteerd met de driegeleidersmix of buffer. De driegeleidermix zal naar verwachting ~ 180 basenparen uit de witte locus verwijderen. Dit is te zien in de PCR-producten die zijn versterkt uit genomisch DNA dat is geïsoleerd uit geïnjecteerde individuen, evenals de bijbehorende sequentiegegevens die uit die producten zijn gegenereerd (figuur 11). Dit gecombineerde bewijs geeft aan dat embryo's werden geïnjecteerd voordat cellularisatie plaatsvond.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig01.jpg"> Figuur 1: Aspirator. Een effectieve aspirator kan worden geassembleerd door een vacuümpomp bij de inlaat, via plastic buizen, aan een 15 ml plastic conische buis te bevestigen. Ongeveer 0,5 cm moet voorzichtig van de bodem van de conische buis worden verwijderd. Een watje moet in de conische buis worden geplaatst, over de opening van de plastic buis, om P. maidis-volwassenen te vangen terwijl ze worden verzameld en ze uit de vacuümpomp te houden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig02.jpg"> Figuur 2: Bouw van containers voor volwassenen. (A) De benodigde benodigdheden (met de klok mee van linksboven): scherm, heet lijmpistool, scheermesje, 1 oz container. (B) Een groot gat moet worden gesneden in de bodem van de 1 oz container, en een vierkant van het scherm wordt net groot genoeg gesneden om dit gat te bedekken. (C) Het scherm wordt vervolgens met hete lijm over het gat gelijmd. (D) Zodra de lijm is aangebracht, moet overtollig gaas worden verwijderd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig03.jpg"> Figuur 3: Sexing P. maidis volwassenen. De ventrale zijden van mannelijke (links) en vrouwelijke (rechts) P. maidis volwassenen worden getoond. De legboor, zichtbaar over de vrouwelijke buik, is de duidelijkste indicator van het geslacht van een persoon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig04.jpg"> Figuur 4: Verzegeling van volwassenen in containers . (A) Een vierkant van 5 cm x 5 cm plastic paraffinefilm. (B) De film moet gelijkmatig worden uitgerekt tot 3-4 keer de oorspronkelijke grootte. (C) Zodra volwassenen in de container voor volwassenen zijn geplaatst, moet de uitgerekte film over de opening worden geplaatst om de volwassenen vast te zetten. Een druppel van 400 μL van 10% m/v sucrose-oplossing moet vervolgens op de film worden geplaatst. (D) Om voldoende voedingsdruk voor de volwassenen te bieden, moet een tweede vierkant van 5 cm x 5 cm plastic paraffinefilm op dezelfde manier worden uitgerekt en over de druppel sucrose worden geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig05.jpg"> Figuur 5: Opzetten van een ovipositiekamer. (A) De benodigde benodigdheden (met de klok mee van linksboven): plasticfolie, een voltooide container voor volwassenen (met volwassenen) en een petrischaal met 1% agarose (ovipositiemedium). (B) De recipiënt voor volwassenen moet op de agarose worden geplaatst met de plastic paraffinefolie/10% sucrose "sandwich" direct op het ovipositiemedium. (C) Plasticfolie wordt gebruikt om de houder voor volwassenen aan het ovipositiemedium te bevestigen. Dit voorkomt dat het medium te snel uitdroogt. (D) Er moet voor worden gezorgd dat het scherm van de container voor volwassenen niet wordt bedekt, zodat de luchtverversing nog steeds kan doorgaan. (E) Schema van de ovipositiekamer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig06.jpg"> Figuur 6: Bevochtigde kap. Een kap uitgerust met een luchtbevochtiger is rond de injectiekijker geplaatst om de luchtstroming te minimaliseren en de luchtvochtigheid te handhaven terwijl de embryo's worden behandeld. Flappen kunnen over de ingang worden gevouwen nadat de werknemer op zijn plaats is, om te helpen bij het handhaven van de juiste luchtvochtigheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig07.jpg"> Figuur 7: Verzamelen van embryo's ter voorbereiding op injecties . (A) Embryo's die in het ovipositiemedium zijn afgezet. Een paar fijne tangen worden gebruikt om embryo's uit het medium te halen en op het oppervlak te plaatsen. (B) Een smalle strook van 1 mm x 15 mm dubbelzijdige tape op een coverslip van 22 mm x 30 mm. (C) De dekplaat kan op het ovipositiemedium worden geplaatst om embryo's gemakkelijk van het oppervlak van het medium naar de tape op de coverslip over te brengen. (D) P. maidis-embryo's zijn banaanvormig, waarbij het ene uiteinde smaller is dan het andere (smal uiteinde aangegeven met rode pijlkop; breder uiteinde aangegeven met gele pijlkop in voorbeeldembryo). Het brede uiteinde van het embryo moet op de tape worden geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig08.jpg"> Figuur 8: Injectie . (A) Het injectieplatform is een petrischaaltje dat tot de rand gevuld is met 1% agar. De coverslip met een strook tape die embryo's bevat, moet direct op het oppervlak van het injectieplatform worden geplaatst. (B) De injectiedruk moet worden getest voordat embryo's worden geïnjecteerd door een kleine hoeveelheid injectieoplossing in een druppel water te "injecteren". Deze methode kan ook op elk moment tijdens het injectieproces worden gebruikt om de naald op verstoppingen te controleren. (C) Embryo's moeten worden geïnjecteerd door de naald in het grotere uiteinde van het embryo te steken. De injectieoplossing moet zichtbaar zijn als de injectie succesvol was. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig09.jpg"> Figuur 9: Zorg na injectie . (A) Nadat alle embryo's op een dekplaat zijn geïnjecteerd, moet de deklaag in een verse petrischaal met 1% agarose worden geplaatst. (B) De petrischaal met de dekplaat kan vervolgens in een vochtigheidskamer (zoals de afgebeelde) worden bewaard totdat de embryo's uitkomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig10.jpg"> Figuur 10: Pmw knock-out fenotype. (A) Age-matched control en (B) Pmw knock-out embryo's, met zich ontwikkelende ogen aangegeven door zwarte pijlpunten. Het embryo in B is mozaïek, omdat een kleine streep pigmentatie te zien is. (C) Leeftijdsgematchte controle en (D) Pmw knock-out hatchlings, met inzetstukken die een andere hoek op de ogen laten zien. Het jong in D is ook mozaïek. Een witte pijl wijst naar een gebied in de hoofdafbeelding dat verlies van pigmentatie laat zien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62417/62417fig11.jpg"> Figuur 11: Pmw knock-out volgorde. (A) Model op schaal van Pmw-mRNA , gemarkeerd in stappen van 500 bp, met locaties van gRNA-bindingsplaatsen aangegeven: G1, blauw; G2, geel; G3, roze. Eventuele frameverschuivingsmutaties die op dit punt worden gegenereerd, zullen het grootste deel van het vertaalproduct verstoren. (B) Genomische context van gRNA-sites, allemaal in één exon (vetgedrukte tekst met hoofdletters). Hulplijnbindingsplaatsen worden gemarkeerd in dezelfde kleuren als A en PAMs worden onderstreept. Spanwijdte is ~300 bp. De in-frame vertaling van het exon is hierboven weergegeven, als eenletterige afkortingen in hoofdletters. Twee motieven die specifiek zijn voor oogpigmenttransporters zijn gemarkeerd. Het CDEPT-motief van het Walker B-functionele domein is in paars verpakt en het IHQP-motief van het H-loop-domein is in het groen gekaderd. Beide domeinen zijn van cruciaal belang voor de ATP-transporterfunctie. (C) Het pmw-doelgebied werd versterkt met behulp van twee PCR-rondes. Het tweede-ronde product werd onderzocht op een gel voor bewijs van grootteverschuiving als gevolg van succesvolle verwijdering van het gebied tussen de gidsen. Rijstroken: L = 100 bp ladder; 1 = PCR-waterbeheersing; 2 = Buffergeïnjecteerde eieren; 3-4 = twee afzonderlijke sets eieren geïnjecteerd met driegeleidermix. Alleen embryo's die de driegeleidersmix ontvingen, produceerden zowel de WT-band (rode pijl) als de band die het resultaat was van een volledige excisie (witte pijl). (D) Om de identiteit van de onderste (witte pijl) band te bevestigen, werd dit DNA gezuiverd, gekloond en gesequenced. De bovenste regel is de wild-type reeks. De andere twee regels zijn sequenties van twee klonen. Drie extra klonen kwamen overeen met de onderste volgorde. Blauwe markering geeft de bindingsplaats van Gids 1 aan, terwijl roze markering de bindingsplaats van Gids 3 aangeeft. In beide allelen is het hele gebied tussen deze twee gidssites verwijderd. Afkortingen: Pmw = Peregrinus maidis wit gen; gRNA = gids-RNA; PAM = protospacer aangrenzend motief; ATP = adenosinetrifosfaat; PCR = polymerasekettingreactie; WT = wild-type; KO = knock-out. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62417/62417fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Set</td>
			<td rowspan="2"># kopjes</td>
			<td rowspan="2"># van vrouwtjes in elke kop</td>
			<td colspan="8"># van eieren</td>
			<td rowspan="2">Totaal # eieren</td>
		</tr><tr><td>Dag 2</td>
			<td>Dag 3</td>
			<td>Dag 4</td>
			<td>Dag 5</td>
			<td>Dag 6</td>
			<td>Dag 7</td>
			<td>Dag 8</td>
			<td>Dag 9</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>0</td>
			<td>26</td>
			<td>166</td>
			<td>355</td>
			<td>530</td>
			<td>193</td>
			<td>91</td>
			<td>37</td>
			<td>1398</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>22</td>
			<td>238</td>
			<td>489</td>
			<td>699</td>
			<td>520</td>
			<td>379</td>
			<td>203</td>
			<td>58</td>
			<td>2608</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>8</td>
			<td>15</td>
			<td>0</td>
			<td>57</td>
			<td>230</td>
			<td>190</td>
			<td>116</td>
			<td>80</td>
			<td>34</td>
			<td>1</td>
			<td>708</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>0</td>
			<td>226</td>
			<td>446</td>
			<td>519</td>
			<td>301</td>
			<td>179</td>
			<td>24</td>
			<td>15</td>
			<td>1710</td>
		</tr><tr><td>Totaal</td>
			<td>43</td>
			<td>15</td>
			<td>23</td>
			<td>547</td>
			<td>1331</td>
			<td>1763</td>
			<td>1467</td>
			<td>831</td>
			<td>352</td>
			<td>111</td>
			<td>6483</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Representatieve eierverzamelingen uit kunstmatige ovipositieomgeving. Gegevens van vier sets eierverzamelbekers worden getoond, met eierlengtes die beginnen op de tweede dag na het instellen en doorlopen tot en met de negende dag.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Injectie behandeling</td>
			<td>Totaal geïnjecteerd</td>
			<td>Totaal ontwikkeld</td>
			<td>Totaal gearceerd</td>
			<td>Ontwikkelingspercentage (%)</td>
			<td>Broedpercentage (%)</td>
		</tr><tr><td>Buffer</td>
			<td>39</td>
			<td>20</td>
			<td>12</td>
			<td>51</td>
			<td>31</td>
		</tr><tr><td>Cas9</td>
			<td>39</td>
			<td>24</td>
			<td>14</td>
			<td>61</td>
			<td>36</td>
		</tr><tr><td>Cas9 + Pmw gRNA's</td>
			<td>121</td>
			<td>71</td>
			<td>28</td>
			<td>59</td>
			<td>28</td>
		</tr></tbody></table>Tabel2: Overlevings- en knock-outpercentages van injecties van 3 verschillende injectiemixen.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Tot op heden is CRISPR slechts in een handvol Hemipterans gebruikt. Het hier geschetste protocol kan onderzoekers helpen crispr en kiembaantransformatie toe te passen in andere hemipteransoorten. Dit protocol is speciaal ontwikkeld voor insectenembryo's die gevoelig zijn voor uitdroging.Veel stappen in het protocol kunnen mogelijk de resultaten bij andere insectensoorten verbeteren. De mogelijkheid om transgene planthoppers te genereren opent de deur voor nieuwe bestrijdingsmethoden, zoals het creëren van insecten die geen virussen meer kunnen overbrengen. Deze techniek zal revolutionair zijn voor het bestuderen van de genfunctie bij andere plagen, zoals de westelijke bloemtrips.We hebben deze CRISPR-techniek aangepast voor tripsembryo's met veelbelovende resultaten. We vinden dat oefening in dit systeem essentieel is voor succes. De hier getoonde methoden, wanneer ze routinematig worden uitgevoerd, moeten flexibel gebruik in verschillende omgevingen mogelijk maken.Om een kamer te maken om de volwassen Peregrinus maidis-insecten vast te houden, snijdt u een gat in de bodem van een beker van een ons en lijmt u een scherm over het gat voor luchtuitwisseling. Voor de selectie van een week oude volwassen vrouwelijke insecten, zuig de kolonie gedurende een uur in een conische buis van 15 milliliter, voordat u de insecten kort op ijs koelt. Identificeer de vrouwtjes door de aanwezigheid van de legboor, die meestal donkerder is dan de rest van de buik, aan de ventrale kant van de buik.Breng de vrouwtjes over in de beker terwijl ze worden verzameld. Wanneer 15 vrouwtjes zijn geselecteerd, sluit u de beker af met een stuk paraffinewasfilm van vijf bij vijf centimeter. Breng 400 microliter van een 10% sucrose-oplossing aan op de bovenkant van de film en plaats een tweede stuk film van vijf bij vijf centimeter over de oplossing.Plaats de volwassen kamer op een eieropvangschaal met de plastic paraffinewasfilmzijde in direct contact met het ovipositiemedium en wikkel de hele eierlegkamer met plasticfolie zonder de luchtgaten te bedekken. Plaats vervolgens de kamer op 25 graden Celsius met 70% luchtvochtigheid en 14 uur licht, 10 uur donkere cyclus. Voor het verzamelen van embryo's, na de gewenste legperiode van eieren, brengt u een strook dubbelzijdige tape van één bij 15 millimeter aan op een afdekplaat van 22 bij 30 millimeter en plaatst u de afdekplaat op het ovipositiemedium van de eierlegkamer.Verplaats met behulp van een fijne borstel en een ontleedmicroscoop individuele semi-transparante embryo's van het agaroppervlak naar de dubbelzijdige tape. Wanneer ongeveer 25 embryo's zijn geselecteerd, rangschik je de banaanvormige embryo's op hun zijkanten met de grotere uiteinden op de tape geplakt. Voor micro-injectie van de embryo's, plaats eerst de dekselslip op een petrischaal van 100 bij 15 milliliter spoeling met 1% agar onder een ontleedmicroscoop in een bevochtigde kap.Om de injectiedruk te controleren, plaatst u de punt van een kwartsinjectienaald in een druppel water en start u de injectiecyclus. Nadat u de drukinstelling hebt bevestigd en vanaf de linkerkant van de afdekslip nadert, steekt u de naald in het grotere uiteinde van één embryo. Breng de injectie-oplossing in het ei en trek de naald er snel uit.Wanneer alle eieren zijn geïnjecteerd, plaatst u de dekselslip op het oppervlak van een nieuwe 1% agarschaal en plaatst u de schaal in een vochtigheidskamer. Gebruik na zes dagen schoon water en een fijne borstel om eventuele overlevende embryo's over te brengen naar een petrischaal van 35 bij 10 millimeter met met water bevochtigd filterpapier. Sluit de petrischaal af met plastic paraffinewasfilm en plaats de broedkamer in een broedmachine van 25 graden Celsius.Gebruik na zes tot acht dagen een fijne borstel om eventuele opkomende eerste instar nimfen over te brengen naar een petrischaal met bladknipsels en sluit de schaal af met plastic paraffinewasfilm. Gebruik na 48 uur bij 25 graden Celsius een fijne borstel om alle twee dagen oude nimfen over te brengen naar een opfokkooi met maïsplanten. Als injectees met zichtbaar fenotype in voldoende aantallen worden teruggevonden, kooi deze insecten dan afzonderlijk om het herstel van de doeleigenschap in de volgende generatie te maximaliseren.Kweek de insecten onder de juiste temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden met regelmatige overdrachten naar verse maïsplanten indien nodig, en screen het nageslacht regelmatig op verwachte fenotypen, waarbij individuen die het gewenste fenotype vertonen in hun eigen kooien worden geplaatst om homozygote lijnen vast te stellen. In deze representatieve analyse werden in totaal 6.483 eieren verzameld van in totaal 645 vrouwtjes in vier weken. Vrouwtjes beginnen meestal na twee dagen met het leggen van eieren en leveren de meeste eieren van dag vier tot zes, waarbij de ovipositieactiviteit op dag negen vertraagt.Cas9 negen injectie heeft geen invloed op de ontwikkeling van P.maidis, omdat de ontwikkelingssnelheden voor embryo's behandeld met injectiebuffer, injectiebuffer aangevuld met Cas9 en injectiebuffer aangevuld met Cas9 en drie gids-RNA's, vergelijkbaar zijn. De hatch rates voor de buffer en Cas9 controls zijn ook vergelijkbaar. De broedsnelheden van individuen die de driegeleidersmix ontvangen, zijn echter meestal relatief lager.In dit representatieve experiment, van de 71 gids-geïnjecteerde individuen die zich ontwikkelden, vertoonden 23 een zekere mate van pigmentverlies en negen kwamen uit, wat resulteerde in een knock-outpercentage van ongeveer 30% De driegeleidermix zal naar verwachting ongeveer 180 basenparen uit de witte locus verwijderen, zoals waargenomen in de PCR-producten die zijn versterkt uit genomisch DNA geïsoleerd van geïnjecteerde individuen, evenals in de bijbehorende volgorde gegevens die uit die producten worden gegenereerd. We raden het gebruik van afgeschuinde naalden aan om injectietrauma te minimaliseren. Als de embryo's lijken te lekken na injectie, onderzoek dan uw naaldpunten voor betere resultaten.Voortdurende oefening zal de overleving van embryo's verhogen. Tot op heden zijn er geen publicaties die kiembaantransformatie in Hemipterans beschrijven. We hebben dit protocol echter gebruikt om Cas9-expressing planthoppers te maken.Over het algemeen opent het vermogen om kiembaantransformatie uit te voeren in Hemipterans de deur naar een breed scala aan genetische plaagbestrijdingsstrategieën, waardoor het gebruik van insecticiden wordt verminderd.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo&#39;s in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische Hamsters door Pronuclear injectie van het Complex van de CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Ultra lange lezen Sequencing voor hele Genomic DNA-analyse

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a multiplex genoom bewerking van Saccharomyces cerevisiae en de creatie van gist pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospectie van microbiële stammen voor bioremediatie en probiotica ontwikkeling voor Metaorganisme onderzoek en conservering

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...