Name: microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Le département d’entomologie et de pathologie végétale de l’Université d’État de Caroline du Nord fait partie d’une équipe soutenant le programme Insect Allies de la DARPA. Les points de vue, opinions et/ou conclusions exprimés sont ceux des auteurs et ne doivent pas être interprétés comme représentant les points de vue ou les politiques officiels du Département de la Défense ou du gouvernement des États-Unis. Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent. MDL, DR et AEW ont conçu le projet et ont fourni l’acquisition de fonds, l’administration du projet et les ressources. FC, WK, NG et MDL ont conçu et conçu les expériences de micro-injection; OH a conçu et conçu la méthode de ponte. FC et WK ont effectué les expériences; FC et WK ont analysé les résultats; et FC, WK, NG et MDL ont écrit le manuscrit. Les auteurs tiennent à remercier tout particulièrement Kyle Sozanski et Victoria Barnett pour leur aide dans le maintien des colonies de P. maidis.

1. Élevage de P. maidis adultes au niveau des colonies
<ol><li>Plantez un minimum de quatre pots de maïs par semaine par cage d’élevage, avec 3-4 graines par pot. Cultivez dans un environnement exempt d’insectes.</li>
	<li>Lorsque les plantes ont ~ 5 semaines, placez-les à l’intérieur d’une cage de 30 cm x 30 cm x 60 cm.</li>
	<li>Obtenir une quantité suffisante d’adultes de P. maidis (~500) d’un laboratoire de recherche ou dans la nature, et placez-les dans une cage à l’épreuve des insectes avec 9 à 12 plants de maïs (3-4 pots).</li>
	<li>Maintenir la colonie dans un incubateur d’élevage d’insectes à 25 °C (± 1 °C), avec au moins 70 % d’humidité et un cycle lumineux de 14:10.</li>
	<li>Pour générer une colonie calibrée selon l’âge, retirez tous les adultes initiaux après quatre jours de ponte et laissez les embryons pondus dans la cage éclore et vieillir naturellement.</li>
	<li>Déplacer les insectes P. maidis (adultes) âgés de 5 semaines vers des plants de maïs frais pour une sous-culture hebdomadaire en les recueillant à l’aide d’un aspirateur (figure 1). Ensuite, relâchez les adultes dans une cage propre avec des plants de maïs frais. Pour maintenir un approvisionnement régulier de jeunes adultes à des fins expérimentales, préparez chaque semaine de nouvelles cages calibrées selon l’âge.</li>
	<li>Arrosez les pots dans les cages deux fois par jour. Coupez périodiquement les tiges, enlevez le matériel végétal en décomposition et remplacez-les par des pots de maïs frais au besoin. REMARQUE: Avec un entretien approprié, une colonie peut durer ~ 5 semaines (c’est-à-dire assez longtemps pour que les embryons pondus dans la cage deviennent adultes).</li>
</ol>2. Chambre de ponte à base d’agarose
<ol><li>Préparer des plats de collecte d’œufs (milieu de ponte) en versant 1 % p/v d’agarose dans de l’eau dans des boîtes de Petri propres de 100 mm x 15 mm. Conserver le milieu de ponte à 4 °C après sa solidification.</li>
	<li>Préparer une solution de saccharose à 10% p/v pour nourrir les adultes. Conservez la solution de saccharose à -20 °C jusqu’à un mois.</li>
	<li>Créez une chambre pour contenir les adultes en perçant un trou dans le fond d’une tasse de 1 oz (voir le tableau des matériaux) et en collant un écran sur le trou pour l’échange d’air (figure 2).</li>
	<li>Couper le film de cire de paraffine plastique en carrés de 5 cm x 5 cm; Réservez 2 carrés pour chaque tasse.</li>
	<li>Recueillir ~15 femelles adultes de 1 semaine dans une colonie de P. maidis calibrée selon l’âge. Pour sélectionner les femelles, examinez la face ventrale de l’abdomen et recherchez l’ovipositeur, qui est généralement plus foncé que le reste de l’abdomen (figure 3). Conservez les adultes jusqu’à une heure dans un flacon conique de 15 ml si vous installez plusieurs chambres de ponte. Refroidir brièvement les insectes sur la glace avant le sexage et les transférer dans le contenant pour adultes. REMARQUE : Cet examen peut être effectué sans microscope. Les femelles adultes qui ont eu le temps de se nourrir et de s’accoupler ont aussi généralement un abdomen plus gros que les mâles adultes et sont plus dociles; Par conséquent, ils peuvent plus facilement être sélectionnés dans une population de cages.</li>
	<li>Transférer les femelles dans un récipient pour adultes et sceller la tasse avec 1 couche de film de cire de paraffine plastique en l’étirant uniformément 3 à 4 fois sa taille d’origine (figure 4A,B).</li>
	<li>Appliquer 400 μL de solution de saccharose à 10 % p/v sur le dessus du joint de pellicule de cire de paraffine plastique et ajouter une deuxième couche de film de cire de paraffine plastique, en étirant le film de cire de paraffine plastique exactement comme ci-dessus (figure 4C,D). REMARQUE: Le sandwich de film de cire de paraffine plastique étiré met sous pression la solution de saccharose, ce qui est très important pour l’alimentation des adultes, mais n’empêchera pas les femelles de percer leurs ovipositeurs jusque dans le milieu de ponte.</li>
	<li>Placer la chambre adulte sur un plat de collecte d’œufs avec le côté du film de cire de paraffine plastique directement sur le milieu de ponte, et envelopper toute la chambre de ponte avec une pellicule de plastique sans couvrir les trous d’air, car ceux-ci sont nécessaires pour l’échange d’air (figure 5).</li>
	<li>Incuber chaque chambre de ponte à 25 °C avec 70% d’humidité et un cycle de lumière 14:10.</li>
	<li>Changez le sandwich de film de cire de paraffine plastique et de solution de saccharose à 10% p / v tous les jours, et retirez toute eau qui s’accumule à l’intérieur de la tasse.</li>
</ol>3. Collecte et alignement des embryons dans un environnement très humide
<ol><li>Mettre en place un système de micro-injection au stéréomicroscope dans un espace ou une hotte humidifié (hotte humidifiée; Graphique 6) pour s’assurer que l’environnement de travail atteint au moins 70% d’humidité tout au long du processus de micro-injection.</li>
	<li>Vérifiez le milieu de ponte pour les œufs après la période de ponte désirée. Faites-le dans une hotte humidifiée ou dans un autre environnement humide. NOTE: La période de ponte généralement utilisée était de nuit, de 18 heures à 10 heures, d’une durée de ~ 16 h.</li>
	<li>Si des œufs sont pondus dans l’agarose, utilisez des pinces fines pour les déterrer soigneusement et placez-les à la surface de l’agarose pour les garder humides (figure 7A).</li>
	<li>Appliquer une bande de ruban adhésif double face de 1 mm x 15 mm sur une lamelle de couverture de 22 mm x 30 mm (figure 7B). Placer le ruban adhésif vers le haut sur le milieu de ponte (figure 7C).</li>
	<li>Ramassez chaque œuf individuel de la surface de la gélose et passez au ruban adhésif double face à l’aide d’une brosse fine. Enlevez tous les œufs qui sont complètement blancs ou qui ont une coloration noire. Les œufs sains seront semi-transparents.</li>
	<li>Placez les œufs en forme de banane sur le côté, l’extrémité la plus grande étant collée sur le ruban adhésif double face (figure 7D). REMARQUE: Conservez toujours les œufs dans un environnement très humide, comme une boîte de Petri coulée avec une couche de gélose à 1% sur le fond.</li>
</ol>4. Préparation des réactifs CRISPR et des aiguilles d’injection
<ol><li>Tirez les aiguilles de quartz à l’aide d’un extracteur de micropipettes de type Flaming/Brown.</li>
	<li>Biseauter les aiguilles de quartz à l’aide d’un biseauteur à micropipette.</li>
	<li>Utilisez du ruban adhésif double face pour fixer les aiguilles tirées dans un contenant transparent, comme une boîte de Pétri, jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées.</li>
	<li>Préparer la solution injectable en combinant 0,5 μL de protéine Cas9 (solution mère de 5 μg/μL) et 0,5 μL de sgRNA (solution mère de 4 μg/μL; voir le tableau des matériaux) avec 1 μL de tampon rouge de phénol dans un volume final de 5 μL. Pour précipiter les particules qui pourraient obstruer l’aiguille, vortex brièvement la solution et centrifuger pendant 3 minutes à la vitesse maximale.</li>
	<li>Remplissez l’aiguille d’injection en prenant soin de laisser le mélange d’injection près de l’extrémité effilée de l’aiguille. Enlevez les bulles, le cas échéant, du bout de l’aiguille.</li>
	<li>Placez soigneusement l’aiguille remblayée dans le porte-aiguille et serrez le collier en acier inoxydable pour maintenir l’aiguille solidement en place pendant la micro-injection.</li>
	<li>Générez un flux fiable de solution d’injection à partir de l’aiguille en caressant doucement l’extrémité biseautée avec un pinceau fin et humidifié, tout en délivrant des rafales de pression d’air à l’aiguille avec le système d’injection. REMARQUE: L’aiguille est prête pour l’injection lorsque le mélange d’injection peut quitter l’embout en petites quantités.</li>
</ol>5. Micro-injection et soins post-injection
<ol><li>Préparez une plate-forme de micro-injection en remplissant une boîte de Petri propre de 100 mm x 15 mm avec une gélose à 1% pour former une couche plane de gélose au ras du dessus de la boîte.</li>
	<li>Placer une lamelle de couverture préalablement préparée avec ~25 embryons sur la plate-forme de gélose (Figure 8A). REMARQUE: Toutes les étapes d’injection doivent être effectuées à l’intérieur d’une hotte humidifiée (~ 70% d’humidité).</li>
	<li>Vérifiez la pression d’injection en plaçant la pointe de l’aiguille dans une goutte d’eau et en initiant le cycle d’injection. REMARQUE : Une petite quantité de solution injectable doit se disperser dans l’eau si le réglage de pression est correct (figure 8B).</li>
	<li>Insérez l’aiguille dans l’extrémité la plus grande de l’embryon, en vous approchant du côté gauche de la lamelle de couverture (figure 8C). Livrez la solution d’injection dans l’œuf et retirez l’aiguille rapidement.</li>
	<li>Une fois tous les œufs injectés, placez la lamelle de couverture sur la surface d’une nouvelle boîte de gélose 1 % et transférez-la dans une chambre d’humidité (figure 9).</li>
</ol>6. Incubation et éclosion des embryons
<ol><li>Placez la chambre d’éclosion dans un incubateur à 25 °C pendant 6 jours.</li>
	<li>Transférer tous les embryons survivants, à l’aide d’eau propre et d’une brosse fine, dans une boîte de Petri de 35 mm x 10 mm avec du papier filtre humidifié à l’eau recouvrant le fond de la boîte. Sceller la boîte de Petri avec un film de cire de paraffine plastique et maintenir à 25 °C pour permettre aux embryons d’éclore. Commencez à vérifier la survie des embryons 6 jours après l’injection. NOTE: Les nymphes du premier stade commenceront à éclore vers le jour 8.</li>
	<li>Transférer les nymphes, à l’aide d’un pinceau fin, dans une boîte de Petri contenant des coupures de feuilles. Couvrir le plat et sceller avec un film de cire de paraffine plastique.</li>
	<li>Incuber le plat scellé des nouveau-nés sur boutures de feuilles pendant 48 h à 25 °C.</li>
	<li>Transférer toutes les nymphes âgées de 2 jours d’une série d’injections dans une cage d’élevage avec des plants de maïs à l’aide d’une brosse fine. Si les personnes injectées avec un phénotype visible sont récupérées en nombre suffisant, élevez-les séparément pour maximiser la récupération du caractère cible dans la génération suivante. Sinon, effectuez un accouplement en masse de tous les injectés. REMARQUE : Placez doucement les nouveau-nés dans la spire du plant de maïs pour leur fournir un refuge et assurer une humidité adéquate de leur environnement immédiat.</li>
	<li>Élever les insectes dans les conditions décrites ci-dessus, en assurant une température, une humidité et des transferts réguliers vers les plants de maïs frais.</li>
	<li>Cribler la descendance pour les phénotypes attendus. Placez les individus présentant le phénotype désiré dans leur propre cage pour établir des lignées homozygotes.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Qualité de la ponte et nutrition Récemment, des chercheurs travaillant avec une espèce apparentée, Nilaparvata lugens, ont obtenu les œufs qu’ils utilisaient pour les micro-injections directement à partir de la feuille, gardant les œufs injectés dans le tissu foliaire jusqu’à leur éclosion17. Bien que cette méthode à base de feuilles fournisse un environnement plus naturel pour le développement embryonnaire, elle a également augmenté les risques d’infections et de dommages aux œufs pendant le processus d’élimination. Le système de ponte artificielle présenté ici offre un environnement plus uniforme et réduit les risques d’endommagement des œufs lors de la manipulation. En installant les gobelets de ponte le vendredi, la majorité des ovules pondus ont été collectés au cours d’une semaine de travail typique, au profit de ceux qui effectuent le travail de micro-injection. Une mise en garde à cette méthode, cependant, est que le manque de nutriments dans le régime de solution de saccharose à 10% finira par affecter la santé des insectes, et les femelles dans les tasses commencent généralement à mourir après seulement 10 jours. La qualité des œufs commence également à baisser après 6 jours, comme en témoigne une augmentation des œufs morts ou malsains. Par conséquent, il est important d’être sélectif des œufs utilisés pour les micro-injections et de ne pas garder les femelles après le jour 6.
Taux de survie et humidité Deux facteurs semblent être essentiels à la survie embryonnaire grâce au processus de micro-injection. L’aspect le plus difficile de la manipulation des embryons de P. maidis est de les empêcher de se dessécher après le retrait du milieu de ponte et tout au long de la micro-injection. Comme les œufs sont généralement pondus à l’intérieur des tissus végétaux, ils n’ont pas de coquille adéquate pour prévenir la déshydratation. Même dans le capot humidifié, des ensembles entiers d’œufs ont été perdus à cause de la dessiccation. Cependant, une humidité trop élevée pourrait également affecter les micro-injections si de l’eau s’est accumulée sur le ruban double face ou sur la lunette. Malheureusement, la déshydratation des ovules n’était généralement pas facile à remarquer pendant le processus de micro-injection, et ils semblaient souvent normaux jusqu’à 2 ou 3 jours plus tard, quand ils sont devenus complètement transparents, ne montrant aucun signe de développement.
La qualité des aiguilles semble également jouer un rôle important dans la survie. L’aiguille doit être biseautée pour minimiser les dommages inutiles à l’œuf. Lorsque l’aiguille est bloquée, l’utilisation de la fonction de dégagement de l’injecteur tout en caressant doucement le bout de l’aiguille avec un pinceau humidifié (voir l’étape 4.7) ramène généralement l’aiguille à un état fonctionnel. Quoi qu’il en soit, il est recommandé de ne mettre que de petites quantités de solution d’injection (~ 0,25 μL) dans chaque aiguille et de passer à une nouvelle aiguille toutes les quelques lames (~ 50-60 œufs) pour s’assurer que la qualité de l’aiguille est maintenue tout au long du processus d’injection.
Génération réussie d’un phénotype knockout Pour réussir à transformer les cellules germinales, les micro-injections d’embryons doivent généralement être effectuées le plus tôt possible avant la cellularisation. Selon l’espèce d’insecte, la fenêtre de temps pour compléter les micro-injections varie de seulement quelques heures à une journée complète14,15,20. On ne sait toujours pas quand les embryons de P. maidis subissent une cellularisation. L’élimination médiée par Cas9 a été testée sur des embryons aussi jeunes que 4 h après la ponte (pel) jusqu’à 16 h pel, et les phénotypes attendus ont été observés dans toutes les expériences, suggérant que toutes les micro-injections ont été effectuées dans la fenêtre de précellurisation.
L’orthologue P. maidis du gène de la couleur des yeux, blanc, a été choisi parce que le phénotype knockout devait être facile à dépister chez les injectés en raison de sa nature autonome cellulaire. En effet, comme prévu, les knockouts mosaïques et totaux étaient clairement identifiables parmi les embryons recevant le mélange d’injection contenant Cas9 et des ARN guides. Malheureusement, aucun injecté n’a éclos complètement et un accouplement massif de survivants n’a pas réussi à générer une progéniture aux yeux blancs. Cependant, une lignée mutante a ensuite été générée avec succès en ciblant un gène différent (Klobasa et al., en cours). Cela suggère que l’échec de l’établissement d’une lignée mutante blanche est probablement dû soit à des effets hors cible (c.-à-d. Cas9 coupant des régions importantes ailleurs dans le génome) générant une mutation létale étroitement liée, soit à un rôle critique imprévu pour le blanc chez P. maidis.
Les données phénotypiques et moléculaires (Figure 8 et Figure 9) affirment qu’un knockout significatif dans le locus blanc a été créé dans un échantillon d’embryons injectés, ce qui entraînerait une perte totale de la fonction génique. De plus, alors que les mutations chez le blanc sont viables chez certaines espèces, il existe un précédent pour la réduction de l’activité blanche étant préjudiciable21,22. Cela dit, des effets hors cible ne peuvent être complètement exclus. La prédiction des cibles probables hors cible nécessite des données précises sur le séquençage du génome23, ce que l’état actuel des ressources génomiques chez P. maidis rend impossible à faire à l’heure actuelle. Quoi qu’il en soit, avec ces nouvelles méthodes, il est possible de tester d’autres gènes cibles en toute confiance, même en s’orientant vers une transgénèse plus traditionnelle dans le but d’apporter de nouveaux outils génétiques à ce ravageur pernicieux.

La cicadelle du maïs, Peregrinus maidis, est un ravageur économiquement important du maïs 1,2,3. Ils causent des dommages physiques directs à la plante, à la fois en se nourrissant avec leurs pièces buccales perçantes-suceuses, et pendant la reproduction lorsqu’ils pondent leurs embryons directement dans les tissus végétaux 2,4. Malgré les multiples voies de dommages directs aux cultures, l’impact le plus important de ces insectes sur la santé des cultures est indirect, en agissant comme vecteur du virus de la mosaïque du maïs (MMV) et du virus de la bande du maïs 5,6. Le MMV est capable de se répliquer dans le corps de son vecteur P. maidis, ce qui permet au virus de persister chez les insectes individuels tout au long de leur vie, de sorte qu’ils peuvent continuer à propager le virus à de nouvelles plantes hôtes 7,8. Les méthodes les plus courantes pour lutter contre P. maidis, et donc les virus qu’elle vectère, sont les insecticides.
Malheureusement, la mauvaise gestion de ces produits a entraîné le développement d’une résistance chez l’organisme nuisible ciblé ainsi que la pollution de l’environnement9. Par conséquent, de nouvelles stratégies sont nécessaires pour réduire les pertes de récoltes dues à cette combinaison insecte/virus-ravageur. Des travaux antérieurs ont démontré que l’interférence ARN (ARNi) pourrait être une méthode de contrôle efficace pour P. maidis, car ils sont sensibles à la régulation négative de l’expression génique même lors de l’ingestion d’ARN double brin (ARNds)10. Cependant, le moyen le plus efficace d’administrer l’ARNds sur le terrain serait par les plantes dont les insectes se nourrissent; Par conséquent, les cultures pourraient toujours être sensibles aux virus que les insectes transportent déjà. Avec l’avènement de l’édition du génome CRISPR/Cas9, de nouvelles stratégies de lutte antiparasitaire sont possibles, y compris le forçage génétique11,12 basé sur Cas9, qui pourrait être utilisé pour réduire la taille d’une population de ravageurs, ou pour remplacer ladite population par des individus résistants aux virus qu’ils vecvent.
Cependant, le développement et le déploiement de tout type de système de forçage génétique nécessiteront le développement de techniques transgéniques. De telles méthodes n’étaient pas nécessaires pour effectuer des expériences d’ARNi chez P. maidis parce que les ARNds et/ou les siRNA sont présumés capables de traverser les membranes cellulaires en raison de l’efficacité de l’ARNi chez P. maidis10,13. Ce n’est pas vrai pour les ADN et / ou les protéines utilisés dans la transgénèse traditionnelle ou dans l’édition de gènes basée sur Cas9, qui seraient l’un ou l’autre précurseur de la création d’insectes porteurs d’un forçage génétique. Pour effectuer l’édition de gènes ou d’autres formes de transformation de la lignée germinale, ces ADN et protéines sont idéalement microinjectés dans les embryons au stade du blastoderme syncytial, avant la cellulasse de l’embryon de l’insecte. Le timing est critique, car le stade syncytial est la première partie du développement14,15. Comme les femelles de P. maidis pondent préférentiellement leurs œufs dans les tissus végétaux, l’extraction de quantités suffisantes d’embryons précellulaires pour les micro-injections peut nécessiter beaucoup de travail et de temps. Par conséquent, de nouvelles techniques ont été développées pour collecter et microinjecter rapidement des embryons de P. maidis avant la cellularisation.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 oz Containers</td>
			<td>Dart</td>
			<td>P100N</td>
			<td>Adult container for egg-laying setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-103</td>
			<td>Serves as collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-106</td>
			<td>For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>For handling planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspirator</td>
			<td>Fischer Technical</td>
			<td>LAV-3</td>
			<td>Vacuum for aspirating larger numbers of insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Spectrum LED Lights</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>GLP24FS/19W/LED</td>
			<td>Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>A36498</td>
			<td>Endonuclease for cutting planthopper genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Vinyl Tubing</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.</td>
			<td>Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn planthoppers</td>
			<td>North Carolina State University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Dr. Anna Whitfield&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch Double Sided Tape</td>
			<td>NA</td>
			<td>Holding eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early Sunglow corn</td>
			<td>Park Seed Company</td>
			<td>05093-PK-N</td>
			<td>Corn for rearing planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epTIPS Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjection System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td>Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Drosophila Agar</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>66-103</td>
			<td>Substrate for everything except egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4731</td>
			<td>Egg handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose LE Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-102</td>
			<td>Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifyer</td>
			<td>Homedics</td>
			<td>UHE-CM45</td>
			<td>For providing humidity in humidified hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>For holding injected embryos until hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing cages</td>
			<td>Bioquip (special order)</td>
			<td>Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)</td>
			<td>Cage for planthoppers on corn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Planthopper screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12-5</td>
			<td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td>For positioning microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td>For beveling injection needles / Used &#39;fine&#39; graded plate at 20&#176; angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>GT100 X-Y Gliding Table</td>
			<td>For positioning and moving embryos under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Paint Brush</td>
			<td>Testor #2 8733</td>
			<td>Sold in 3 pack 281206</td>
			<td>Fine paintbrushes for embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI-7</td>
			<td>For holding the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I41VLH3C8</td>
			<td>Rearing injectees until hatch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy Vector System I cloning kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>Cloning Pm white target site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides or coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-549-3</td>
			<td>Hold eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4200</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Glad ClingWrap Plastic Wrap</td>
			<td>NA</td>
			<td>Wrap the entire egg-laying chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>QF100-50-10</td>
			<td>For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen (White Organza Fabric)</td>
			<td>Joann Fabrics</td>
			<td>16023889</td>
			<td>For covering the adult container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>To make 10% sucorose solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing

La cicadelle du maïs, Peregrinus maidis, est un ravageur du maïs et un vecteur de plusieurs virus du maïs. Des méthodes publiées précédemment décrivent le déclenchement de l’interférence ARN (ARNi) chez P. maidis par microinjection d’ARN double brin (ARNds) chez les nymphes et les adultes. Malgré la puissance de l’ARNi, les phénotypes générés par cette technique sont transitoires et manquent d’héritage mendélien à long terme. Par conséquent, la boîte à outils de P. maidis doit être élargie pour inclure des outils génomiques fonctionnels qui permettraient la production de souches mutantes stables, ouvrant la porte aux chercheurs pour apporter de nouvelles méthodes de lutte contre ce ravageur économiquement important. Cependant, contrairement aux ARNds utilisés pour l’ARNi, les composants utilisés dans l’édition du génome basée sur CRISPR / Cas9 et la transformation de la lignée germinale ne traversent pas facilement les membranes cellulaires. En conséquence, les ADN plasmidiques, les ARN et / ou les protéines doivent être microinjectés dans les embryons avant que l’embryon ne se cellularise, ce qui fait du moment de l’injection un facteur critique de succès. À cette fin, une méthode de ponte à base d’agarose a été mise au point pour permettre de récolter des embryons sur des femelles de P. maidis à des intervalles relativement courts. On y trouve des protocoles détaillés pour la collecte et la micro-injection d’embryons précellulaires de P. maidis avec des composants CRISPR (nucléase Cas9 qui a été complexée avec des ARN guides), et les résultats de l’élimination du gène Cas9 d’un gène de couleur des yeux de P. maidis , blanc, sont présentés. Bien que ces protocoles décrivent l’édition du génome CRISPR / Cas9 chez P. maidis, ils peuvent également être utilisés pour produire des P. maidis transgéniques via la transformation de la lignée germinale en modifiant simplement la composition de la solution injectable.

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Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Voici des protocoles pour la collecte et la microinjection d’embryons de cicadelles de maïs précellulaires dans le but de modifier leur génome via l’édition du génome basée sur CRISPR / Cas9 ou pour l’ajout d’éléments transposables marqués par transformation germinale.

Microinjection de cicadelle de maïs, Peregrinus maidis, embryons pour l’édition du génome CRISPR / Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

À ce jour, CRISPR n’a été utilisé que chez une poignée d’hémiptères. Le protocole décrit ici pourrait aider les chercheurs à appliquer CRISPR et la transformation germinale chez d’autres espèces d’hémiptères. Ce protocole a été développé spécifiquement pour les embryons d’insectes sensibles à la dessiccation.De nombreuses étapes du protocole pourraient potentiellement améliorer les résultats chez d’autres espèces d’insectes. La capacité de générer des cicadelles transgéniques ouvre la porte à de nouvelles méthodes de lutte, telles que la création d’insectes qui ne peuvent plus transmettre de virus. Cette technique sera révolutionnaire pour étudier la fonction des gènes chez d’autres ravageurs, tels que les thrips des fleurs de l’Ouest.Nous avons adapté cette technique CRISPR pour les embryons de thrips avec des résultats prometteurs. Nous constatons que la pratique dans ce système est essentielle au succès. Les méthodes présentées ici, lorsqu’elles sont appliquées régulièrement, devraient permettre une utilisation flexible dans divers contextes.Pour faire une chambre pour contenir les insectes adultes Peregrinus maidis, coupez un trou dans le fond d’une tasse d’une once et collez un écran sur le trou pour l’échange d’air. Pour la sélection d’insectes femelles adultes âgés d’une semaine, aspirez la colonie dans un tube conique de 15 millilitres pendant une heure, avant de refroidir brièvement les insectes sur de la glace. Identifiez les femelles par la présence de l’ovipositeur, qui est généralement plus foncé que le reste de l’abdomen, sur la face ventrale de l’abdomen.Transférez les femelles dans la tasse au fur et à mesure qu’elles sont collectées. Lorsque 15 femelles ont été sélectionnées, scellez la tasse avec un morceau de film de cire de paraffine de cinq centimètres sur cinq. Appliquez 400 microlitres d’une solution de saccharose à 10% sur le dessus du film et placez un deuxième morceau de film de cinq centimètres sur cinq sur la solution.Placez la chambre adulte sur un plat de collecte d’œufs avec le côté du film de cire de paraffine plastique en contact direct avec le milieu de ponte et enveloppez toute la chambre de ponte avec une pellicule de plastique sans couvrir les trous d’air. Ensuite, placez la chambre à 25 degrés Celsius avec 70% d’humidité et 14 heures de lumière, 10 heures de cycle d’obscurité. Pour le prélèvement d’embryons, après la période de ponte souhaitée, appliquer une bande de ruban adhésif double face d’un millimètre sur 15 millimètres sur un couvercle de 22 millimètres sur 30 millimètres et placer le couvercle sur le milieu de ponte de la chambre de ponte.À l’aide d’un pinceau fin et d’un microscope à dissection, déplacer les embryons semi-transparents individuels de la surface de la gélose vers le ruban adhésif double face. Lorsqu’environ 25 embryons ont été sélectionnés, disposer les embryons en forme de banane sur leurs côtés avec les extrémités les plus grandes collées sur la bande. Pour la micro-injection des embryons, placez d’abord le couvercle sur une boîte de Petri de 100 millilitres sur 15 millilitres avec 1% de gélose sous un microscope à dissection à l’intérieur d’un capot humidifié.Pour vérifier la pression d’injection, placez la pointe d’une aiguille d’injection de quartz dans une goutte d’eau et lancez le cycle d’injection. Après avoir confirmé le réglage de la pression, en s’approchant du côté gauche du couvercle, insérez l’aiguille dans la plus grande extrémité d’un embryon. Livrez la solution d’injection dans l’œuf et retirez rapidement l’aiguille.Lorsque tous les œufs ont été injectés, placez le couvercle sur la surface d’un nouveau plat de gélose à 1% et placez le plat dans une chambre d’humidité. Après six jours, utilisez de l’eau propre et une brosse fine pour transférer les embryons survivants dans une boîte de Petri de 35 millimètres sur 10 contenant du papier filtre humidifié à l’eau. Scellez la boîte de Petri avec un film de cire de paraffine plastique et placez la chambre d’éclosion dans un incubateur à 25 degrés Celsius.Après six à huit jours, utilisez un pinceau fin pour transférer les nymphes émergentes du premier stade dans une boîte de Pétri de coupures de feuilles et scellez la boîte avec un film de cire de paraffine plastique. Après 48 heures à 25 degrés Celsius, utilisez une brosse fine pour transférer toutes les nymphes de deux jours dans une cage d’élevage avec des plants de maïs. Si les personnes injectées avec un phénotype visible sont récupérées en nombre suffisant, mettre ces insectes en cage séparément afin de maximiser le rétablissement du caractère cible dans la génération suivante.Élever les insectes dans les conditions de température et d’humidité appropriées avec des transferts réguliers vers des plants de maïs frais au besoin, et dépister régulièrement la descendance pour les phénotypes prévus, en plaçant les individus présentant le phénotype désiré dans leurs propres cages pour établir des lignées homozygotes. Dans cette analyse représentative, un total de 6 483 œufs ont été prélevés sur un total de 645 femelles en quatre semaines. Les femelles commencent généralement à pondre après deux jours et fournissent la plupart des œufs du quatrième au sixième jour, l’activité de ponte ralentissant au neuvième jour.L’injection de Cas9 neuf n’affecte pas le développement de P. maidis, car les taux de développement des embryons traités avec un tampon injectable, un tampon d’injection complété par Cas9 et un tampon d’injection complété par Cas9 et trois ARN guides sont similaires. Les taux de hachure pour les contrôles Buffer et Cas9 sont également similaires. Cependant, les taux d’éclosion des individus recevant la combinaison de trois guides sont généralement relativement plus faibles.Dans cette expérience représentative, sur les 71 individus ayant reçu une injection guidée qui se sont développés, 23 ont montré un certain degré de perte de pigment et neuf ont éclos, ce qui a entraîné un taux d’élimination d’environ 30%. Le mélange à trois guides devrait éliminer environ 180 paires de bases du locus blanc, comme observé dans les produits PCR amplifiés à partir d’ADN génomique isolé d’individus injectés, ainsi que dans les données de séquence associées générées à partir de ces produits. Nous recommandons l’utilisation d’aiguilles biseautées pour minimiser les traumatismes liés à l’injection. Si les embryons semblent fuir après l’injection, examinez les pointes de vos aiguilles pour de meilleurs résultats.La poursuite de la pratique augmentera la survie de l’embryon. À ce jour, il n’existe aucune publication décrivant la transformation de la lignée germinale chez les hémiptères. Cependant, nous avons utilisé ce protocole pour fabriquer des cicadelles exprimant Cas9.Dans l’ensemble, la capacité d’effectuer la transformation de la lignée germinale chez les hémiptères ouvre la porte à un large éventail de stratégies de lutte antiparasitaire génétique, réduisant ainsi l’utilisation d’insecticides.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection plaies dosage et<em&gt; In vivo</em&gt; Localisation des épidermique plaies Reporters réponse dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Production de génétiquement Hamsters syriens dorés par Injection pronucléaire du complexe CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Une plate-forme de Microfluidic ultra haute capacité pour le séquençage du génome de cellules individuelles

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Séquençage de l’ultra longue lecture pour l’analyse de l’ADN génomique ensemble

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospection de souches microbiennes pour le développement de bioremédiation et de probiotiques pour la recherche et la préservation des méta-organismes

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...