Name: microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Die North Carolina State University, Abteilung für Entomologie und Pflanzenpathologie, ist Teil eines Teams, das das Insect Allies Program der DARPA unterstützt. Die geäußerten Ansichten, Meinungen und/oder Erkenntnisse sind die der Autoren und sollten nicht so interpretiert werden, dass sie die offiziellen Ansichten oder Richtlinien des Verteidigungsministeriums oder der US-Regierung darstellen. Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte. MDL, DR und AEW konzipierten das Projekt und stellten die Finanzierungsakquise, die Projektverwaltung und die Ressourcen zur Verfügung. FC, WK, NG und MDL konzipierten und gestalteten die Mikroinjektionsexperimente; OH konzipierte und entwarf die Eiablagemethode. FC und WK führten die Experimente durch; FC und WK analysierten die Ergebnisse; und FC, WK, NG und MDL schrieben das Manuskript. Die Autoren bedanken sich besonders bei Kyle Sozanski und Victoria Barnett für ihre Hilfe bei der Erhaltung der P. maidis-Kolonien.

1. Aufzucht von P. maidis Imagines auf Kolonieebene
<ol><li>Pflanzen Sie mindestens vier Töpfe Mais pro Woche und Aufzuchtkäfig mit 3-4 Samen pro Topf. Anbau in einer insektenfreien Umgebung.</li>
	<li>Wenn die Pflanzen ~5 Wochen alt sind, stellen Sie sie in einen 30 cm x 30 cm x 60 cm großen Käfig.</li>
	<li>Besorgen Sie sich eine ausreichende Menge erwachsener P. maidis (~500) aus einem Forschungslabor oder in freier Wildbahn und setzen Sie sie in einen insektensicheren Käfig mit 9-12 Maispflanzen (3-4 Töpfe).</li>
	<li>Halten Sie die Kolonie in einem Inkubator für die Insektenaufzucht bei 25 °C (± 1 °C), mit mindestens 70 % Luftfeuchtigkeit und einem Lichtzyklus von 14:10.</li>
	<li>Um eine alterskalibrierte Kolonie zu erzeugen, entfernen Sie alle anfänglichen erwachsenen Tiere nach vier Tagen Eiablage und lassen Sie die in den Käfig gelegten Embryonen auf natürliche Weise schlüpfen und altern.</li>
	<li>Bringen Sie 5 Wochen alte P. maidis-Insekten (adulte Tiere) in frische Maispflanzen für die wöchentliche Subkultur, indem Sie sie mit einem Absauger sammeln (Abbildung 1). Lassen Sie die erwachsenen Tiere dann in einen sauberen Käfig mit frischen Maispflanzen entlassen. Um einen stetigen Nachschub an jungen Erwachsenen für Versuchszwecke aufrechtzuerhalten, bereiten Sie jede Woche frische, alterskalibrierte Käfige vor.</li>
	<li>Gießen Sie die Töpfe in den Käfigen zweimal täglich. Schneiden Sie regelmäßig die Stiele ab, entfernen Sie verrottendes Pflanzenmaterial und ersetzen Sie es bei Bedarf durch frische Maistöpfe. HINWEIS: Bei richtiger Pflege kann eine Kolonie ~5 Wochen dauern (d.h. lange genug, damit die in den Käfig gelegten Embryonen erwachsen werden).</li>
</ol>2. Eiablagekammer auf Agarosebasis
<ol><li>Stellen Sie Eierauffangschalen (Eiablagemedium) her, indem Sie 1 % w/v Agarose in Wasser in saubere, 100 mm x 15 mm große Petrischalen gießen. Lagern Sie das Eiablagemedium nach dem Erstarren bei 4 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie 10% w/v Saccharoselösung für die Fütterung der erwachsenen Tiere vor. Lagern Sie die Saccharoselösung bis zu einem Monat bei -20 °C.</li>
	<li>Bauen Sie eine Kammer, um die Erwachsenen zu halten, indem Sie ein Loch in den Boden eines 1-Unzen-Bechers schneiden (siehe Materialtabelle) und ein Sieb für den Luftaustausch über das Loch kleben (Abbildung 2).</li>
	<li>Schneiden Sie Kunststoff-Paraffinwachsfolie in 5 cm x 5 cm große Quadrate; Legen Sie für jede Tasse 2 Quadrate beiseite.</li>
	<li>Sammle ~15 1 Woche alte erwachsene Weibchen aus einer alterskalibrierten P. maidis-Kolonie. Um Weibchen auszuwählen, untersuchen Sie die ventrale Seite des Abdomens und suchen Sie nach dem Ovipositor, der typischerweise dunkler ist als der Rest des Abdomens (Abbildung 3). Bewahren Sie erwachsene Tiere bis zu einer Stunde in einer konischen Durchstechflasche mit einem Fassungsvermögen von 15 ml auf, wenn Sie mehrere Eiablagekammern einrichten. Kühlen Sie die Insekten vor dem Geschlecht kurz auf Eis und setzen Sie sie in den erwachsenen Behälter um. HINWEIS: Diese Untersuchung kann ohne Mikroskop durchgeführt werden. Erwachsene Weibchen, die Zeit zum Fressen und zur Paarung hatten, haben in der Regel auch einen größeren Hinterleib als erwachsene Männchen und sind fügsamer. Daher können sie leichter aus einer Käfigpopulation ausgewählt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Weibchen in einen Behälter für Erwachsene und versiegeln Sie den Becher mit 1 Schicht Paraffinwachsfolie, indem Sie ihn gleichmäßig auf das 3-4-fache seiner ursprünglichen Größe dehnen (Abbildung 4A, B).</li>
	<li>Tragen Sie 400 μl 10 % w/v Saccharoselösung auf die Oberseite der Kunststoff-Paraffin-Wachsfilm-Versiegelung auf und fügen Sie eine zweite Schicht Kunststoff-Paraffin-Wachsfolie hinzu, wobei die Kunststoff-Paraffin-Wachsfolie genau wie oben dehnt wird (Abbildung 4C, D). Anmerkungen: Das Sandwich aus gestreckter Kunststoff-Paraffinwachsfolie setzt die Saccharoselösung unter Druck, was für die Fütterung von Erwachsenen sehr wichtig ist, aber die Weibchen nicht daran hindert, ihre Legeapparate bis in das Eiablagemedium zu durchstechen.</li>
	<li>Legen Sie die adulte Kammer mit der Kunststoff-Paraffinwachsfolie direkt auf das Eiablagemedium auf eine Eierauffangschale und wickeln Sie die gesamte Eiablagekammer mit Frischhaltefolie ein, ohne die Luftlöcher abzudecken, da diese für den Luftaustausch benötigt werden (Abbildung 5).</li>
	<li>Inkubieren Sie jede Eiablagekammer bei 25 °C mit 70 % Luftfeuchtigkeit und einem Lichtzyklus von 14:10.</li>
	<li>Wechseln Sie das Sandwich aus Kunststoff-Paraffinwachsfilm und 10% w/v Saccharoselösung täglich und entfernen Sie jegliches Wasser, das sich im Becher ansammelt.</li>
</ol>3. Embryonenentnahme und -ausrichtung in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit
<ol><li>Richten Sie ein stereomikroskopisches Mikroinjektionssystem in einem befeuchteten Raum oder einer Haube (befeuchtete Haube; Abbildung 6) um sicherzustellen, dass die Arbeitsumgebung während des gesamten Mikroinjektionsprozesses eine Luftfeuchtigkeit von mindestens 70 % erreicht.</li>
	<li>Überprüfen Sie das Eiablagemedium auf Eier nach der gewünschten Eiablagezeit. Tun Sie dies in einer befeuchteten Haube oder einer anderen feuchten Umgebung. HINWEIS: Die normalerweise verwendete Eiablagezeit war über Nacht von 18 Uhr bis 10 Uhr und dauerte ~16 Stunden.</li>
	<li>Wenn Eier in die Agarose gelegt werden, graben Sie sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette aus und legen Sie sie auf die Oberfläche der Agarose, um sie feucht zu halten (Abbildung 7A).</li>
	<li>Kleben Sie einen Streifen doppelseitiges Klebeband von 1 mm x 15 mm auf ein Deckglas von 22 mm x 30 mm (Abbildung 7B). Legen Sie das Deckglas mit der Klebebandseite nach oben auf das Eiablagemedium (Abbildung 7C).</li>
	<li>Nehmen Sie jedes einzelne Ei von der Agaroberfläche auf und bewegen Sie es mit einem feinen Pinsel auf das doppelseitige Klebeband. Entfernen Sie alle Eier, die vollständig weiß sind oder eine schwarze Färbung aufweisen. Gesunde Eier sind halbtransparent.</li>
	<li>Legen Sie die bananenförmigen Eier auf die Seite, wobei das größere Ende auf das doppelseitige Klebeband geklebt wird (Abbildung 7D). Anmerkungen: Bewahren Sie die Eier immer in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit auf, z. B. in einer Petrischale mit einer Schicht von 1% Agar auf dem Boden.</li>
</ol>4. Herstellung von CRISPR-Reagenzien und Injektionsnadeln
<ol><li>Ziehen Sie Quarznadeln mit einem Mikropipettenabzieher vom Typ Flaming/Brown.</li>
	<li>Fasen Sie die Quarznadeln mit einer Mikropipetten-Anfasmaschine ab.</li>
	<li>Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um gezogene Nadeln in einem durchsichtigen Behälter, z. B. einer Petrischale, zu befestigen, bis sie gebrauchsfertig sind.</li>
	<li>Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie 0,5 μl Cas9-Protein (5 μg/μl Stammlösung) und 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl Stammlösung; siehe Materialtabelle) mit 1 μl Phenolrotpuffer in einem Endvolumen von 5 μl kombinieren. Um Partikel auszufällen, die die Nadel verstopfen könnten, die Lösung kurz vortexen und 3 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.</li>
	<li>Füllen Sie die Injektionsnadel auf und achten Sie darauf, dass die Injektionsmischung in der Nähe des sich verjüngenden Endes der Nadel belassen wird. Entfernen Sie eventuelle Blasen von der Nadelspitze.</li>
	<li>Setzen Sie die hinterfüllte Nadel vorsichtig in den Nadelhalter ein und ziehen Sie den Edelstahlkragen fest, um die Nadel während der Mikroinjektion sicher an Ort und Stelle zu halten.</li>
	<li>Erzeugen Sie einen zuverlässigen Fluss der Injektionslösung aus der Nadel, indem Sie mit einem feinen, angefeuchteten Pinsel sanft über die abgeschrägte Spitze streichen, während Sie mit dem Injektionssystem Luftdruckstöße an die Nadel abgeben. Anmerkungen: Die Nadel ist bereit für die Injektion, wenn die Injektionsmischung die Spitze in kleinen Mengen verlassen kann.</li>
</ol>5. Mikroinjektion und Pflege nach der Injektion
<ol><li>Bereiten Sie eine Mikroinjektionsplattform vor, indem Sie eine saubere 100 mm x 15 mm große Petrischale mit 1%igem Agar füllen, um eine ebene Agarschicht zu bilden, die bündig mit der Oberseite der Schale abschließt.</li>
	<li>Legen Sie ein zuvor präpariertes Deckglas mit ~25 Embryonen auf die Agarplattform (Abbildung 8A). Anmerkungen: Alle Injektionsschritte müssen in einer befeuchteten Haube (~70% Luftfeuchtigkeit) durchgeführt werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie den Injektionsdruck, indem Sie die Nadelspitze in einen Tropfen Wasser legen und den Injektionszyklus einleiten. Anmerkungen: Bei korrekter Druckeinstellung sollte sich eine kleine Menge Injektionslösung im Wasser verteilen (Abbildung 8B).</li>
	<li>Führen Sie die Nadel in das größere Ende des Embryos ein, wobei Sie sich von der linken Seite des Deckglases nähern (Abbildung 8C). Geben Sie die Injektionslösung in das Ei und ziehen Sie die Nadel schnell heraus.</li>
	<li>Nachdem alle Eier injiziert wurden, legen Sie das Deckglas auf die Oberfläche einer neuen 1%igen Agar-Schale und geben Sie die Schale in eine Feuchtigkeitskammer (Abbildung 9).</li>
</ol>6. Inkubation und Schlüpfen von Embryonen
<ol><li>Die Schlupfkammer für 6 Tage in einen 25 °C heißen Inkubator stellen.</li>
	<li>Übertragen Sie alle überlebenden Embryonen mit sauberem Wasser und einem feinen Pinsel in eine 35 mm x 10 mm große Petrischale, deren Boden mit wasserangefeuchtetem Filterpapier bedeckt ist. Versiegeln Sie die Petrischale mit einer Paraffinwachsfolie aus Kunststoff und halten Sie sie bei 25 °C, damit die Embryonen schlüpfen können. Beginnen Sie 6 Tage nach der Injektion mit der Überprüfung der Embryonen auf Überleben. HINWEIS: Die ersten Nymphen im Stadium schlüpfen um Tag 8 herum.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nymphen mit einem feinen Pinsel in eine Petrischale mit Blattresten. Decken Sie die Schüssel ab und versiegeln Sie sie mit Paraffinwachsfolie.</li>
	<li>Die verschlossene Schale der Jungtiere auf Blattstecklingen 48 h bei 25 °C bebrüten.</li>
	<li>Alle 2 Tage alten Nymphen aus einer Injektionsrunde mit einer feinen Bürste in einen Aufzuchtkäfig mit Maispflanzen überführen. Wenn Injizierte mit sichtbarem Phänotyp in ausreichender Anzahl wiedergefunden werden, ziehen Sie sie separat auf, um die Erholung des Zielmerkmals in der nächsten Generation zu maximieren. Andernfalls führen Sie eine Massenpaarung aller Injektoren durch. Anmerkungen: Legen Sie die Jungtiere vorsichtig in den Wirtel der Maispflanze, um Zuflucht zu bieten und die richtige Luftfeuchtigkeit in ihrer unmittelbaren Umgebung zu gewährleisten.</li>
	<li>Ziehen Sie die Insekten unter den oben beschriebenen Bedingungen auf und achten Sie auf die richtige Temperatur, Luftfeuchtigkeit und regelmäßige Umlagerungen auf frische Maispflanzen.</li>
	<li>Screenen Sie die Nachkommen auf erwartete Phänotypen. Individuen, die den gewünschten Phänotyp aufweisen, werden in ihren eigenen Käfig gesetzt, um homozygote Linien zu etablieren.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Eiablagequalität und Nährwert Kürzlich haben Forscher, die mit einer verwandten Art, Nilaparvata lugens, arbeiten, die Eier, die sie für Mikroinjektionen verwendeten, direkt aus dem Blatt gewonnen und die injizierten Eier im Blattgewebe behalten, bis sie geschlüpftsind 17. Diese blattbasierte Methode bot zwar eine natürlichere Umgebung für die Embryonalentwicklung, erhöhte aber auch die Wahrscheinlichkeit von Infektionen und Eischäden während des Entnahmeprozesses. Das hier vorgestellte künstliche Eiablagesystem sorgt für eine gleichmäßigere Umgebung und verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die Eier durch die Handhabung beschädigt werden. Durch das Aufstellen der Eiablagebecher am Freitag wurde der Großteil der eiförmigen Eizellen während einer typischen Arbeitswoche gesammelt, was denjenigen zugute kam, die die Mikroinjektionsarbeit durchführten. Ein Vorbehalt bei dieser Methode ist jedoch, dass der Mangel an Nährstoffen in der 10%igen Saccharoselösungsdiät schließlich die Gesundheit der Insekten beeinträchtigt und die Weibchen in den Bechern normalerweise nach nur 10 Tagen absterben. Auch die Qualität der Eier beginnt nach 6 Tagen nachzulassen, was sich in einer Zunahme toter oder ungesund aussehender Eier zeigt. Daher ist es wichtig, die Eier, die für Mikroinjektionen verwendet werden, selektiv auszuwählen und die Weibchen nach dem 6. Tag nicht mehr zu behalten.
Überlebensrate und Luftfeuchtigkeit Zwei Faktoren scheinen für das embryonale Überleben durch den Mikroinjektionsprozess entscheidend zu sein. Die größte Herausforderung beim Umgang mit P. maidis-Embryonen besteht darin, zu verhindern, dass sie nach der Entnahme aus dem Eiablagemedium und während der Mikroinjektion austrocknen. Da die Eier in der Regel im Pflanzengewebe abgelegt werden, fehlt ihnen eine ausreichende Schale, um eine Austrocknung zu verhindern. Selbst in der befeuchteten Haube gingen ganze Eier durch Austrocknung verloren. Aber auch eine zu hohe Luftfeuchtigkeit könnte die Mikroinjektionen beeinträchtigen, wenn sich Wasser auf dem doppelseitigen Klebeband oder auf dem Endoskop ansammelt. Leider war die Dehydrierung der Eizellen während des Mikroinjektionsprozesses in der Regel nicht leicht zu erkennen, und sie erschienen häufig normal, bis sie 2 oder 3 Tage später vollständig transparent wurden und keine Anzeichen von Entwicklung zeigten.
Auch die Qualität der Nadeln scheint eine wichtige Rolle für das Überleben zu spielen. Die Nadel sollte abgeschrägt werden, um unnötige Schäden am Ei zu minimieren. Wenn die Nadel blockiert ist, wird die Nadel in der Regel wieder in einen funktionsfähigen Zustand versetzt, indem die Clearing-Funktion am Injektor verwendet wird, während die Nadelspitze mit einem angefeuchteten Pinsel sanft gestreicht wird (siehe Schritt 4.7). Unabhängig davon wird empfohlen, nur winzige Mengen der Injektionslösung (~0,25 μL) in jede Nadel zu geben und alle paar Objektträger (~50-60 Eier) auf eine neue Nadel umzusteigen, um sicherzustellen, dass die Nadelqualität während des gesamten Injektionsvorgangs erhalten bleibt.
Erfolgreiche Generierung eines Knockout-Phänotyps Um die Keimzellen erfolgreich zu transformieren, müssen die Mikroinjektionen des Embryos in der Regel so früh wie möglich vor der Zellularisierung erfolgen. Je nach Insektenart reicht das Zeitfenster für die Durchführung der Mikroinjektionen von nur wenigen Stunden bis zu einem ganzen Tag14,15,20. Es ist noch unklar, wann P. maidis-Embryonen zellularisiert werden. Der Cas9-vermittelte Knockout wurde an Embryonen im Alter von 4 h nach der Eiablage (pel) bis zu 16 h pel getestet, und die erwarteten Phänotypen wurden in allen Experimenten beobachtet, was darauf hindeutet, dass alle Mikroinjektionen innerhalb des Vorzellurisierungsfensters durchgeführt wurden.
Das P. maidis-Ortholog des Augenfarbengens, weiß, wurde ausgewählt, weil man davon ausging, dass der Knockout-Phänotyp aufgrund seiner zellautonomen Natur bei injizierten Patienten leicht zu screenen ist. Wie erwartet, waren sowohl Mosaik- als auch Total-Knockouts bei den Embryonen, die die Injektionsmischung erhielten, die Cas9- und Guide-RNAs enthielt, eindeutig identifizierbar. Leider schlüpften keine Injizierten mit vollständigem Knockout, und eine Massenpaarung überlebender Injektoren brachte keine weißäugigen Nachkommen hervor. Später wurde jedoch erfolgreich eine mutierte Linie generiert, indem ein anderes Gen angegriffen wurde (Klobasa et al., in Arbeit). Dies würde darauf hindeuten, dass das Scheitern der Etablierung einer weißen Mutantenlinie höchstwahrscheinlich entweder auf Off-Target-Effekte (d.h. Cas9, das wichtige Regionen an anderer Stelle im Genom schneidet) zurückzuführen ist, die eine eng miteinander verbundene letale Mutation erzeugen, oder auf eine unvorhergesehene kritische Rolle von Weiß in P. maidis.
Phänotypische und molekulare Daten (Abbildung 8 und Abbildung 9) bestätigen, dass in einer Stichprobe injizierter Embryonen ein signifikanter Knockout im weißen Locus entstanden ist, der zu einem vollständigen Verlust der Genfunktion führen würde. Während Mutationen in Weiß bei einigen Arten lebensfähig sind, gibt es einen Präzedenzfall dafür, dass eine reduzierte weiße Aktivität nachteilig ist21,22. Off-Target-Effekte können jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Die Vorhersage wahrscheinlicher Off-Targets erfordert genaue Genomsequenzdaten23, was der aktuelle Stand der genomischen Ressourcen in P. maidis derzeit unmöglich macht. Unabhängig davon können mit diesen neuen Methoden andere Zielgene sicher getestet werden, sogar in Richtung traditionellerer Transgenese, um diesem schädlichen Schädling neue genetische Werkzeuge zur Verfügung zu stellen.

Die Maiszikade, Peregrinus maidis, ist ein wirtschaftlich bedeutsamer Schädling von Mais 1,2,3. Sie verursachen direkte physische Schäden an der Pflanze, sowohl während der Nahrungsaufnahme mit ihren stechend-saugenden Mundwerkzeugen als auch während der Fortpflanzung, wenn sie ihre Embryonen direkt in das Pflanzengewebe legen 2,4. Trotz der vielfältigen direkten Schädigung von Nutzpflanzen haben diese Insekten den größten Einfluss auf die Pflanzengesundheit indirekt, da sie als Vektor des Maismosaikvirus (MMV) und des Maisstreifenvirusfungieren 5,6. MMV ist in der Lage, sich im Körper seines P. maidis-Vektors zu vermehren, so dass das Virus in einzelnen Insekten während ihres gesamten Lebens persistieren kann, so dass sie das Virus weiterhin auf neue Wirtspflanzen übertragen können 7,8. Die gebräuchlichsten Methoden zur Bekämpfung von P. maidis und damit der Viren, die er überträgt, sind Insektizide.
Leider hat die Misswirtschaft dieser Produkte zur Entwicklung von Resistenzen beim Zielschädling sowie zur Verschmutzung der Umwelt geführt9. Daher sind neue Strategien erforderlich, um die Ernteverluste durch diese Insekten-Virus-Schädlings-Kombination zu reduzieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass RNA-Interferenz (RNAi) eine wirksame Kontrollmethode für P. maidis sein könnte, da sie auch bei der Aufnahme von doppelsträngiger RNA (dsRNA) anfällig für eine Herunterregulierung der Genexpression sind10. Der effektivste Weg, dsRNA auf dem Feld zu verabreichen, wäre jedoch über die Pflanzen, von denen sich die Insekten ernähren. Daher könnten Nutzpflanzen immer noch anfällig für Viren sein, die die Insekten bereits in sich tragen. Mit dem Aufkommen der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung sind neue Schädlingsbekämpfungsstrategien möglich, darunter der Cas9-basierte Gene Drive11,12, der verwendet werden könnte, um die Größe einer Schädlingspopulation zu reduzieren oder diese Population durch Individuen zu ersetzen, die gegen die Viren resistent sind, die sie übertragen.
Die Entwicklung und der Einsatz jeglicher Art von Gene-Drive-Systemen erfordert jedoch die Entwicklung transgener Techniken. Solche Methoden waren für die Durchführung von RNAi-Experimenten in P. maidis nicht erforderlich, da angenommen wird, dass dsRNAs und/oder siRNAs aufgrund der Effizienz von RNAi in P. maidis Zellmembranen durchdringen können 10,13. Dies gilt nicht für die DNAs und/oder Proteine, die in der traditionellen Transgenese oder in der Cas9-basierten Genom-Editierung verwendet werden, die beide eine Vorstufe für die Erzeugung von Insekten wären, die einen Gene Drive tragen. Um eine Genom-Editierung oder andere Formen der Keimbahntransformation zu erreichen, werden diese DNAs und Proteine idealerweise während des synzytialen Blastoderm-Stadiums, bevor der Insektenembryo zellularisiert, in Embryonen mikroinjiziert. Das Timing ist entscheidend, denn das Synzytialstadium ist der früheste Teil der Entwicklung14,15. Da die Weibchen von P. maidis ihre Eier bevorzugt in Pflanzengewebe ablegen, kann die Entnahme ausreichender Mengen präzellulärer Embryonen für Mikroinjektionen arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein. Daher wurden neue Techniken entwickelt, um P. maidis-Embryonen vor der Zellularisierung schnell zu sammeln und zu mikroinjizieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 oz Containers</td>
			<td>Dart</td>
			<td>P100N</td>
			<td>Adult container for egg-laying setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-103</td>
			<td>Serves as collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-106</td>
			<td>For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>For handling planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspirator</td>
			<td>Fischer Technical</td>
			<td>LAV-3</td>
			<td>Vacuum for aspirating larger numbers of insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Spectrum LED Lights</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>GLP24FS/19W/LED</td>
			<td>Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>A36498</td>
			<td>Endonuclease for cutting planthopper genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Vinyl Tubing</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.</td>
			<td>Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn planthoppers</td>
			<td>North Carolina State University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Dr. Anna Whitfield&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch Double Sided Tape</td>
			<td>NA</td>
			<td>Holding eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early Sunglow corn</td>
			<td>Park Seed Company</td>
			<td>05093-PK-N</td>
			<td>Corn for rearing planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epTIPS Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjection System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td>Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Drosophila Agar</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>66-103</td>
			<td>Substrate for everything except egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4731</td>
			<td>Egg handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose LE Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-102</td>
			<td>Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifyer</td>
			<td>Homedics</td>
			<td>UHE-CM45</td>
			<td>For providing humidity in humidified hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>For holding injected embryos until hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing cages</td>
			<td>Bioquip (special order)</td>
			<td>Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)</td>
			<td>Cage for planthoppers on corn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Planthopper screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12-5</td>
			<td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td>For positioning microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td>For beveling injection needles / Used &#39;fine&#39; graded plate at 20&#176; angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>GT100 X-Y Gliding Table</td>
			<td>For positioning and moving embryos under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Paint Brush</td>
			<td>Testor #2 8733</td>
			<td>Sold in 3 pack 281206</td>
			<td>Fine paintbrushes for embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI-7</td>
			<td>For holding the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I41VLH3C8</td>
			<td>Rearing injectees until hatch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy Vector System I cloning kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>Cloning Pm white target site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides or coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-549-3</td>
			<td>Hold eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4200</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Glad ClingWrap Plastic Wrap</td>
			<td>NA</td>
			<td>Wrap the entire egg-laying chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>QF100-50-10</td>
			<td>For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen (White Organza Fabric)</td>
			<td>Joann Fabrics</td>
			<td>16023889</td>
			<td>For covering the adult container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>To make 10% sucorose solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing

Die Maiszikade, Peregrinus maidis, ist ein Schädling des Mais und ein Überträger mehrerer Maisviren. Bisher publizierte Methoden beschreiben die Auslösung von RNA-Interferenz (RNAi) in P. maidis durch Mikroinjektion von doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) in Nymphen und adulte Tiere. Trotz der Leistungsfähigkeit von RNAi sind Phänotypen, die mit dieser Technik erzeugt werden, transient und haben keine langfristige Mendelsche Vererbung. Daher muss der Werkzeugkasten von P. maidis um funktionelle genomische Werkzeuge erweitert werden, die die Produktion stabiler mutierter Stämme ermöglichen und den Forschern die Tür öffnen, um neue Bekämpfungsmethoden gegen diesen wirtschaftlich wichtigen Schädling einzusetzen. Im Gegensatz zu den dsRNAs, die für RNAi verwendet werden, können die Komponenten, die bei der CRISPR/Cas9-basierten Genom-Editierung und Keimbahntransformation verwendet werden, die Zellmembranen jedoch nicht ohne weiteres durchdringen. Infolgedessen müssen Plasmid-DNAs, RNAs und/oder Proteine in Embryonen mikroinjiziert werden, bevor der Embryo zellularisiert, was den Zeitpunkt der Injektion zu einem kritischen Faktor für den Erfolg macht. Zu diesem Zweck wurde eine Agarose-basierte Eiablagemethode entwickelt, die es ermöglicht, Embryonen von P. maidis-Weibchen in relativ kurzen Abständen zu ernten. In dieser Arbeit werden detaillierte Protokolle für die Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären P. maidis-Embryonen mit CRISPR-Komponenten (Cas9-Nuklease, die mit Guide-RNAs komplexiert wurde) vorgestellt, und die Ergebnisse des Cas9-basierten Gen-Knockouts eines P. maidis Augenfarbengens, weiß, werden vorgestellt. Obwohl diese Protokolle die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung in P. maidis beschreiben, können sie auch für die Herstellung transgener P. maidis durch Keimbahntransformation verwendet werden, indem einfach die Zusammensetzung der Injektionslösung verändert wird.

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Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Hierin werden Protokolle zur Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären Maiszikadenembryonen zum Zwecke der Modifikation ihres Genoms durch CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editierung oder zur Zugabe markierter transponierbarer Elemente durch Keimbahntransformation vorgestellt.

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Bisher wurde CRISPR nur bei einer Handvoll Hemipteren eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll könnte Forschern helfen, CRISPR und die Keimbahntransformation auch bei anderen Hemiptera-Arten anzuwenden. Dieses Protokoll wurde speziell für Insektenembryonen entwickelt, die empfindlich auf Austrocknung reagieren.Viele Schritte des Protokolls könnten möglicherweise die Ergebnisse bei anderen Insektenarten verbessern. Die Fähigkeit, transgene Zikaden zu erzeugen, öffnet die Tür für neuartige Bekämpfungsmethoden, wie z. B. die Erzeugung von Insekten, die keine Viren mehr übertragen können. Diese Technik wird revolutionär sein, um die Genfunktion bei anderen Schädlingen wie dem westlichen Blütenthrips zu untersuchen.Wir haben diese CRISPR-Technik für Thrips-Embryonen adaptiert – mit vielversprechenden Ergebnissen. Wir finden, dass Übung in diesem System für den Erfolg unerlässlich ist. Die hier gezeigten Methoden sollten, wenn sie routinemäßig durchgeführt werden, einen flexiblen Einsatz in einer Vielzahl von Umgebungen ermöglichen.Um eine Kammer für die erwachsenen Peregrinus maidis-Insekten zu bauen, schneiden Sie ein Loch in den Boden eines Ein-Unzen-Bechers und kleben Sie ein Sieb über das Loch für den Luftaustausch. Für die Selektion der eine Woche alten erwachsenen weiblichen Insekten saugen Sie die Kolonie eine Stunde lang in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen ab, bevor Sie die Insekten kurz auf Eis abkühlen lassen. Identifizieren Sie die Weibchen anhand des Ovipositors, der normalerweise dunkler ist als der Rest des Abdomens, auf der ventralen Seite des Abdomens.Übertragen Sie die Weibchen in den Becher, während sie gesammelt werden. Wenn 15 Weibchen ausgewählt wurden, versiegeln Sie den Becher mit einem fünf mal fünf Zentimeter großen Stück Paraffinwachsfilm. Tragen Sie 400 Mikroliter einer 10%igen Saccharoselösung auf die Oberseite der Folie auf und legen Sie ein zweites fünf mal fünf Zentimeter großes Stück Folie über die Lösung.Stellen Sie die adulte Kammer auf eine Eierauffangschale, wobei die Seite der Kunststoff-Paraffinwachsfolie in direktem Kontakt mit dem Eiablagemedium steht, und wickeln Sie die gesamte Eiablagekammer mit Plastikfolie ein, ohne die Luftlöcher zu verdecken. Stellen Sie die Kammer dann auf 25 Grad Celsius mit 70% Luftfeuchtigkeit und 14 Stunden Licht, 10 Stunden Dunkelzyklus. Für die Embryonenentnahme kleben Sie nach der gewünschten Eiablagezeit einen 15 Millimeter großen Streifen doppelseitigen Klebebandes auf ein 22 x 30 Millimeter großes Deckglas und legen das Deckglas auf das Eiablagemedium der Eiablagekammer.Bewegen Sie mit einem feinen Pinsel und einem Präpariermikroskop einzelne halbtransparente Embryonen von der Agaroberfläche auf das doppelseitige Klebeband. Wenn etwa 25 Embryonen ausgewählt wurden, ordnen Sie die bananenförmigen Embryonen auf ihren Seiten an, wobei die größeren Enden auf das Klebeband geklebt werden. Für die Mikroinjektion der Embryonen wird zunächst das Deckglas auf eine 100 x 15 Milliliter große Petrischale mit 1%igem Agar unter einem Präpariermikroskop in einer befeuchteten Haube gelegt.Um den Injektionsdruck zu überprüfen, legen Sie die Spitze einer Quarz-Injektionsnadel in einen Tropfen Wasser und starten Sie den Injektionszyklus. Nachdem Sie die Druckeinstellung bestätigt haben, führen Sie die Nadel von der linken Seite des Deckglases in das größere Ende eines Embryos ein. Geben Sie die Injektionslösung in das Ei und ziehen Sie die Nadel schnell heraus.Wenn alle Eizellen injiziert wurden, legen Sie das Deckglas auf die Oberfläche einer neuen 1%igen Agar-Schale und stellen Sie die Schale in eine Feuchtigkeitskammer. Übertragen Sie die überlebenden Embryonen nach sechs Tagen mit sauberem Wasser und einer feinen Bürste in eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale mit wasserangefeuchtetem Filterpapier. Versiegeln Sie die Petrischale mit einer Paraffinwachsfolie aus Kunststoff und stellen Sie die Schlupfkammer in einen 25 Grad Celsius heißen Inkubator.Übertragen Sie nach sechs bis acht Tagen mit einem feinen Pinsel alle aufstrebenden Nymphen des ersten Stadiums in eine Petrischale mit Blattausschnitten und versiegeln Sie die Schale mit einer Paraffinwachsfolie aus Kunststoff. Nach 48 Stunden bei 25 Grad Celsius alle zwei Tage alten Nymphen mit einer feinen Bürste in einen Aufzuchtkäfig mit Maispflanzen umpflanzen. Wenn injizierte Insekten mit sichtbarem Phänotyp in ausreichender Anzahl gefunden werden, werden diese Insekten separat in einen Käfig gesperrt, um die Erholung des Zielmerkmals in der nächsten Generation zu maximieren.Ziehen Sie die Insekten unter den entsprechenden Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen auf, wobei Sie sie bei Bedarf regelmäßig auf frische Maispflanzen übertragen und die Nachkommen regelmäßig auf erwartete Phänotypen untersuchen, indem Sie Individuen, die den gewünschten Phänotyp aufweisen, in ihre eigenen Käfige setzen, um homozygote Linien zu etablieren. In dieser repräsentativen Analyse wurden innerhalb von vier Wochen insgesamt 6.483 Eier von insgesamt 645 Weibchen entnommen. Die Weibchen beginnen in der Regel nach zwei Tagen mit der Eiablage und liefern die meisten Eier vom vierten bis zum sechsten Tag, wobei sich die Eiablageaktivität am neunten Tag verlangsamt.Die Injektion von Cas9 nine hat keinen Einfluss auf die Entwicklung von P.maidis, da die Entwicklungsraten für Embryonen, die mit Injektionspuffer, Injektionspuffer mit Cas9 und Injektionspuffer mit Cas9 und drei Leit-RNAs behandelt wurden, ähnlich sind. Die Schraffurraten für die Puffer- und Cas9-Steuerelemente sind ebenfalls ähnlich. Die Schlupfraten von Individuen, die den Drei-Guide-Mix erhalten, sind jedoch in der Regel relativ niedrig.In diesem repräsentativen Experiment zeigten von den 71 Individuen, die sich entwickelten, 23 einen gewissen Grad an Pigmentverlust und neun schlüpften, was zu einer Knockout-Rate von etwa 30 % führte. Es wird erwartet, dass die Drei-Guide-Mischung etwa 180 Basenpaare aus dem weißen Locus entfernt, wie in den PCR-Produkten beobachtet wurde, die aus genomischer DNA amplifiziert wurden, die von injizierten Individuen isoliert wurde. sowie in den zugehörigen Sequenzdaten, die aus diesen Produkten generiert werden. Wir empfehlen die Verwendung von abgeschrägten Nadeln, um das Injektionstrauma zu minimieren. Wenn die Embryonen nach der Injektion undicht zu sein scheinen, untersuchen Sie Ihre Nadelspitzen, um bessere Ergebnisse zu erzielen.Fortgesetztes Üben wird das Überleben der Embryonen erhöhen. Bisher gibt es keine Publikationen, die die Keimbahntransformation bei Hemipteren beschreiben. Wir haben dieses Protokoll jedoch verwendet, um Cas9-exprimierende Zikaden herzustellen.Insgesamt öffnet die Fähigkeit, eine Keimbahntransformation bei Hemipteren durchzuführen, die Tür zu einer Vielzahl von genetischen Schädlingsbekämpfungsstrategien, wodurch der Einsatz von Insektiziden reduziert wird.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Forschung

Biotechnik

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Produktion von gentechnisch syrischen Goldhamster durch man Injektion des Komplexes CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genom Bearbeitung von Saccharomyces cerevisiae und die Schaffung von Hefe Pixel Kunst

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospektion mikrobielle Stämme für Bioremediation und Probiotika Entwicklung für Metaorganismus Forschung und Konservierung

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...