Name: microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

אוניברסיטת צפון קרוליינה, המחלקה לאנטומולוגיה ופתולוגיה של צמחים, היא חלק מצוות התומך בתוכנית בעלי הברית של החרקים של DARPA. הדעות, הדעות ו/או הממצאים המובעים הם של המחברים ואין לפרש אותם כמייצגים את ההשקפות או המדיניות הרשמיות של משרד ההגנה או ממשלת ארה"ב. המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים. MDL, DR ו-AEW הגו את הפרויקט וסיפקו מימון, רכישה, ניהול פרויקטים ומשאבים. FC, WK, NG ו-MDL הגו ועיצבו את ניסויי המיקרו-הזרקה; OH הגה ועיצב את שיטת הטלת הביצים. FC ו-WK ביצעו את הניסויים; FC ו-WK ניתחו את התוצאות; ו-FC, WK, NG ו-MDL כתבו את כתב היד. המחברים רוצים להודות במיוחד לקייל סוזנסקי וויקטוריה ברנט על עזרתם בשמירה על מושבות פ. מיידיס.

1. גידול ברמת מושבה של מבוגרים P. maidis
<ol><li>שתול לפחות ארבעה עציצי תירס בשבוע בכל כלוב גידול, עם 3-4 זרעים בכל עציץ. לגדול בסביבה נטולת חרקים.</li>
	<li>כאשר הצמחים הם ~ 5 שבועות, מניחים בתוך כלוב 30 ס"מ x 30 ס"מ x 60 ס"מ.</li>
	<li>השג כמות מספקת של P. maidis בוגרים (~ 500) ממעבדת מחקר או מהטבע, והכנס לכלוב חסין חרקים עם 9-12 צמחי תירס (3-4 עציצים).</li>
	<li>שמור על המושבה באינקובטור לגידול חרקים ב 25 ° C (± 1 ° C), עם לפחות 70% לחות ומחזור אור 14: 10.</li>
	<li>כדי ליצור מושבה מכויילת לגיל, הוציאו את כל הבוגרים הראשונים לאחר ארבעה ימים של הטלת ביצים, ואפשרו לעוברים המוטלים בכלוב לבקוע ולהזדקן באופן טבעי.</li>
	<li>העבירו חרקים בני 5 שבועות של P. maidis (בוגרים) לצמחי תירס טריים עבור תת-תרבות שבועית על-ידי איסוף עם שואף (איור 1). לאחר מכן, שחררו את הבוגרים לכלוב נקי עם צמחי תירס טריים. כדי לשמור על אספקה קבועה של צעירים למטרות ניסיוניות, הכינו כלובים טריים מכוילים לגיל מדי שבוע.</li>
	<li>השקו את הסירים בכלובים פעמיים ביום. יש לגזור מעת לעת גבעולים, להסיר חומר צמחי נרקב ולהחליף בעציצי תירס טריים לפי הצורך. הערה: עם תחזוקה נאותה, מושבה יכולה להימשך ~ 5 שבועות (כלומר, מספיק זמן עבור עוברים שהונחו בכלוב כדי להפוך לבוגרים).</li>
</ol>2. תא הטלת ביצים מבוסס אגרוז
<ol><li>הכינו כלים לאיסוף ביצים (אוביפוזיציה בינונית) על ידי מזיגה של 1% עם אגרוז במים לצלחות פטרי נקיות בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ. יש לאחסן את מדיום האוביפוזיציה בטמפרטורה של 4°C לאחר שהוא מתמצק.</li>
	<li>הכינו תמיסת סוכרוז 10% עם V להאכלת המבוגרים. אחסנו את תמיסת הסוכרוז בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש.</li>
	<li>צרו תא שיחזיק את המבוגרים על-ידי חיתוך חור בתחתית של אונקיה אחת (ראו טבלת חומרים) והדבקת מסך מעל החור לצורך החלפת אוויר (איור 2).</li>
	<li>חותכים סרט שעוות פרפין פלסטיק לריבועים בגודל 5X5 ס"מ; מניחים בצד 2 ריבועים לכל.</li>
	<li>אספו ~15 נקבות בוגרות בנות שבוע ממושבת P. maidis מכויילת גיל. כדי לבחור נקבות, בחנו את הצד הגחוני של הבטן, וחפשו את האוביפוזיטור, שהוא בדרך כלל כהה יותר משאר הבטן (איור 3). החזיקו בוגרים עד שעה בבקבוקון חרוטי של 15 מ"ל אם מקימים מספר תאי הטלת ביצים. מצננים את החרקים לזמן קצר על קרח לפני הסקס ומעבירים למיכל הבוגר. הערה: בדיקה זו יכולה להיעשות ללא מיקרוסקופ. נקבות בוגרות שהספיקו להאכיל ולהזדווג גם הן בדרך כלל בעלות בטן גדולה יותר מזכרים בוגרים והן צייתניות יותר; לפיכך, ניתן לבחור אותם בקלות רבה יותר מתוך אוכלוסיית כלובים.</li>
	<li>העבירו את הנקבות למיכל בוגר, ואטמו את הכוס בשכבה אחת של שכבת שעוות פרפין מפלסטיק על-ידי מתיחה אחידה של הכוס פי 3-4 מגודלה המקורי (איור 4A,B).</li>
	<li>מרחו 400 μL של תמיסת סוכרוז 10% w/v על החלק העליון של אטם סרט שעוות פרפין מפלסטיק, והוסיפו שכבה שנייה של שכבת שעוות פרפין מפלסטיק, תוך מתיחת סרט שעוות הפרפין מפלסטיק בדיוק כפי שלמעלה (איור 4C,D). הערה: הכריך של סרט שעוות פרפין מפלסטיק מתוח לוחץ על תמיסת הסוכרוז, שהיא חשובה מאוד להאכלה בוגרת, אך לא תמנע מהנקבות לחדור את האוביפוזיטורים שלהן כל הדרך למדיום האוביפוזיציה.</li>
	<li>הניחו את התא הבוגר על צלחת איסוף ביצים עם צד סרט שעוות פרפין מפלסטיק ישירות על מדיום האוביפוזיציה, ועטפו את כל תא הטלת הביצים בניילון נצמד מבלי לכסות את חורי האוויר, שכן אלה נדרשים להחלפת אוויר (איור 5).</li>
	<li>יש לדגור על כל תא הטלת ביצים בטמפרטורה של 25°C עם 70% לחות ומחזור אור של 14:10.</li>
	<li>החליפו את הכריך של סרט שעוות פרפין מפלסטיק ותמיסת סוכרוז 10% עם סוכרוז מדי יום, והוציאו את כל המים שהצטברו בתוך הכוס.</li>
</ol>3. איסוף עוברים ויישורם בסביבה עם לחות גבוהה
<ol><li>הגדר מערכת מיקרו-הזרקה מבוססת סטריאומיקרוסקופ בחלל לח או מכסה מנוע (מכסה מנוע לח; איור 6) כדי להבטיח שסביבת העבודה תשיג לפחות 70% לחות לאורך כל תהליך המיקרו-הזרקה.</li>
	<li>בדוק את מדיום oviposition עבור ביצים לאחר תקופת הטלת הביצים הרצויה. עשו זאת במכסה מנוע לח או בסביבה לחה אחרת. הערה: תקופת הטלת הביצים המשמשת בדרך כלל הייתה לילה, משעה 18:00 עד 10:00, ונמשכה ~ 16 שעות.</li>
	<li>אם ביצים מוטלות באגרוז, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לחפור אותן בזהירות, והניחו אותן על פני השטח של האגרוז כדי לשמור עליהן לחות (איור 7A).</li>
	<li>החל רצועה של סרט דו-צדדי בגודל 1 מ"מ x 15 מ"מ על כיסוי בגודל 22 מ"מ x 30 מ"מ (איור 7B). הניחו את סרט הכיסוי כלפי מעלה על מדיום האוביפוזיציה (איור 7C).</li>
	<li>הרימו כל ביצה בנפרד ממשטח האגר, ועברו לסרט הדו-צדדי בעזרת מברשת עדינה. הסר את כל הביצים כי הם לבנים לחלוטין או יש צבע שחור עליהם. ביצים בריאות יהיו שקופות למחצה.</li>
	<li>הניחו את הביצים בצורת בננה על צידן, כשהקצה הגדול יותר תקוע על הסרט הדו-צדדי (איור 7D). הערה: יש לשמור תמיד את הביצים בסביבה עם לחות גבוהה, כגון צלחת פטרי יצוקה עם שכבה של 1% אגר בתחתית.</li>
</ol>4. הכנת ריאגנטים CRISPR ומחטי הזרקה
<ol><li>משוך מחטי קוורץ באמצעות מושך מיקרופיפטה מסוג Flaming/Brown.</li>
	<li>משופעים את מחטי הקוורץ באמצעות שיפוע מיקרופיפטה.</li>
	<li>השתמשו בסרט דביק דו-צדדי כדי לאבטח מחטים שנמשכו במיכל שקוף, כגון צלחת פטרי, עד שהן מוכנות לשימוש.</li>
	<li>הכן את תמיסת ההזרקה על ידי שילוב של 0.5 μL של חלבון Cas9 (תמיסת מלאי של 5 מיקרוגרם/μL) ו-0.5 μL של sgRNA (תמיסת מלאי של 4 מיקרוגרם/μL; ראה טבלת חומרים) עם 1 μL של חיץ אדום פנול בנפח סופי של 5 μL. כדי לזרז חלקיקים שעלולים לסתום את המחט, מערבלים את התמיסה לזמן קצר, וצנטריפוגה למשך 3 דקות במהירות מרבית.</li>
	<li>ממלאים את מחט ההזרקה, דואגים להשאיר את תערובת ההזרקה ליד הקצה המחודד של המחט. הסר בועות, אם בכלל, מקצה המחט.</li>
	<li>הניחו בזהירות את המחט הממולאת לאחור במחזיק המחט, והדקו את צווארון הנירוסטה כדי להחזיק את המחט בבטחה במקומה במהלך מיקרו-הזרקה.</li>
	<li>צור זרימה אמינה של תמיסת הזרקה מהמחט על ידי ליטוף עדין של הקצה המשופע עם מברשת צבע עדינה ולחה, תוך העברת פרצי לחץ אוויר למחט באמצעות מערכת ההזרקה. הערה: המחט מוכנה להזרקה כאשר תערובת ההזרקה יכולה לעזוב את הקצה בכמויות קטנות.</li>
</ol>5. מיקרו-הזרקה וטיפול לאחר הזרקה
<ol><li>הכינו משטח מיקרו-הזרקה על ידי מילוי צלחת פטרי נקייה בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ באגר 1% ליצירת שכבה שטוחה של אגר עם החלק העליון של המנה.</li>
	<li>הניחו על מצע האגר פתק שהוכן מראש עם ~25 עוברים (איור 8A). הערה: כל שלבי ההזרקה חייבים להתבצע בתוך מכסה מנוע לח (~ 70% לחות).</li>
	<li>בדוק את לחץ ההזרקה על ידי הנחת קצה המחט בטיפת מים והתחלת מחזור ההזרקה. הערה: כמות קטנה של תמיסת הזרקה אמורה להתפזר לתוך המים אם הגדרת הלחץ נכונה (איור 8B).</li>
	<li>הכניסו את המחט לקצה הגדול יותר של העובר, כשהיא מתקרבת מצד שמאל של המכסה (איור 8C). העבירו את תמיסת ההזרקה לתוך הביצית, ושלפו את המחט במהירות.</li>
	<li>לאחר הזרקת כל הביצים, הניחו את הכיסוי על פני צלחת אגר חדשה 1%, והעבירו את התבשיל לתא לחות (איור 9).</li>
</ol>6. דגירה ובקיעה של עוברים
<ol><li>שים את תא הבקיעה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס למשך 6 ימים.</li>
	<li>העבירו את כל העוברים ששרדו, בעזרת מים נקיים ומברשת עדינה, לצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ עם נייר פילטר לח במים המכסה את תחתית המנה. אטמו את צלחת הפטרי עם סרט שעוות פרפין מפלסטיק, והחזיקו בטמפרטורה של 25°C כדי לאפשר לעוברים לבקוע. התחל לבדוק את העוברים 6 ימים לאחר ההזרקה להישרדות. הערה: נימפות אינסטאר ראשונות יתחילו לבקוע בסביבות היום השמיני.</li>
	<li>מעבירים נימפות, בעזרת מברשת עדינה, לצלחת פטרי המכילה גזירי עלים. מכסים את המנה, ואוטמים בסרט שעוות פרפין מפלסטיק.</li>
	<li>לדגור על צלחת אטומה של אבקועים על ייחורי עלים במשך 48 שעות ב 25 ° C.</li>
	<li>העבירו את כל הנימפות בנות היומיים מסבב זריקות לכלוב גידול עם צמחי תירס באמצעות מברשת עדינה. אם מזריקים עם פנוטיפ נראה לעין מתאוששים במספרים מספיקים, החזירו אותם בנפרד כדי למקסם את ההתאוששות של תכונת המטרה בדור הבא. אחרת, לבצע הזדווגות המונית של כל הזריקים. הערה: הניחו את האבקועים בעדינות במערבולת של צמח התירס כדי לספק מקלט ולהבטיח לחות נאותה של סביבתם הקרובה.</li>
	<li>לגדל את החרקים בתנאים שתוארו לעיל, תוך הבטחת טמפרטורה נאותה, לחות, והעברות קבועות לצמחי תירס טריים.</li>
	<li>צאצאי מסך לפנוטיפים צפויים. הכניסו אנשים המציגים את הפנוטיפ הרצוי לכלוב משלהם כדי ליצור קווים הומוזיגוטיים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Namba, R., Higa, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+studies+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+in+Hawaii.">Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii.</a> Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).</li><li>Singh, B. U., Seetharama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+interactions+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+Ashm.(Homoptera:+Delphacidae)+in+maize+and+sorghum+agroecosystems.">Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems.</a> Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).</li><li>Tsai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+a+corn+disease+in+Florida+transmitted+by+Peregrinus+maidis.">Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis.</a> Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).</li><li>Chelliah, S., Basheer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+studies+of+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+(Araeopidae:+Homoptera)+on+sorghum.">Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum.</a> Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).</li><li>Lastra, J., Esparza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+vesicular+stomatitis+virus+in+the+leafhopper+Peregrinus+maidis+(Ashm.),+a+vector+of+a+plant+rhabdovirus.">Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus.</a> Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).</li><li>Nault, L. R., Ammar, E. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leafhopper+and+planthopper+transmission+of+plant+viruses.">Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).</li><li>Ammar, E. -. D., Tsai, C. -. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+acquisition+and+titer+of+Maize+mosaic+rhabdovirus+in+its+vector,+Peregrinus+maidis+(Hemiptera:+Delphacidae).">Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae).</a> Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).</li><li>Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+residual+effects+of+seven+insecticides+on+Dalbulus+maidis+(Homoptera:+Cicadellidae)+and+Peregrinus+maidis+(Homoptera:+Delphacidae).">Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae).</a> Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).</li><li>Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+RNAi+methods+for+Peregrinus+maidis,+the+corn+planthopper.">Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper.</a> PloS One. 8 (8), 70243 (2013).</li><li>Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technology:+concerning+RNA-guided+gene+drives+for+the+alteration+of+wild+populations.">Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations.</a> Elife. 3, 03401 (2014).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+maize+mosaic+virus+to+planthopper+vectors+by+microinjection+increases+infection+efficiency+and+facilitates+functional+genomics+experiments+in+the+vector.">Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector.</a> Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).</li><li>Kimelman, D., Martin, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+patterning+in+early+development:+three+strategies.">Anterior-posterior patterning in early development: three strategies.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).</li><li>Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+insect+development:+to+the+hemimetabolous+paradigm.">Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 20 (4), 355-361 (2010).</li><li>Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCs+of+eye+color+in+Tribolium+castaneum:+orthologs+of+the+Drosophila+white,+scarlet,+and+brown+Genes.">The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes.</a> Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).</li><li>Xue, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+knockout+of+two+eye+pigmentation+genes+in+the+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(Hemiptera:+Delphacidae).">CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase.">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).</li><li>Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera,+embryos+for+germline+transformation,+or+CRISPR/Cas9+genome+editing.">Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).</li><li>Brent, C. S., Hull, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+eye+coloration+genes+in+the+western+tarnished+plant+bug+(Lygus+hesperus+Knight).">RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).</li><li>Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ABCs+of+eye+color+in+Helicoverpa+armigera+with+CRISPR/Cas9-induced+mutations.">Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas+systems+in+genome+editing:+methodologies+and+tools+for+sgRNA+design,+off-target+evaluation,+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects.">CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

איכות ותזונה של הטלת ביצים לאחרונה, חוקרים שעבדו עם מין קרוב, Nilaparvata lugens, השיגו את הביצים שבהן השתמשו למיקרו-הזרקות ישירות מהעלה, ושמרו את הביצים המוזרקות ברקמת העלה עד שבקעו17. בעוד שיטה מבוססת עלים זו סיפקה סביבה טבעית יותר להתפתחות עוברית, היא גם הגדילה את הסיכויים לזיהומים ולנזק לביציות במהלך תהליך ההסרה. מערכת האוביפוזיציה המלאכותית המוצגת כאן מספקת סביבה אחידה יותר ומפחיתה את הסיכוי לנזק לביצים מהטיפול. על ידי הצבת כוסות האוביפוזיט ביום שישי, רוב הביצים שנאספו במהלך שבוע עבודה טיפוסי, לטובת אלה שביצעו את עבודת המיקרו-הזרקה. אזהרה אחת לשיטה זו, עם זאת, היא כי חוסר חומרים מזינים בתזונה 10% תמיסת סוכרוז ישפיע בסופו של דבר על בריאותם של החרקים, והנקבות בכוסות בדרך כלל מתחילות למות לאחר 10 ימים בלבד. גם איכות הביצים מתחילה לרדת לאחר 6 ימים, כפי שמעידה עלייה בביצים מתות או לא בריאות למראה. כתוצאה מכך, חשוב להיות סלקטיביים של הביצים המשמשות microinjections ולא לשמור על הנקבות לאחר יום 6.
שיעור הישרדות ולחות נראה כי שני גורמים הם קריטיים להישרדות העובר באמצעות תהליך המיקרו-הזרקה. ההיבט המאתגר ביותר בטיפול בעוברי P. maidis הוא שמירה עליהם מפני התייבשות לאחר הסרתם ממדיום האוביפוזיציה ולאורך מיקרו-הזרקה. מכיוון שהביצים מוטלות בדרך כלל בתוך רקמת הצמח, חסרה להן קליפה מספקת למניעת התייבשות. אפילו במכסה המנוע הלח אבדו סטים שלמים של ביצים בגלל התייבשות. עם זאת, לחות גבוהה מדי עלולה להשפיע גם על המיקרו-הזרקות אם הצטברו מים על הסרט הדו-צדדי או על ההיקף. למרבה הצער, בדרך כלל לא היה קל להבחין בהתייבשות ביצים במהלך תהליך המיקרו-הזרקה, ולעתים קרובות הן נראו נורמליות עד יומיים או שלושה לאחר מכן, כאשר הן הפכו שקופות לחלוטין, ולא הראו סימני התפתחות.
נראה כי גם איכות המחטים משחקת תפקיד חשוב בהישרדות. המחט צריכה להיות משופעת כדי למזער נזק מיותר לביצה. כאשר המחט חסומה, שימוש בפונקציית הניקוי על המזרק תוך ליטוף עדין של קצה המחט עם מברשת צבע רטובה (ראה שלב 4.7) בדרך כלל מחזיר את המחט למצב תפקודי. בכל מקרה, מומלץ להכניס רק כמויות זעירות של תמיסת הזרקה (~0.25 μL) לכל מחט ולעבור למחט חדשה כל כמה שקופיות (~ 50-60 ביציות) כדי להבטיח שמירה על איכות המחט לאורך כל תהליך ההזרקה.
דור מוצלח של פנוטיפ נוקאאוט כדי להפוך בהצלחה את תאי הנבט, מיקרו-זריקות עובר בדרך כלל צריך להיעשות מוקדם ככל האפשר לפני צלולריזציה. בהתאם למיני החרקים, חלון הזמן להשלמת המיקרו-הזרקות נע בין כמה שעות בלבד ליום שלם14,15,20. עדיין לא ברור מתי עוברים עוברי P. maidis בצלולריזציה. נוקאאוט בתיווך Cas9 נבדק על עוברים בני 4 שעות לאחר הטלת ביצים (pel) עד 16 שעות pel, והפנוטיפים הצפויים נצפו בכל הניסויים, מה שמרמז על כך שכל המיקרו-הזרקות בוצעו בחלון הפרה-צלוריזציה.
אורתוטיפ P. maidis של הגן בצבע עיניים, לבן, נבחר מכיוון שפנוטיפ הנוקאאוט היה צפוי להיות קל לסינון בהזרקות בשל אופיו האוטונומי התא. ואכן, כצפוי, הן פסיפס והן נוקאאוט מוחלט היו ניתנים לזיהוי בבירור בקרב עוברים שקיבלו את תערובת ההזרקה המכילה Cas9 ורנ"א מנחה. למרבה הצער, לא בקעו מזריקים עם נוקאאוט מוחלט, והזדווגות המונית של מזריקים ששרדו לא הצליחה ליצור צאצאים לבני-עיניים. עם זאת, קו מוטנטי נוצר מאוחר יותר בהצלחה על ידי התמקדות בגן אחר (Klobasa et al., בתהליך). זה עשוי להצביע על כך שהכישלון לבסס קו מוטנטי לבן נובע ככל הנראה מהשפעות מחוץ למטרה (כלומר, Cas9 חותך אזורים חשובים במקומות אחרים בגנום) המייצרות מוטציה קטלנית הקשורה קשר הדוק, או מתפקיד קריטי בלתי צפוי עבור לבן ב- P. maidis.
נתונים פנוטיפיים ומולקולריים (איור 8 ואיור 9) מאשרים כי נוצר נוקאאוט משמעותי בלוקוס הלבן בדגימה של עוברים מוזרקים, מה שיגרום לאובדן מוחלט של תפקוד הגנים. יתר על כן, בעוד מוטציות בלבן הן בנות קיימא במינים מסוימים, יש תקדים לכך שפעילות לבנה מופחתת מזיקה21,22. עם זאת, לא ניתן לשלול לחלוטין השפעות מחוץ למטרה. חיזוי סביר של מטרות מחוץ למטרות דורש נתוני רצף גנום מדויקים23, מה שהמצב הנוכחי של המשאבים הגנומיים ב- P. maidis אינו מאפשר לבצע בשלב זה. בכל מקרה, עם שיטות חדשות אלה, בדיקת גני מטרה אחרים יכולה להיעשות בביטחון, אפילו לנוע לעבר טרנסגנזה מסורתית יותר במאמץ להביא כלים גנטיים חדשים למזיק מזיק זה.

צמח התירס, Peregrinus maidis, הוא מזיק חשוב מבחינה כלכלית של תירס 1,2,3. הם גורמים נזק פיזי ישיר לצמח, הן בעת האכלה עם איברי הפה המוצצים הנוקבים שלהם, והן במהלך הרבייה כאשר הם מטילים את עובריהם ישירות לתוך רקמת הצמח 2,4. למרות הנתיבים המרובים של נזק ישיר ליבולים, ההשפעה הגדולה ביותר שיש לחרקים אלה על בריאות היבול היא עקיפה, בכך שהם פועלים כווקטור של נגיף פסיפס תירס (MMV) ונגיף פס תירס 5,6. MMV מסוגל להשתכפל בגוף וקטור P. maidis שלו, ומאפשר לנגיף להתמיד בחרקים בודדים לאורך כל חייהם, כך שהם יכולים להמשיך להפיץ את הנגיף לצמחים מארחים חדשים 7,8. השיטות הנפוצות ביותר להדברת P. maidis, ובכך וירוסים זה וקטור, הם קוטלי חרקים.
למרבה הצער, ניהול כושל של מוצרים אלה גרם לפיתוח עמידות במזיק היעד כמו גם זיהום הסביבה9. לכן, יש צורך באסטרטגיות חדשות כדי להפחית את הפסדי היבול משילוב זה של חרקים/וירוסים-מזיקים. עבודות קודמות הראו כי הפרעות RNA (RNAi) יכולות להיות שיטת בקרה יעילה עבור P. maidis מכיוון שהם רגישים לירידה בוויסות בביטוי גנים אפילו בעת בליעת RNA דו-גדילי (dsRNA)10. עם זאת, הדרך היעילה ביותר לנהל dsRNA בשדה תהיה באמצעות הצמחים שהחרקים ניזונים מהם; לפיכך, יבולים עדיין יכולים להיות רגישים לכל וירוסים שהחרקים כבר נושאים. עם הופעת עריכת הגנום של CRISPR/Cas9, אסטרטגיות הדברה חדשות אפשריות, כולל כונן גנים מבוסס Cas911,12, שניתן להשתמש בו כדי להקטין את גודל אוכלוסיית המזיקים, או להחליף את האוכלוסייה האמורה בפרטים עמידים לנגיפים שהם וקטור.
עם זאת, פיתוח ופריסה של כל סוג של מערכת דחיפת גנים ידרוש פיתוח של טכניקות טרנסגניות. שיטות כאלה לא היו נחוצות לביצוע ניסויי RNAi ב- P. maidis מכיוון ש- dsRNA ו / או siRNA נחשבים כמסוגלים לחצות את קרום התא בשל יעילות ה- RNAi ב- P. maidis10,13. זה לא נכון לגבי הדנ"א ו/או החלבונים המשמשים בטרנסגנזה מסורתית או בעריכת גנים מבוססת Cas9, שכל אחד מהם יהיה סימן מקדים ליצירת חרקים הנושאים דחף גנטי. כדי לבצע עריכת גנים או צורות אחרות של טרנספורמציה של קו הנבט, דנ"א וחלבונים אלה מוזרקים באופן אידיאלי לעוברים בשלב הבלסטודרם הסינסיטיאלי, לפני שעובר החרק צלולריז. העיתוי הוא קריטי, מכיוון שהשלב הסינקטיאלי הוא החלק המוקדם ביותר של התפתחות14,15. מכיוון שנקבות P. maidis מעדיפות להטיל את ביציהן ברקמת הצמח, חילוץ כמויות מספיקות של עוברים קדם-תאיים למיקרו-הזרקות יכול להיות עתיר עבודה וגוזל זמן. לכן, פותחו טכניקות חדשות לאיסוף מהיר ולהזרקה זעירה של עוברי P. maidis לפני הצלולריזציה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 oz Containers</td>
			<td>Dart</td>
			<td>P100N</td>
			<td>Adult container for egg-laying setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-103</td>
			<td>Serves as collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-106</td>
			<td>For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>For handling planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspirator</td>
			<td>Fischer Technical</td>
			<td>LAV-3</td>
			<td>Vacuum for aspirating larger numbers of insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Spectrum LED Lights</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>GLP24FS/19W/LED</td>
			<td>Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>A36498</td>
			<td>Endonuclease for cutting planthopper genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Vinyl Tubing</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.</td>
			<td>Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn planthoppers</td>
			<td>North Carolina State University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Dr. Anna Whitfield&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch Double Sided Tape</td>
			<td>NA</td>
			<td>Holding eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early Sunglow corn</td>
			<td>Park Seed Company</td>
			<td>05093-PK-N</td>
			<td>Corn for rearing planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epTIPS Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjection System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td>Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Drosophila Agar</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>66-103</td>
			<td>Substrate for everything except egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4731</td>
			<td>Egg handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose LE Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-102</td>
			<td>Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifyer</td>
			<td>Homedics</td>
			<td>UHE-CM45</td>
			<td>For providing humidity in humidified hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>For holding injected embryos until hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing cages</td>
			<td>Bioquip (special order)</td>
			<td>Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)</td>
			<td>Cage for planthoppers on corn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Planthopper screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12-5</td>
			<td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td>For positioning microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td>For beveling injection needles / Used &#39;fine&#39; graded plate at 20&#176; angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>GT100 X-Y Gliding Table</td>
			<td>For positioning and moving embryos under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Paint Brush</td>
			<td>Testor #2 8733</td>
			<td>Sold in 3 pack 281206</td>
			<td>Fine paintbrushes for embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI-7</td>
			<td>For holding the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I41VLH3C8</td>
			<td>Rearing injectees until hatch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy Vector System I cloning kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>Cloning Pm white target site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides or coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-549-3</td>
			<td>Hold eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4200</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Glad ClingWrap Plastic Wrap</td>
			<td>NA</td>
			<td>Wrap the entire egg-laying chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>QF100-50-10</td>
			<td>For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen (White Organza Fabric)</td>
			<td>Joann Fabrics</td>
			<td>16023889</td>
			<td>For covering the adult container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>To make 10% sucorose solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing

צמח התירס, Peregrinus maidis, הוא מזיק של תירס ווקטור של מספר נגיפי תירס. שיטות שפורסמו בעבר מתארות את הפעלת הפרעות RNA (RNAi) ב- P. maidis באמצעות מיקרו-הזרקה של RNA דו-גדילי (dsRNAs) לנימפות ולמבוגרים. למרות כוחו של RNAi, פנוטיפים הנוצרים באמצעות טכניקה זו הם חולפים וחסרים תורשה מנדליאנית ארוכת טווח. לכן, יש להרחיב את ארגז הכלים של P. maidis כך שיכלול כלים גנומיים פונקציונליים שיאפשרו ייצור זנים מוטנטיים יציבים, ויפתחו את הדלת לחוקרים להביא שיטות הדברה חדשות למזיק חשוב מבחינה כלכלית זו. עם זאת, שלא כמו dsRNA המשמשים עבור RNAi, הרכיבים המשמשים בעריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 וטרנספורמציה של קו הנבט אינם חוצים בקלות את קרום התא. כתוצאה מכך, דנ"א פלסמיד, רנ"א ו / או חלבונים חייבים להיות מוזרקים במיקרו לעוברים לפני שהעובר צלולריז, מה שהופך את תזמון ההזרקה לגורם קריטי להצלחה. לשם כך פותחה שיטת הטלת ביצים מבוססת אגרוז המאפשרת לקצור עוברים מנקבות P. maidis בפרקי זמן קצרים יחסית. להלן מוצגים פרוטוקולים מפורטים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי P. maidis קדם-תאיים עם רכיבי CRISPR (נוקלאז Cas9 שהורכב עם RNA מנחה), ומוצגות תוצאות של נוקאאוט גנטי מבוסס Cas9 של גן צבע עיניים P. maidis, לבן. למרות שפרוטוקולים אלה מתארים עריכת גנום CRISPR/Cas9 ב- P. maidis, הם יכולים לשמש גם לייצור P. maidis מהונדס באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט פשוט על ידי שינוי הרכב תמיסת ההזרקה.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

עד כה, נעשה שימוש בקריספר רק בקומץ המיפטרנים. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לסייע לחוקרים ליישם טרנספורמציה של קריספר ותאי נבט במינים אחרים של המיפטרן. פרוטוקול זה פותח במיוחד עבור עוברי חרקים הרגישים להתייבשות.צעדים רבים בפרוטוקול עשויים לשפר את התוצאות במינים אחרים של חרקים. היכולת לייצר צמחים טרנסגניים פותחת את הדלת לשיטות בקרה חדשניות, כגון יצירת חרקים שאינם יכולים עוד להעביר וירוסים. טכניקה זו תהיה מהפכנית לחקר תפקוד גנים במזיקים אחרים, כגון תריפס הפרח המערבי.התאמנו טכניקת CRISPR זו לעוברי תריפס עם תוצאות מבטיחות. אנו מוצאים כי תרגול במערכת זו חיוני להצלחה. השיטות המוצגות כאן, כאשר הן מבוצעות באופן שגרתי, אמורות לאפשר שימוש גמיש במגוון הגדרות.כדי ליצור תא שיחזיק את החרקים הבוגרים Peregrinus maidis, חתכו חור בתחתית של אונקיה אחת והדביקו מסך מעל החור לצורך החלפת אוויר. לבחירת נקבות חרקים בוגרות בנות שבוע, שאפו את המושבה לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר למשך שעה, לפני שתצננו לרגע את החרקים על קרח. זהה את הנקבות על ידי נוכחות של ovipositor, שהוא בדרך כלל כהה יותר משאר הבטן, בצד הגחוני של הבטן.מעבירים את הנקבות לכוס בזמן שהן נאספות. לאחר שנבחרו 15 נקבות, אטמו את הכוס בחתיכה בגודל חמישה על חמישה סנטימטרים של סרט שעוות פרפין. מרחו 400 מיקרוליטר של תמיסת 10% סוכרוז על החלק העליון של היריעה, והניחו פיסת פילם שנייה בגודל חמישה על חמישה סנטימטרים מעל התמיסה.מניחים את התא הבוגר על צלחת איסוף ביצים עם צד סרט שעוות פרפין מפלסטיק במגע ישיר עם מדיום האוביפוזיציה, ועוטפים את כל תא הטלת הביצים בניילון נצמד מבלי לכסות את חורי האוויר. לאחר מכן, הניחו את התא על 25 מעלות צלזיוס עם 70% לחות ומחזור אור של 14 שעות, 10 שעות חושך. לאיסוף עוברים, לאחר תקופת הטלת הביצים הרצויה, יש למרוח רצועה אחת על 15 מילימטר של סרט דו-צדדי על מכסה בגודל 22 על 30 מ"מ ולהניח את החלקת הכיסוי על תווך האוביפוזיציה של תא הטלת הביצים.בעזרת מברשת עדינה ומיקרוסקופ מנתח, העבירו עוברים בודדים שקופים למחצה משטח האגר אל הסרט הדו-צדדי. לאחר שנבחרו כ-25 עוברים, סדרו את העוברים בצורת בננה בצידם כשהקצוות הגדולים יותר תקועים על סרט הדבק. למיקרו-הזרקה של העוברים, ראשית, הניחו את הכיסוי על צלחת פטרי בגודל 100 על 15 מיליליטר עם 1% אגר תחת מיקרוסקופ מנתח בתוך מכסה מנוע לח.כדי לבדוק את לחץ ההזרקה, הניחו את קצה מחט הזרקת הקוורץ בטיפת מים והתחילו את מחזור ההזרקה. לאחר אישור הגדרת הלחץ, מתקרב מצד שמאל של תלוש הכיסוי, הכנס את המחט לקצה הגדול יותר של עובר אחד. העבירו את תמיסת ההזרקה לתוך הביצית ושלפו במהירות את המחט.לאחר הזרקת כל הביצים, מניחים את הכיסוי על פני צלחת חדשה של 1% אגר ומניחים את התבשיל בתוך תא לחות. לאחר שישה ימים, השתמשו במים נקיים ובמברשת עדינה כדי להעביר את כל העוברים ששרדו לצלחת פטרי בגודל 35 על 10 מ"מ המכילה נייר פילטר לח במים. אוטמים את צלחת הפטרי בסרט שעוות פרפין מפלסטיק ומניחים את תא הבקיעה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס.לאחר שישה עד שמונה ימים, השתמשו במברשת עדינה כדי להעביר את כל הנימפות הראשונות לצלחת פטרי של גזירי עלים ואטמו את הצלחת בסרט שעוות פרפין מפלסטיק. לאחר 48 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, השתמשו במברשת עדינה כדי להעביר את כל הנימפות בנות היומיים לכלוב גידול עם צמחי תירס. אם מזריקים עם פנוטיפ נראה לעין מתאוששים במספרים מספיקים, כלאו חרקים אלה בנפרד כדי למקסם את ההתאוששות של תכונת המטרה בדור הבא.לגדל את החרקים בתנאי טמפרטורה ולחות מתאימים עם העברות קבועות לצמחי תירס טריים לפי הצורך, ולסנן את הצאצאים באופן קבוע עבור פנוטיפים צפויים, תוך הצבת פרטים המציגים את הפנוטיפ הרצוי בכלובים שלהם כדי ליצור קווים הומוזיגוטיים. בניתוח מייצג זה, נאספו בסך הכל 6, 483 ביצים מכלל 645 נקבות בארבעה שבועות. הנקבות בדרך כלל מתחילות להטיל ביצים לאחר יומיים ומספקות את רוב הביצים מהימים הרביעי עד השישי, כאשר פעילות הביציות מואטת עד היום התשיעי.Cas9 תשע זריקות אינן משפיעות על התפתחות P.maidis, שכן שיעורי ההתפתחות של עוברים שטופלו בחיץ הזרקה, חיץ הזרקה בתוספת Cas9, וחיץ הזרקה בתוספת Cas9 ושלושה RNA מנחים, דומים. גם שיעורי הצוהר של פקדי החיץ וה-Cas9 דומים. עם זאת, שיעורי הבקיעה של פרטים המקבלים את תערובת שלושת המדריכים הם בדרך כלל נמוכים יחסית.בניסוי מייצג זה, מתוך 71 פרטים שהתפתחו בהזרקת הנחיה, 23 הראו מידה מסוימת של אובדן פיגמנט ותשעה בקעו, מה שהביא לשיעור נוקאאוט של כ-30%. תמהיל שלושת המנחים צפוי להסיר כ-180 זוגות בסיסים מהלוקוס הלבן, כפי שנצפה בתוצרי ה-PCR המוגברים מ-DNA גנומי שבודד מפרטים מוזרקים, וכן בנתוני הרצף המשויכים המופקים ממוצרים אלה. אנו ממליצים על שימוש במחטים משופעות כדי למזער את טראומת ההזרקה. אם נראה שהעוברים דולפים לאחר ההזרקה, בדקו את קצות המחטים שלכם לקבלת תוצאות טובות יותר.תרגול מתמשך יגדיל את הישרדות העובר. נכון להיום, אין פרסומים המתארים טרנספורמציה של קו הנבט בהמיפטרנים. עם זאת, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לייצר פלנטהופרים המבטאים Cas9.בסך הכל, היכולת לבצע טרנספורמציה של קו הנבט בהמיפטרנים פותחת את הדלת למגוון רחב של אסטרטגיות הדברה גנטיות, ובכך מפחיתה את השימוש בקוטלי חרקים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a מולטיפלקס עריכת הגנום של סכביקוע cerevisiae ס ויצירת שמרים אמנות פיקסל

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

החיפוש אחר זנים מחיידקים לפיתוח בימתן ומוצרי פרוביוטיקה עבור המחקר והשימור של מטאפיאורגניזם

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...