कैस 9 जीनोम संपादन के लिए मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन

आज तक, CRISPR का उपयोग केवल मुट्ठी भर हेमिप्टेरान में किया गया है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को अन्य हेमिप्टेरन प्रजातियों में सीआरआईएसपीआर और जर्मलाइन परिवर्तन को लागू करने में मदद कर सकता है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से कीट भ्रूण के लिए विकसित किया गया था जो निर्जलीकरण के प्रति संवेदनशील हैं।

प्रोटोकॉल में कई कदम संभावित रूप से अन्य कीट प्रजातियों में परिणामों में सुधार कर सकते हैं। ट्रांसजेनिक प्लांटहॉपर उत्पन्न करने की क्षमता नए नियंत्रण विधियों के लिए दरवाजा खोलती है, जैसे कि कीड़े बनाना जो अब वायरस प्रसारित नहीं कर सकते हैं। यह तकनीक अन्य कीटों में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए क्रांतिकारी होगी, जैसे कि पश्चिमी फूल थ्रिप्स।

हमने आशाजनक परिणामों के साथ थ्रिप्स भ्रूण के लिए इस सीआरआईएसपीआर तकनीक को अनुकूलित किया है। हम पाते हैं कि इस प्रणाली में अभ्यास सफलता के लिए आवश्यक है। यहां दिखाए गए तरीके, जब नियमित रूप से किए जाते हैं, तो विभिन्न सेटिंग्स में लचीले उपयोग की अनुमति देनी चाहिए।

वयस्क पेरेग्रीनस मैडिस कीड़ों को पकड़ने के लिए एक कक्ष बनाने के लिए, एक औंस कप के तल में एक छेद काटें और हवा के आदान-प्रदान के लिए छेद पर एक स्क्रीन गोंद करें। एक सप्ताह की वयस्क मादा कीड़ों के चयन के लिए, बर्फ पर कीड़ों को थोड़ी देर के लिए ठंडा करने से पहले, कॉलोनी को एक घंटे के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में डुबोएं। अंडाकार की उपस्थिति से महिलाओं की पहचान करें, जो आमतौर पर पेट के उदर पक्ष पर पेट के बाकी हिस्सों की तुलना में गहरा होता है।

महिलाओं को कप में स्थानांतरित करें क्योंकि वे एकत्र किए जाते हैं। जब 15 महिलाओं का चयन किया गया है, तो पैराफिन मोम फिल्म के पांच से पांच सेंटीमीटर टुकड़े के साथ कप को सील करें। फिल्म के शीर्ष पर 10% सुक्रोज समाधान के 400 माइक्रोलीटर लागू करें, और समाधान के ऊपर फिल्म के दूसरे पांच से पांच सेंटीमीटर टुकड़े रखें।

वयस्क कक्ष को अंडाणु माध्यम के सीधे संपर्क में प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म साइड के साथ अंडे संग्रह डिश पर रखें, और हवा के छेद को कवर किए बिना प्लास्टिक रैप के साथ पूरे अंडे देने वाले कक्ष को लपेटें। फिर, कक्ष को 70% आर्द्रता और 14 घंटे प्रकाश, 10 घंटे अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें। भ्रूण संग्रह के लिए, वांछित अंडे देने की अवधि के बाद, 22 से 30 मिलीमीटर कवर स्लिप पर डबल-साइडेड टेप की एक बाई 15 मिलीमीटर पट्टी लागू करें और कवर स्लिप को अंडे देने वाले कक्ष के अंडाकार माध्यम पर रखें।

एक महीन ब्रश और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, व्यक्तिगत अर्ध-पारदर्शी भ्रूण को आगर की सतह से डबल-साइडेड टेप में ले जाएं। जब लगभग 25 भ्रूण ों का चयन किया गया है, तो केले के आकार के भ्रूण को टेप पर चिपके बड़े सिरों के साथ उनके किनारों पर व्यवस्थित करें। भ्रूण के सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए, सबसे पहले, कवर स्लिप को 100 बाई 15 मिलीलीटर पेट्री डिश फ्लश पर रखें, जिसमें 1% एगर एक ह्यूमिडिफाइड हुड के अंदर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे होता है।

इंजेक्शन के दबाव की जांच करने के लिए, क्वार्ट्ज इंजेक्शन सुई की नोक को पानी की एक बूंद में रखें और इंजेक्शन चक्र शुरू करें। दबाव सेटिंग की पुष्टि करने के बाद, कवर स्लिप के बाईं ओर से आने के बाद, सुई को एक भ्रूण के बड़े छोर में डालें। इंजेक्शन के घोल को अंडे में डालें और जल्दी से सुई को बाहर निकालें।

जब सभी अंडे इंजेक्ट किए गए हैं, तो कवर स्लिप को एक नए 1% आगर डिश की सतह पर रखें और डिश को आर्द्रता कक्ष में रखें। छह दिनों के बाद, किसी भी जीवित भ्रूण को 35 से 10 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए साफ पानी और ठीक ब्रश का उपयोग करें जिसमें पानी-नम फिल्टर पेपर हो। पेट्री डिश को प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म के साथ सील करें और हैचिंग चैंबर को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।

छह से आठ दिनों के बाद, किसी भी उभरती पहली इनस्टार अप्सराओं को पत्ती की कतरन के पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए एक बढ़िया ब्रश का उपयोग करें और प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म के साथ पकवान को सील करें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटों के बाद, दो दिन पुरानी अप्सराओं को मकई के पौधों के साथ पालन पिंजरे में स्थानांतरित करने के लिए एक बढ़िया ब्रश का उपयोग करें। यदि दृश्यमान फेनोटाइप वाले इंजेक्शन पर्याप्त संख्या में बरामद किए जाते हैं, तो अगली पीढ़ी में लक्ष्य विशेषता की वसूली को अधिकतम करने के लिए इन कीड़ों को अलग से पिंजरे में रखें।

कीड़ों को उचित तापमान और आर्द्रता की स्थिति में रखें, जिसमें आवश्यक रूप से ताजा मकई के पौधों में नियमित हस्तांतरण होता है, और अपेक्षित फेनोटाइप के लिए नियमित रूप से संतान की जांच करते हैं, वांछित फेनोटाइप का प्रदर्शन करने वाले व्यक्तियों को होमोजीगस लाइनों को स्थापित करने के लिए अपने स्वयं के पिंजरों में रखते हैं। इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, चार सप्ताह में कुल 645 महिलाओं से कुल 6,483 अंडे एकत्र किए गए थे। मादाएं आम तौर पर दो दिनों के बाद अंडे देना शुरू करती हैं और चार से छह दिनों तक अधिकांश अंडे प्रदान करती हैं, जिसमें अंडाकार गतिविधि नौ वें दिन तक धीमी हो जाती है।

कैस 9 नौ इंजेक्शन पी.मैडिस के विकास को प्रभावित नहीं करता है, क्योंकि इंजेक्शन बफर के साथ इलाज किए गए भ्रूण के लिए विकास दर, कैस 9 के साथ पूरक इंजेक्शन बफर, और कैस 9 और तीन गाइड आरएनए के साथ पूरक इंजेक्शन बफर, समान है। बफर और कैस 9 नियंत्रणों के लिए हैच दरें भी समान हैं। हालांकि, तीन-गाइड मिश्रण प्राप्त करने वाले व्यक्तियों की हैच दर आमतौर पर अपेक्षाकृत कम होती है।

इस प्रतिनिधि प्रयोग में, विकसित हुए 71 गाइड-इंजेक्शन वाले व्यक्तियों में से, 23 ने कुछ हद तक वर्णक हानि और नौ हैच दिखाए, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 30% की नॉकआउट दर थी, तीन-गाइड मिश्रण से सफेद टिड्डी से लगभग 180 बेस जोड़े को हटाने की उम्मीद है, जैसा कि इंजेक्शन वाले व्यक्तियों से अलग जीनोमिक डीएनए से प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों में देखा गया है। साथ ही उन उत्पादों से उत्पन्न संबंधित अनुक्रम डेटा में। हम इंजेक्शन आघात को कम करने के लिए बेवेल्ड सुइयों के उपयोग की सलाह देते हैं। यदि इंजेक्शन के बाद भ्रूण लीक होता है, तो बेहतर परिणामों के लिए अपनी सुई युक्तियों की जांच करें।

निरंतर अभ्यास भ्रूण के अस्तित्व में वृद्धि करेगा। आज तक, हेमिप्टेरान्स में जर्मलाइन परिवर्तन का वर्णन करने वाले कोई प्रकाशन नहीं हैं। हालांकि, हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग कैस 9-व्यक्त प्लांटहॉपर बनाने के लिए किया है।

कुल मिलाकर, हेमिप्टेरन में जर्मलाइन परिवर्तन करने की क्षमता आनुवंशिक कीट प्रबंधन रणनीतियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए दरवाजा खोलती है, जिससे कीटनाशकों का उपयोग कम हो जाता है।