Name: microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

La North Carolina State University, Dipartimento di Entomologia e Patologia Vegetale, fa parte di un team che supporta il programma Insect Allies della DARPA. I punti di vista, le opinioni e/o i risultati espressi sono quelli degli autori e non devono essere interpretati come rappresentanti le opinioni o le politiche ufficiali del Dipartimento della Difesa o del governo degli Stati Uniti. Gli autori non dichiarano interessi concorrenti. MDL, DR e AEW hanno concepito il progetto e fornito finanziamenti per l'acquisizione, l'amministrazione del progetto e le risorse. FC, WK, NG e MDL hanno ideato e progettato gli esperimenti di microiniezione; OH ha ideato e progettato il metodo della deposizione delle uova. FC e WK hanno eseguito gli esperimenti; FC e WK hanno analizzato i risultati; e FC, WK, NG e MDL hanno scritto il manoscritto. Gli autori desiderano offrire un ringraziamento speciale a Kyle Sozanski e Victoria Barnett per il loro aiuto nel mantenimento delle colonie di P. maidis.

1. Allevamento a livello di colonia di adulti di P. maidis
<ol><li>Piantare un minimo di quattro vasi di mais a settimana per gabbia di allevamento, con 3-4 semi per vaso. Crescere in un ambiente privo di insetti.</li>
	<li>Quando le piante hanno ~ 5 settimane, posizionare all'interno di una gabbia di 30 cm x 30 cm x 60 cm.</li>
	<li>Procurarsi una quantità sufficiente di adulti di P. maidis (~500) da un laboratorio di ricerca o in natura, e metterli in una gabbia a prova di insetto con 9-12 piante di mais (3-4 vasi).</li>
	<li>Mantenere la colonia in un'incubatrice per l'allevamento di insetti a 25 °C (± 1 °C), con almeno il 70% di umidità e un ciclo di luce di 14:10.</li>
	<li>Per generare una colonia calibrata per l'età, rimuovere tutti gli adulti iniziali dopo quattro giorni di deposizione delle uova e consentire agli embrioni deposti nella gabbia di schiudersi e invecchiare naturalmente.</li>
	<li>Spostare gli insetti P. maidis di 5 settimane (adulti) in piante di mais fresco per la sottocoltura settimanale raccogliendo con un aspiratore (Figura 1). Quindi, rilasciare gli adulti in una gabbia pulita con piante di mais fresche. Per mantenere una fornitura costante di giovani adulti per scopi sperimentali, preparare nuove gabbie calibrate per l'età ogni settimana.</li>
	<li>Innaffia i vasi nelle gabbie due volte al giorno. Tagliare periodicamente i gambi, rimuovere il materiale vegetale in decomposizione e sostituirli con vasi di mais freschi secondo necessità. NOTA: Con una corretta manutenzione, una colonia può durare ~ 5 settimane (cioè, abbastanza a lungo da consentire agli embrioni deposti nella gabbia di diventare adulti).</li>
</ol>2. Camera di deposizione delle uova a base di agarosio
<ol><li>Preparare piatti per la raccolta delle uova (mezzo di deposizione delle uova) versando l'1% p/v di agarosio in acqua in piastre di Petri pulite da 100 x 15 mm. Conservare il terreno di ovideposizione a 4 °C dopo la solidificazione.</li>
	<li>Preparare una soluzione di saccarosio al 10% con peso corporeo per l'alimentazione degli adulti. Conservare la soluzione di saccarosio a -20 °C per un mese.</li>
	<li>Crea una camera per contenere gli adulti tagliando un foro sul fondo di una tazza da 1 oz (vedi la tabella dei materiali) e incollando uno schermo sopra il foro per il ricambio d'aria (Figura 2).</li>
	<li>Tagliare la pellicola di cera di paraffina plastica in quadrati di 5 cm x 5 cm; Metti da parte 2 quadrati per ogni tazza.</li>
	<li>Raccogli ~ 15 femmine adulte di 1 settimana da una colonia di P. maidis calibrata per età. Per selezionare le femmine, esaminare il lato ventrale dell'addome e cercare l'ovopositore, che è tipicamente più scuro del resto dell'addome (Figura 3). Tenere gli adulti per un massimo di un'ora in un flaconcino conico da 15 ml se si installano più camere di deposizione delle uova. Raffreddare brevemente gli insetti sul ghiaccio prima di sessuare e trasferirli nel contenitore per adulti. NOTA: Questo esame può essere eseguito senza microscopio. Le femmine adulte che hanno avuto il tempo di nutrirsi e accoppiarsi hanno anche in genere addomi più grandi dei maschi adulti e sono più docili; quindi, possono essere più facilmente selezionati da una popolazione in gabbia.</li>
	<li>Trasferire le femmine in un contenitore per adulti e sigillare la tazza con 1 strato di pellicola di paraffina di plastica allungandola uniformemente 3-4 volte la sua dimensione originale (Figura 4A,B).</li>
	<li>Applicare 400 μL di soluzione di saccarosio al 10% p/v sulla parte superiore del sigillo del film di paraffina di plastica e aggiungere un secondo strato di pellicola di cera di paraffina plastica, allungando la pellicola di cera di paraffina plastica esattamente come sopra (Figura 4C, D). NOTA: Il sandwich di pellicola di paraffina di plastica allungata pressurizza la soluzione di saccarosio, che è molto importante per l'alimentazione degli adulti, ma non impedirà alle femmine di perforare i loro ovopositori fino in fondo nel mezzo di deposizione delle uova.</li>
	<li>Posizionare la camera per adulti su un piatto per la raccolta delle uova con il lato della pellicola di paraffina di plastica direttamente sul mezzo di deposizione delle uova e avvolgere l'intera camera di deposizione delle uova con pellicola trasparente senza coprire i fori d'aria, poiché questi sono necessari per il ricambio d'aria (Figura 5).</li>
	<li>Incubare ogni camera di deposizione delle uova a 25 °C con il 70% di umidità e un ciclo di luce 14:10.</li>
	<li>Cambiare il sandwich di pellicola di cera di paraffina di plastica e la soluzione di saccarosio al 10% p/v ogni giorno e rimuovere l'acqua che si accumula all'interno della tazza.</li>
</ol>3. Raccolta e allineamento degli embrioni in un ambiente ad alta umidità
<ol><li>Installare un sistema di microiniezione basato su stereomicroscopio in uno spazio o in una cappa umidificata (cappa umidificata; Figura 6) per garantire che l'ambiente di lavoro raggiunga almeno il 70% di umidità durante tutto il processo di microiniezione.</li>
	<li>Controllare il terreno di deposizione delle uova per le uova dopo il periodo di deposizione delle uova desiderato. Fallo in una cappa umidificata o in un altro ambiente umido. NOTA: Il periodo di deposizione delle uova tipicamente utilizzato è stato durante la notte, dalle 18:00 alle 10:00, della durata di ~ 16 ore.</li>
	<li>Se vengono deposte delle uova nell'agarosio, utilizzare una pinza fine per estrarle accuratamente e posizionarle sulla superficie dell'agarosio per mantenerle umide (Figura 7A).</li>
	<li>Applicare una striscia di nastro biadesivo da 1 mm x 15 mm su un coprislip di 22 x 30 mm (figura 7B). Posizionare il nastro adesivo rivolto verso l'alto sul mezzo di ovideposizione (figura 7C).</li>
	<li>Raccogli ogni singolo uovo dalla superficie dell'agar e spostalo sul nastro biadesivo usando un pennello sottile. Rimuovere eventuali uova completamente bianche o con colorazione nera su di esse. Le uova sane saranno semitrasparenti.</li>
	<li>Posizionare le uova a forma di banana su un lato, con l'estremità più grande incollata sul nastro biadesivo (Figura 7D). NOTA: Conservare sempre le uova in un ambiente ad alta umidità, come una piastra di Petri colata con uno strato di agar all'1% sul fondo.</li>
</ol>4. Preparazione dei reagenti CRISPR e degli aghi per iniezione
<ol><li>Tirare gli aghi al quarzo utilizzando un estrattore di micropipette di tipo Flaming/Brown.</li>
	<li>Smussare gli aghi di quarzo usando una smussatrice per micropipette.</li>
	<li>Utilizzare nastro adesivo biadesivo per fissare gli aghi tirati in un contenitore trasparente, come una capsula di Petri, fino al momento dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione per iniezione combinando 0,5 μL di proteina Cas9 (5 μg/μL di soluzione madre) e 0,5 μL di sgRNA (4 μg/μL di soluzione madre; vedere la Tabella dei Materiali) con 1 μL di tampone rosso fenolo in un volume finale di 5 μL. Per precipitare particelle che potrebbero ostruire l'ago, vortice brevemente la soluzione e centrifugare per 3 minuti alla massima velocità.</li>
	<li>Riempire l'ago per iniezione, avendo cura di lasciare la miscela di iniezione vicino all'estremità affusolata dell'ago. Rimuovere le bolle, se presenti, dalla punta dell'ago.</li>
	<li>Posizionare con cautela l'ago riempito nel supporto dell'ago e stringere il collare in acciaio inossidabile per tenere saldamente l'ago in posizione durante la microiniezione.</li>
	<li>Generare un flusso affidabile di soluzione iniettabile dall'ago accarezzando delicatamente la punta smussata con un pennello fine e inumidito, mentre eroga raffiche di pressione dell'aria all'ago con il sistema di iniezione. NOTA: L'ago è pronto per l'iniezione quando la miscela di iniezione può lasciare la punta in piccole quantità.</li>
</ol>5. Microiniezione e cura post-iniezione
<ol><li>Preparare una piattaforma di microiniezione riempiendo una capsula di Petri pulita da 100 x 15 mm con l'1% di agar per formare uno strato livellato di agar a filo con la parte superiore del piatto.</li>
	<li>Posizionare un foglietto precedentemente preparato con ~ 25 embrioni sulla piattaforma di agar (Figura 8A). NOTA: Tutte le fasi di iniezione devono essere eseguite all'interno di una cappa umidificata (~70% di umidità).</li>
	<li>Controllare la pressione di iniezione mettendo la punta dell'ago in una goccia d'acqua e avviando il ciclo di iniezione. NOTA: Una piccola quantità di soluzione iniettabile deve disperdersi nell'acqua se l'impostazione della pressione è corretta (Figura 8B).</li>
	<li>Inserire l'ago nell'estremità più grande dell'embrione, avvicinandosi dal lato sinistro del vetrino (Figura 8C). Somministrare la soluzione per iniezione nell'uovo ed estrarre rapidamente l'ago.</li>
	<li>Dopo aver iniettato tutte le uova, posizionare il coprislip sulla superficie di una nuova capsula di agar all'1% e trasferire la capsula in una camera di umidità (Figura 9).</li>
</ol>6. Incubazione e schiusa di embrioni
<ol><li>Mettere la camera di schiusa in un'incubatrice a 25 °C per 6 giorni.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni sopravvissuti, usando acqua pulita e un pennello fine, in una capsula di Petri di 35 mm x 10 mm con carta da filtro inumidita d'acqua che copre il fondo del piatto. Sigillare la capsula di Petri con pellicola di paraffina di plastica e tenerla a 25 °C per consentire agli embrioni di schiudersi. Iniziare a controllare gli embrioni 6 giorni dopo l'iniezione per la sopravvivenza. NOTA: Le prime ninfe inizieranno a schiudersi intorno al giorno 8.</li>
	<li>Trasferire le ninfe, usando un pennello fine, in una capsula di Petri contenente ritagli di foglie. Coprire il piatto e sigillare con pellicola di paraffina di plastica.</li>
	<li>Incubare il piatto sigillato dei piccoli su talee di foglie per 48 h a 25 °C.</li>
	<li>Trasferisci tutte le ninfe di 2 giorni da un ciclo di iniezioni a una gabbia di allevamento con piante di mais usando un pennello fine. Se le iniezioni con fenotipo visibile vengono recuperate in numero sufficiente, allevarle separatamente per massimizzare il recupero del tratto bersaglio nella generazione successiva. Altrimenti, eseguire l'accoppiamento di massa di tutti gli iniettei. NOTA: Posizionare delicatamente i piccoli nella spirale della pianta di mais per fornire rifugio e garantire la corretta umidità del loro ambiente immediato.</li>
	<li>Allevare gli insetti nelle condizioni sopra descritte, garantendo temperatura, umidità e trasferimenti regolari alle piante di mais fresco.</li>
	<li>Screening della progenie per i fenotipi attesi. Collocare gli individui che mostrano il fenotipo desiderato nella propria gabbia per stabilire linee omozigoti.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Namba, R., Higa, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+studies+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+in+Hawaii.">Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii.</a> Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).</li><li>Singh, B. U., Seetharama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+interactions+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+Ashm.(Homoptera:+Delphacidae)+in+maize+and+sorghum+agroecosystems.">Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems.</a> Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).</li><li>Tsai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+a+corn+disease+in+Florida+transmitted+by+Peregrinus+maidis.">Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis.</a> Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).</li><li>Chelliah, S., Basheer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+studies+of+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+(Araeopidae:+Homoptera)+on+sorghum.">Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum.</a> Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).</li><li>Lastra, J., Esparza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+vesicular+stomatitis+virus+in+the+leafhopper+Peregrinus+maidis+(Ashm.),+a+vector+of+a+plant+rhabdovirus.">Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus.</a> Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).</li><li>Nault, L. R., Ammar, E. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leafhopper+and+planthopper+transmission+of+plant+viruses.">Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).</li><li>Ammar, E. -. D., Tsai, C. -. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+acquisition+and+titer+of+Maize+mosaic+rhabdovirus+in+its+vector,+Peregrinus+maidis+(Hemiptera:+Delphacidae).">Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae).</a> Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).</li><li>Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+residual+effects+of+seven+insecticides+on+Dalbulus+maidis+(Homoptera:+Cicadellidae)+and+Peregrinus+maidis+(Homoptera:+Delphacidae).">Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae).</a> Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).</li><li>Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+RNAi+methods+for+Peregrinus+maidis,+the+corn+planthopper.">Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper.</a> PloS One. 8 (8), 70243 (2013).</li><li>Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technology:+concerning+RNA-guided+gene+drives+for+the+alteration+of+wild+populations.">Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations.</a> Elife. 3, 03401 (2014).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+maize+mosaic+virus+to+planthopper+vectors+by+microinjection+increases+infection+efficiency+and+facilitates+functional+genomics+experiments+in+the+vector.">Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector.</a> Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).</li><li>Kimelman, D., Martin, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+patterning+in+early+development:+three+strategies.">Anterior-posterior patterning in early development: three strategies.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).</li><li>Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+insect+development:+to+the+hemimetabolous+paradigm.">Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 20 (4), 355-361 (2010).</li><li>Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCs+of+eye+color+in+Tribolium+castaneum:+orthologs+of+the+Drosophila+white,+scarlet,+and+brown+Genes.">The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes.</a> Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).</li><li>Xue, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+knockout+of+two+eye+pigmentation+genes+in+the+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(Hemiptera:+Delphacidae).">CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase.">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).</li><li>Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera,+embryos+for+germline+transformation,+or+CRISPR/Cas9+genome+editing.">Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).</li><li>Brent, C. S., Hull, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+eye+coloration+genes+in+the+western+tarnished+plant+bug+(Lygus+hesperus+Knight).">RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).</li><li>Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ABCs+of+eye+color+in+Helicoverpa+armigera+with+CRISPR/Cas9-induced+mutations.">Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas+systems+in+genome+editing:+methodologies+and+tools+for+sgRNA+design,+off-target+evaluation,+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects.">CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qualità della deposizione delle uova e nutrizione Recentemente, i ricercatori che lavorano con una specie correlata, Nilaparvata lugens, hanno ottenuto le uova che hanno usato per le microiniezioni direttamente dalla foglia, mantenendo le uova iniettate nel tessuto fogliare fino a quando non ne hanno schiuse17. Mentre questo metodo a base di foglie ha fornito un ambiente più naturale per lo sviluppo embrionale, ha anche aumentato le possibilità di infezioni e danni alle uova durante il processo di rimozione. Il sistema di deposizione artificiale delle uova qui presentato fornisce un ambiente più uniforme e riduce le possibilità di danni alle uova dovuti alla manipolazione. Installando le coppette di deposizione delle uova il venerdì, la maggior parte delle uova ovoposite sono state raccolte durante una tipica settimana lavorativa, a beneficio di coloro che svolgono il lavoro di microiniezione. Un avvertimento a questo metodo, tuttavia, è che la mancanza di nutrienti nella dieta della soluzione di saccarosio al 10% finirà per influenzare la salute degli insetti, e le femmine nelle tazze di solito iniziano a morire dopo soli 10 giorni. Anche la qualità delle uova inizia a diminuire dopo 6 giorni, come evidenziato da un aumento delle uova morte o dall'aspetto malsano. Di conseguenza, è importante essere selettivi delle uova utilizzate per le microiniezioni e non tenere le femmine dopo il giorno 6.
Tasso di sopravvivenza e umidità Due fattori sembrano essere critici per la sopravvivenza embrionale attraverso il processo di microiniezione. L'aspetto più impegnativo della manipolazione degli embrioni di P. maidis è impedire loro di essiccarsi dopo la rimozione dal mezzo di deposizione delle uova e durante la microiniezione. Poiché le uova sono tipicamente deposte all'interno del tessuto vegetale, mancano di un guscio adeguato per prevenire la disidratazione. Anche nella cappa umidificata intere serie di uova sono andate perse a causa dell'essiccazione. Tuttavia, un'umidità eccessivamente elevata potrebbe anche influenzare le microiniezioni se l'acqua si accumulasse sul nastro biadesivo o sull'oscilloscopio. Sfortunatamente, la disidratazione delle uova di solito non era facile da notare durante il processo di microiniezione e spesso apparivano normali fino a 2 o 3 giorni dopo, quando diventavano completamente trasparenti, senza mostrare segni di sviluppo.
Anche la qualità dell'ago sembra svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza. L'ago deve essere smussato per ridurre al minimo danni inutili all'uovo. Quando l'ago è bloccato, l'uso della funzione di pulizia sull'iniettore mentre si accarezza delicatamente la punta dell'ago con un pennello inumidito (vedere il punto 4.7) in genere riporta l'ago a uno stato funzionale. Indipendentemente da ciò, si raccomanda di inserire solo piccole quantità di soluzione iniettabile (~0,25 μL) in ciascun ago e passare a un nuovo ago ogni pochi vetrini (~50-60 uova) per garantire che la qualità dell'ago sia mantenuta durante tutto il processo di iniezione.
Generazione di successo di un fenotipo knockout Per trasformare con successo le cellule germinali, le microiniezioni embrionali di solito devono essere eseguite il più presto possibile prima della cellularizzazione. A seconda della specie di insetto, la finestra temporale per completare le microiniezioni varia da solo un paio d'ore a un giorno intero14,15,20. Non è ancora chiaro quando gli embrioni di P. maidis subiscano la cellularizzazione. Il knockout mediato da Cas9 è stato testato su embrioni di 4 ore dopo la deposizione dell'uovo (pel) fino a 16 ore di pel, e i fenotipi attesi sono stati osservati in tutti gli esperimenti, suggerendo che tutte le microiniezioni sono state eseguite all'interno della finestra di precellurizzazione.
L'ortologo P. maidis del gene del colore degli occhi, bianco, è stato selezionato perché ci si aspettava che il fenotipo knockout fosse facile da selezionare nelle iniezioni a causa della sua natura autonoma delle cellule. Infatti, come previsto, sia il mosaico che i knockout totali erano chiaramente identificabili tra gli embrioni che ricevevano la miscela iniettabile contenente Cas9 e RNA guida. Sfortunatamente, nessun iniettato con knockout completo si è schiuso e un accoppiamento di massa di iniettee sopravvissute non è riuscito a generare progenie dagli occhi bianchi. Tuttavia, una linea mutante è stata successivamente generata con successo prendendo di mira un gene diverso (Klobasa et al., in corso). Ciò suggerirebbe che l'incapacità di stabilire una linea mutante bianca è molto probabilmente dovuta a effetti fuori bersaglio (ad esempio, Cas9 che taglia regioni importanti altrove nel genoma) generando una mutazione letale strettamente collegata, o a un ruolo critico imprevisto per il bianco in P. maidis.
I dati fenotipici e molecolari (Figura 8 e Figura 9) affermano che un knockout significativo nel locus bianco è stato creato in un campione di embrioni iniettati, che comporterebbe la perdita totale della funzione genica. Inoltre, mentre le mutazioni in bianco sono vitali in alcune specie, c'è un precedente per la ridotta attività bianca dannosa21,22. Detto questo, gli effetti fuori bersaglio non possono essere completamente esclusi. La previsione di probabili fuori bersaglio richiede dati accurati sulla sequenza del genoma23, che lo stato attuale delle risorse genomiche in P. maidis rende impossibile da fare in questo momento. Indipendentemente da ciò, con questi nuovi metodi, testare altri geni bersaglio può essere fatto con sicurezza, anche spostandosi verso una transgenesi più tradizionale nel tentativo di portare nuovi strumenti genetici a questo pernicioso parassita.

La cavalletta di mais, Peregrinus maidis, è un parassita economicamente importante del mais 1,2,3. Causano danni fisici diretti alla pianta, sia mentre si nutrono con il loro apparato boccale penetrante-succhiatore, sia durante la riproduzione quando depongono i loro embrioni direttamente nel tessuto vegetale 2,4. Nonostante le molteplici vie di danno diretto alle colture, l'impatto maggiore che questi insetti hanno sulla salute delle colture è indiretto, agendo come vettore del virus del mosaico del mais (MMV) e del virus della striscia di mais 5,6. MMV è in grado di replicarsi nel corpo del suo vettore P. maidis, consentendo al virus di persistere nei singoli insetti per tutta la loro vita, in modo che possano continuare a diffondere il virus a nuove piante ospiti 7,8. I metodi più comuni per controllare P. maidis, e quindi i virus che veicola, sono insetticidi.
Sfortunatamente, la cattiva gestione di questi prodotti ha causato lo sviluppo di resistenza nel parassita bersaglio e l'inquinamento dell'ambiente9. Pertanto, sono necessarie nuove strategie per ridurre le perdite di raccolto da questa combinazione di insetti / virus-parassiti. Lavori precedenti hanno dimostrato che l'interferenza dell'RNA (RNAi) potrebbe essere un metodo di controllo efficace per P. maidis perché sono suscettibili di downregulation nell'espressione genica anche quando ingeriscono RNA a doppio filamento (dsRNA)10. Tuttavia, il modo più efficace per somministrare dsRNA sul campo sarebbe attraverso le piante di cui si nutrono gli insetti; Quindi, le colture potrebbero ancora essere suscettibili a eventuali virus che gli insetti stanno già trasportando. Con l'avvento dell'editing del genoma CRISPR / Cas9, sono possibili nuove strategie di controllo dei parassiti, tra cui il gene drive11,12 basato su Cas9, che potrebbe essere utilizzato per ridurre le dimensioni di una popolazione di parassiti o per sostituire tale popolazione con individui resistenti ai virus che veicolano.
Tuttavia, lo sviluppo e l'implementazione di qualsiasi tipo di sistema gene-drive richiederà lo sviluppo di tecniche transgeniche. Tali metodi non erano necessari per condurre esperimenti di RNAi in P. maidis perché si presume che i dsRNA e/o i siRNA siano in grado di attraversare le membrane cellulari a causa dell'efficienza dell'RNAi in P. maidis10,13. Questo non è vero per i DNA e/o le proteine impiegate nella transgenesi tradizionale o nell'editing genetico basato su Cas9, entrambi i quali sarebbero un precursore della creazione di insetti portatori di un gene drive. Per realizzare l'editing genetico o altre forme di trasformazione germinale, questi DNA e proteine sono idealmente microiniettati negli embrioni durante la fase di blastoderma sinciziale, prima di quando l'embrione insetto si cellularizza. La tempistica è fondamentale, perché la fase sinciziale è la prima parte dello sviluppo14,15. Poiché le femmine di P. maidis depongono preferenzialmente le uova nel tessuto vegetale, l'estrazione di quantità sufficienti di embrioni precellulari per microiniezioni può essere laborioso e richiedere molto tempo. Pertanto, sono state sviluppate nuove tecniche per raccogliere e microiniettare rapidamente embrioni di P. maidis prima della cellularizzazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 oz Containers</td>
			<td>Dart</td>
			<td>P100N</td>
			<td>Adult container for egg-laying setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-103</td>
			<td>Serves as collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-106</td>
			<td>For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>For handling planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspirator</td>
			<td>Fischer Technical</td>
			<td>LAV-3</td>
			<td>Vacuum for aspirating larger numbers of insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Spectrum LED Lights</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>GLP24FS/19W/LED</td>
			<td>Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>A36498</td>
			<td>Endonuclease for cutting planthopper genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Vinyl Tubing</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.</td>
			<td>Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn planthoppers</td>
			<td>North Carolina State University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Dr. Anna Whitfield&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch Double Sided Tape</td>
			<td>NA</td>
			<td>Holding eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early Sunglow corn</td>
			<td>Park Seed Company</td>
			<td>05093-PK-N</td>
			<td>Corn for rearing planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epTIPS Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjection System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td>Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Drosophila Agar</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>66-103</td>
			<td>Substrate for everything except egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4731</td>
			<td>Egg handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose LE Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-102</td>
			<td>Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifyer</td>
			<td>Homedics</td>
			<td>UHE-CM45</td>
			<td>For providing humidity in humidified hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>For holding injected embryos until hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing cages</td>
			<td>Bioquip (special order)</td>
			<td>Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)</td>
			<td>Cage for planthoppers on corn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Planthopper screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12-5</td>
			<td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td>For positioning microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td>For beveling injection needles / Used &#39;fine&#39; graded plate at 20&#176; angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>GT100 X-Y Gliding Table</td>
			<td>For positioning and moving embryos under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Paint Brush</td>
			<td>Testor #2 8733</td>
			<td>Sold in 3 pack 281206</td>
			<td>Fine paintbrushes for embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI-7</td>
			<td>For holding the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I41VLH3C8</td>
			<td>Rearing injectees until hatch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy Vector System I cloning kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>Cloning Pm white target site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides or coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-549-3</td>
			<td>Hold eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4200</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Glad ClingWrap Plastic Wrap</td>
			<td>NA</td>
			<td>Wrap the entire egg-laying chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>QF100-50-10</td>
			<td>For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen (White Organza Fabric)</td>
			<td>Joann Fabrics</td>
			<td>16023889</td>
			<td>For covering the adult container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>To make 10% sucorose solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing

La cavalletta di mais, Peregrinus maidis, è un parassita del mais e un vettore di diversi virus del mais. Metodi precedentemente pubblicati descrivono l'innesco dell'interferenza dell'RNA (RNAi) in P. maidis attraverso la microiniezione di RNA a doppio filamento (dsRNA) in ninfe e adulti. Nonostante il potere dell'RNAi, i fenotipi generati attraverso questa tecnica sono transitori e mancano di eredità mendeliana a lungo termine. Pertanto, la cassetta degli attrezzi di P. maidis deve essere ampliata per includere strumenti di genomica funzionale che consentirebbero la produzione di ceppi mutanti stabili, aprendo la porta ai ricercatori per portare nuovi metodi di controllo su questo parassita economicamente importante. Tuttavia, a differenza dei dsRNA utilizzati per l'RNAi, i componenti utilizzati nell'editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 e nella trasformazione della linea germinale non attraversano facilmente le membrane cellulari. Di conseguenza, il DNA plasmide, gli RNA e/o le proteine devono essere microiniettati negli embrioni prima che l'embrione si cellularizzi, rendendo i tempi di iniezione un fattore critico per il successo. A tal fine, è stato sviluppato un metodo di deposizione delle uova a base di agarosio per consentire il prelievo di embrioni dalle femmine di P. maidis a intervalli relativamente brevi. Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la raccolta e la microiniezione di embrioni precellulari di P. maidis con componenti CRISPR (nucleasi Cas9 che è stata complessata con RNA guida), e vengono presentati i risultati del knockout genico basato su Cas9 di un gene del colore degli occhi di P. maidis, bianco. Sebbene questi protocolli descrivano l'editing del genoma CRISPR / Cas9 in P. maidis, possono anche essere utilizzati per produrre P. maidis transgenico attraverso la trasformazione della linea germinale semplicemente cambiando la composizione della soluzione di iniezione.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Qui sono presenti protocolli per la raccolta e la microiniezione di embrioni precellulari di cavallette di mais allo scopo di modificare il loro genoma tramite l'editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 o per l'aggiunta di elementi trasponibili marcati attraverso la trasformazione germinale.

Microiniezione di Corn Planthopper, Peregrinus maidis, embrioni per l'editing del genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Ad oggi, CRISPR è stato utilizzato solo in una manciata di emitteri. Il protocollo qui delineato potrebbe aiutare i ricercatori ad applicare CRISPR e la trasformazione germinale in altre specie di emitteri. Questo protocollo è stato sviluppato specificamente per gli embrioni di insetti sensibili all'essiccazione.Molti passaggi del protocollo potrebbero potenzialmente migliorare i risultati in altre specie di insetti. La capacità di generare cavallette transgeniche apre la porta a nuovi metodi di controllo, come la creazione di insetti che non possono più trasmettere virus. Questa tecnica sarà rivoluzionaria per studiare la funzione genica in altri parassiti, come i tripidi dei fiori occidentali.Abbiamo adattato questa tecnica CRISPR per embrioni tripidi con risultati promettenti. Riteniamo che la pratica in questo sistema sia essenziale per il successo. I metodi mostrati qui, se eseguiti di routine, dovrebbero consentire un uso flessibile in una varietà di impostazioni.Per fare una camera per contenere gli insetti adulti Peregrinus maidis, tagliare un buco sul fondo di una tazza da un'oncia e incollare uno schermo sopra il foro per lo scambio d'aria. Per la selezione di insetti femmina adulti di una settimana, aspirare la colonia in un tubo conico da 15 millilitri per un'ora, prima di raffreddare brevemente gli insetti sul ghiaccio. Identificare le femmine dalla presenza dell'ovopositore, che è tipicamente più scuro rispetto al resto dell'addome, sul lato ventrale dell'addome.Trasferisci le femmine nella tazza man mano che vengono raccolte. Quando sono state selezionate 15 femmine, sigillare la tazza con un pezzo di cinque centimetri di pellicola di cera di paraffina. Applicare 400 microlitri di una soluzione di saccarosio al 10% sulla parte superiore del film e posizionare un secondo pezzo di pellicola di cinque per cinque centimetri sopra la soluzione.Posizionare la camera per adulti su un piatto per la raccolta delle uova con il lato della pellicola di paraffina di plastica a diretto contatto con il mezzo di deposizione delle uova e avvolgere l'intera camera di deposizione delle uova con pellicola trasparente senza coprire i fori d'aria. Quindi, posizionare la camera a 25 gradi Celsius con il 70% di umidità e 14 ore di luce, ciclo di buio di 10 ore. Per la raccolta degli embrioni, dopo il periodo di deposizione degli ovociti desiderato, applicare una striscia di nastro biadesivo da 15 millimetri su un vetrino di copertura da 22 x 30 millimetri e posizionare il vetrino di copertura sul mezzo di deposizione delle uova della camera di deposizione delle uova.Utilizzando un pennello sottile e un microscopio da dissezione, spostare i singoli embrioni semitrasparenti dalla superficie dell'agar al nastro biadesivo. Quando sono stati selezionati circa 25 embrioni, disporre gli embrioni a forma di banana sui lati con le estremità più grandi incollate sul nastro. Per la microiniezione degli embrioni, in primo luogo, posizionare il vetrino di copertura su una capsula di Petri da 100 x 15 millilitri a filo con l'1% di agar sotto un microscopio da dissezione all'interno di una cappa umidificata.Per controllare la pressione di iniezione, posizionare la punta di un ago per iniezione di quarzo in una goccia d'acqua e avviare il ciclo di iniezione. Dopo aver confermato l'impostazione della pressione, avvicinandosi dal lato sinistro del vetrino di copertura, inserire l'ago nell'estremità più grande di un embrione. Somministrare la soluzione per iniezione nell'uovo ed estrarre rapidamente l'ago.Quando tutte le uova sono state iniettate, posizionare la linguetta di copertura sulla superficie di una nuova capsula di agar all'1% e posizionare la capsula in una camera di umidità. Dopo sei giorni, utilizzare acqua pulita e pennello fine per trasferire gli embrioni sopravvissuti in una capsula di Petri da 35 x 10 millimetri contenente carta da filtro inumidita con acqua. Sigillare la capsula di Petri con pellicola di paraffina di plastica e posizionare la camera di schiusa in un'incubatrice a 25 gradi Celsius.Dopo sei-otto giorni, usa un pennello fine per trasferire eventuali ninfe emergenti di primo stadio in una capsula di Petri di ritagli di foglie e sigilla il piatto con pellicola di cera di paraffina di plastica. Dopo 48 ore a 25 gradi Celsius, usa un pennello sottile per trasferire tutte le ninfe di due giorni in una gabbia di allevamento con piante di mais. Se gli iniettati con fenotipo visibile vengono recuperati in numero sufficiente, ingabbiare questi insetti separatamente per massimizzare il recupero del tratto bersaglio nella generazione successiva.Allevare gli insetti nelle condizioni appropriate di temperatura e umidità con trasferimenti regolari alle piante di mais fresco, se necessario, e selezionare regolarmente la progenie per i fenotipi attesi, mettendo gli individui che mostrano il fenotipo desiderato nelle proprie gabbie per stabilire linee omozigoti. In questa analisi rappresentativa, un totale di 6.483 uova sono state raccolte da un totale di 645 femmine in quattro settimane. Le femmine in genere iniziano a deporre le uova dopo due giorni e forniscono la maggior parte delle uova dal quarto al sesto giorno, con l'attività di deposizione delle uova che rallenta dal nono giorno.Cas9 nove iniezione non influisce sullo sviluppo di P.maidis, poiché i tassi di sviluppo per gli embrioni trattati con tampone iniettabile, tampone iniettabile integrato con Cas9 e tampone iniettabile integrato con Cas9 e tre RNA guida, è simile. Anche le velocità di tratteggio per i controlli buffer e Cas9 sono simili. Tuttavia, i tassi di tratteggio degli individui che ricevono il mix di tre guide sono in genere relativamente più bassi.In questo esperimento rappresentativo, dei 71 individui iniettati con guida che si sono sviluppati, 23 hanno mostrato un certo grado di perdita di pigmento e nove si sono schiusi, con un conseguente tasso di knockout di circa il 30% Il mix a tre guide dovrebbe rimuovere circa 180 coppie di basi dal locus bianco, come osservato nei prodotti PCR amplificati dal DNA genomico isolato da individui iniettati, nonché nei dati di sequenza associati generati da tali prodotti. Si consiglia l'uso di aghi smussati per ridurre al minimo il trauma da iniezione. Se gli embrioni sembrano fuoriuscire dopo l'iniezione, esaminare le punte dell'ago per ottenere risultati migliori.La pratica continua aumenterà la sopravvivenza degli embrioni. Ad oggi, non ci sono pubblicazioni che descrivono la trasformazione germinale negli emitteri. Tuttavia, abbiamo usato questo protocollo per realizzare cavallette che esprimono Cas9.Nel complesso, la capacità di eseguire la trasformazione germinale negli emitteri apre la porta a una vasta gamma di strategie genetiche di gestione dei parassiti, riducendo così l'uso di insetticidi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microiniezione Wound Assay e<em&gt; In vivo</em&gt; Localizzazione di Epidermal Wound risposta Giornalisti a<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Ricerca

Bioingegneria

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l&#39;alta Screening contenuti

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Produzione di geneticamente criceti dorati siriani di pronuclei iniezione del complesso CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Sequenziamento di lettura ultra-lungo per analisi di DNA Genomic intero

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing di Saccharomyces cerevisiae e la creazione di Yeast Pixel Art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospezione ceppi microbici per biorimediazione e lo sviluppo di probiotici per la ricerca e la conservazione dei metaorganismi

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...