Name: microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

ノースカロライナ州立大学昆虫学および植物病理学部は、DARPAの昆虫同盟プログラムをサポートするチームの一員です。表明された見解、意見、および/または調査結果は著者のものであり、国防総省または米国政府の公式見解または方針を表すものとして解釈されるべきではありません。著者は競合する利益を宣言しません。MDL、DR、およびAEWはプロジェクトを構想し、資金獲得、プロジェクト管理、およびリソースを提供しました。FC、WK、NG、およびMDLは、マイクロインジェクション実験を考案および設計しました。OHは産卵法を考案し、設計しました。FCとWKが実験を行った。FCとWKは結果を分析しました。FC、WK、NG、MDLが原稿を書きました。著者らは、 P. maidis コロニーの維持に協力してくれた Kyle Sozanski と Victoria Barnett に特別な感謝を捧げたいと思います。

1. P. maidis 成虫のコロニーレベルでの飼育
<ol><li>飼育ケージごとに週に最低4ポットのトウモロコシを植え、ポットごとに3〜4個の種子を植えます。昆虫のいない環境で育ちます。</li>
	<li>植物が~5週齢になったら、30cm×30cm×60cmのケージに入れます。</li>
	<li>研究所または野生から十分な量の P. maidis 成虫(~500)を入手し、9〜12個のトウモロコシ植物(3〜4鉢)が植えられた防虫ケージに入れます。</li>
	<li>コロニーを昆虫飼育インキュベーターで25°C(±1°C)、湿度70%以上、光サイクル14:10に維持します。</li>
	<li>年齢調整されたコロニーを生成するには、4日間の産卵後にすべての初期成虫を取り除き、ケージに産まれた胚を孵化させて自然に老化させます。</li>
	<li>5週齢の P. maidis 昆虫(成虫)を新鮮なトウモロコシ植物に移し、アスピレーターで採取して毎週継代培養します(図1)。次に、成虫を新鮮なトウモロコシの入ったきれいなケージに放します。実験目的で若年成人の安定した供給を維持するために、毎週新鮮な年齢調整されたケージを準備します。</li>
	<li>ケージ内のポットに毎日2回水をまきます。定期的に茎を切り取り、腐敗している植物材料を取り除き、必要に応じて新鮮なコーンポットと交換します。 注:適切なメンテナンスがあれば、コロニーは~5週間続くことがあります(つまり、ケージに置かれた胚が成虫になるのに十分な長さ)。</li>
</ol>2. アガロース系産卵室
<ol><li>きれいな100mm×15mmのペトリ皿に1%w/vアガロースを水に注ぎ、採卵皿(産卵培地)を作ります。産卵培地が固化した後、4°Cで保存する。</li>
	<li>成人に給餌するための10%w / vショ糖溶液を調製します。ショ糖溶液を-20°Cで最大1か月間保存します。</li>
	<li>1オンスのカップの底に穴を開け( 材料の表を参照)、空気交換のために穴の上にスクリーンを接着することにより、大人を保持するチャンバーを作ります(図2)。</li>
	<li>プラスチックパラフィンワックスフィルムを5 cm x 5 cmの正方形にカットします。カップごとに2つの正方形を取っておきます。</li>
	<li>年齢調整された P. maidis コロニーから ~15 人の 1 週齢の成体雌を採取する。雌を選択するには、腹部の腹側を調べ、通常は腹部の他の部分よりも暗い産卵管を探します(図3)。複数の産卵室を設置する場合は、15 mLの円錐形バイアルに最大1時間成人を保持します。性別になる前に氷上で昆虫を短時間冷やし、成体の容器に移します。 注:この検査は顕微鏡なしで行うことができます。餌を与えて交尾する時間があった成人女性も、通常、成人男性よりも腹部が大きく、より従順です。したがって、ケージの個体群からより簡単に選択できます。</li>
	<li>メスを大人の容器に移し、カップを元のサイズの3〜4倍に均等に伸ばして、1層のプラスチックパラフィンワックスフィルムで密封します(図4A、B)。</li>
	<li>プラスチックパラフィンワックスフィルムシールの上部に400μLの10%w / vショ糖溶液を塗布し、プラスチックパラフィンワックスフィルムの2番目の層を追加して、プラスチックパラフィンワックスフィルムを上記とまったく同じように伸ばします(図4C、D)。 注:引き伸ばされたプラスチックパラフィンワックスフィルムのサンドイッチは、成人の摂食にとって非常に重要なショ糖溶液を加圧しますが、女性が産卵管を産卵培地に突き刺すのを防ぐことはできません。</li>
	<li>成虫室を採卵皿の上に置き、プラスチックパラフィンワックスフィルム側を直接産卵培地の上に置き、空気交換に必要なため、産卵室全体を空気穴を覆わずにラップで包みます(図5)。</li>
	<li>各産卵室を25°C、湿度70%、光サイクル14:10でインキュベートします。</li>
	<li>プラスチックパラフィンワックスフィルムと10%w / vショ糖溶液のサンドイッチを毎日交換し、カップ内に溜まった水を取り除きます。</li>
</ol>3. 高湿度環境下での胚採取と位置合わせ
<ol><li>実体顕微鏡ベースのマイクロインジェクションシステムを加湿スペースまたはフード(加湿フード; 図6)作業環境がマイクロインジェクションプロセス全体で少なくとも70%の湿度を達成するようにします。</li>
	<li>希望の産卵期間後に産卵培地で卵を確認します。加湿フードまたは別の湿気の多い環境でこれを行います。 注:通常使用される産卵期間は、午後6時から午前10時までの一晩で、~16時間続きました。</li>
	<li>アガロースに卵が産まれている場合は、細かい鉗子を使用して慎重に掘り出し、アガロースの表面に置いて湿らせます(図7A)。</li>
	<li>22 mm x 30 mmのカバーガラスに1 mm x 15 mmの両面テープのストリップを貼り付けます(図7B)。カバーガラステープ面を上にして産卵培地の上に置きます(図7C)。</li>
	<li>寒天表面から個々の卵を拾い上げ、細かいブラシを使用して両面テープに移動します。完全に白い卵や黒い色の卵を取り除きます。健康な卵は半透明になります。</li>
	<li>バナナの形をした卵を横に置き、大きい方の端を両面テープに貼り付けます(図7D)。 注意: 卵は、底に1%寒天の層が付いたペトリ皿など、常に高湿度の環境に保管してください。</li>
</ol>4. CRISPR試薬および注射針の調製
<ol><li>フレイミング/ブラウンタイプのマイクロピペットプーラーを使用して石英針を引きます。</li>
	<li>マイクロピペットベベルを使用して石英針を面取りします。</li>
	<li>両面粘着テープを使用して、使用する準備ができるまで、引っ張った針をペトリ皿などの透明な容器に固定します。</li>
	<li>0.5 μLのCas9タンパク質(5 μg/μLストック溶液)と0.5 μLのsgRNA(4 μg/μLストック溶液; 材料表を参照)を1 μLのフェノールレッドバッファーと最終容量5 μLで組み合わせて注射液を調製します。針を詰まらせる可能性のある粒子を沈殿させるには、溶液を短時間ボルテックスし、最高速度で3分間遠心分離します。</li>
	<li>注射針の先細りの端近くに注射ミックスを残すように注意しながら、注射針を埋め戻します。もしあれば、針の先端から泡を取り除きます。</li>
	<li>埋め戻された針をニードルホルダーに慎重に置き、ステンレス鋼のカラーを締めて、マイクロインジェクション中に針をしっかりと固定します。</li>
	<li>注入システムで針に空気圧のバーストを供給しながら、細かい湿らせた絵筆で斜めの先端をそっとなでることにより、針から注入液の信頼性の高い流れを生成します。 注意: 注射混合物が少量で先端を離れる可能性がある場合、針は注射の準備ができています。</li>
</ol>5.マイクロインジェクションとインジェクション後のケア
<ol><li>清潔な100 mm x 15 mmのペトリ皿に1%寒天を満たし、皿の上部と同じ高さの寒天の水平層を形成することにより、マイクロインジェクションプラットフォームを準備します。</li>
	<li>事前に準備したカバーガラスを~25個の胚とともに寒天プラットフォームに置きます(図8A)。 注意: すべての注入手順は、加湿フード(湿度~70%)内で実行する必要があります。</li>
	<li>針先を水滴に入れ、注入サイクルを開始して、射出圧力を確認します。 注意: 圧力設定が正しい場合、少量の注射液が水に分散するはずです(図8B)。</li>
	<li>カバーガラスの左側から近づいて、胚の大きい方の端に針を挿入します(図8C)。注射液を卵の中に届け、針を素早く引き抜きます。</li>
	<li>すべての卵を注入した後、カバーガラスを新しい1%寒天皿の表面に置き、皿を湿度チャンバーに移します(図9)。</li>
</ol>6.胚の孵化と孵化
<ol><li>孵化室を25°Cのインキュベーターに6日間入れた。</li>
	<li>きれいな水と細かいブラシを使用して、生き残った胚を、皿の底を覆う水で湿らせたろ紙で35 mm x 10 mmのペトリ皿に移します。ペトリ皿をプラスチックパラフィンワックスフィルムで密封し、25°Cで保持して胚を孵化させます。生存のために注射の6日後に胚のチェックを開始します。 注:最初の齢のニンフは8日目頃に孵化し始めます。</li>
	<li>細いブラシを使用して、ニンフを葉の切り抜きを含むペトリ皿に移します。皿を覆い、プラスチックパラフィンワックスフィルムで密封します。</li>
	<li>孵化したばかりの子ガメの密封皿を葉の挿し木で25°Cで48時間インキュベートします。</li>
	<li>細かいブラシを使用して、すべての2日齢のニンフを注射のラウンドからトウモロコシ植物のある飼育ケージに移します。目に見える表現型を持つ注射者が十分な数で回復した場合は、次世代の標的形質の回復を最大化するために、それらを別々に飼育します。それ以外の場合は、すべての注入者の大量嵌合を実行します。 注意: 孵化したばかりの子ガメをトウモロコシ植物の渦巻きにそっと置き、避難所を提供し、身近な環境の適切な湿度を確保します。</li>
	<li>上記の条件で昆虫を飼育し、適切な温度、湿度、および新鮮なトウモロコシ植物への定期的な移動を確保します。</li>
	<li>予想される表現型の子孫をスクリーニングします。目的の表現型を示す個体を自分のケージに入れて、ホモ接合系統を確立します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Namba, R., Higa, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+studies+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+in+Hawaii.">Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii.</a> Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).</li><li>Singh, B. 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著者は開示するものは何もありません。

産卵の質と栄養 最近、近縁種である Nilaparvata lugensと協力している研究者は、マイクロインジェクションに使用した卵を葉から直接入手し、注入された卵を孵化するまで葉の組織に保持しました17。この葉ベースの方法は、胚発生のためのより自然な環境を提供しましたが、それはまた、除去プロセス中の感染や卵の損傷の可能性を高めました。ここで紹介する人工産卵システムは、より均一な環境を提供し、取り扱いによる卵への損傷の可能性を減らします。金曜日に産卵カップを設置することにより、産卵卵の大部分は、マイクロインジェクション作業を行う人々の利益のために、典型的な週の作業中に収集されました。ただし、この方法の注意点の1つは、10%ショ糖溶液ダイエットの栄養素の不足が最終的に昆虫の健康に影響を及ぼし、カップ内の女性は通常、わずか10日後に死に始めることです。死んだ卵や不健康な卵の増加によって証明されるように、卵の質も6日後に低下し始めます。その結果、マイクロインジェクションに使用される卵を選択し、6日目以降は雌を飼わないことが重要です。
生存率と湿度 マイクロインジェクションプロセスによる胚の生存には、2つの要因が重要であるように思われます。 P. maidis 胚の取り扱いで最も困難な側面は、産卵培地から取り出した後、およびマイクロインジェクション全体を通して、胚が乾燥しないようにすることです。卵は通常植物組織の中に産まれるため、脱水を防ぐための適切な殻がありません。加湿されたフードでさえ、卵のセット全体が乾燥のために失われました。ただし、湿度が高すぎると、両面テープやスコープに水が溜まると、マイクロインジェクションにも影響を与える可能性があります。残念ながら、卵の脱水は通常、マイクロインジェクションプロセス中に気付くのは容易ではなく、2〜3日後に完全に透明になり、発達の兆候を示さないまで、正常に見えることがよくありました。
針の質も生存に重要な役割を果たしているようです。卵への不必要な損傷を最小限に抑えるために、針を面取りする必要があります。針が詰まった場合、湿らせた絵筆で針の先端をそっと撫でながらインジェクターのクリア機能を使用すると(手順4.7を参照)、通常、針は機能状態に戻りました。いずれにしても、注射プロセス全体を通して針の品質を維持するために、各針に少量の注射液(~0.25 μL)のみを入れ、数回スライドごとに新しい針(~50〜60個の卵)に切り替えることをお勧めします。
ノックアウト表現型の生成に成功 生殖細胞をうまく形質転換するには、通常、細胞化の前にできるだけ早く胚マイクロインジェクションを行う必要があります。昆虫種に応じて、マイクロインジェクションを完了するための時間枠は、わずか数時間から丸一日の長さの範囲です14,15,20。P. maidis 胚がいつ細胞化を受けるかはまだ不明である。Cas9を介したノックアウトは、産卵後4時間から16時間までの若い胚でテストされ、予想される表現型がすべての実験で観察され、すべてのマイクロインジェクションがプレセル化ウィンドウ内で行われたことが示唆されました。
目の色遺伝子である白のP. maidis オルソログが選択されたのは、ノックアウト表現型が細胞自律性の性質により注射対象者でスクリーニングが容易であると予想されたためです。実際、予想通り、モザイクノックアウトとトータルノックアウトの両方が、Cas9とガイドRNAを含む注射混合物を受けた胚の間で明確に識別できました。残念ながら、完全なノックアウトの注射者は孵化せず、生き残った注射者の大量交配は白い目の子孫を生成することができませんでした。しかし、後に別の遺伝子を標的とすることで変異株が成功裏に生成された(Klobasa et al., 進行中)。これは、白色変異株の確立の失敗は、密接に関連した致死的突然変異を生成するオフターゲット効果(すなわち、Cas9がゲノムの他の場所で重要な領域を切断する)またはP. maidisの白色の予測不可能な重要な役割のいずれかによる可能性が最も高いことを示唆している。
表現型および分子データ(図8および図9)は、注射された胚のサンプルで白い遺伝子座の有意なノックアウトが作成され、遺伝子機能が完全に失われることを確認しています。さらに、白の突然変異は一部の種で実行可能ですが、白人の活動の低下が有害であるという前例があります21,22。とはいえ、オフターゲット効果を完全に排除することはできません。オフターゲットの可能性を予測するには、正確なゲノム配列データ23が必要であり、P. maidisのゲノムリソースの現在の状態は、現時点では不可能である。とにかく、これらの新しい方法では、他の標的遺伝子を自信を持ってテストすることができ、この有害な害虫に新しい遺伝的ツールをもたらすために、より伝統的な遺伝子導入に移行することさえできます。

トウモロコシのウンカ、ペレグリヌスマイディスは、トウモロコシ1,2,3の経済的に重要な害虫です。それらは、穿刺吸引口器で餌を与えている間、および胚を植物組織に直接産む生殖中の両方で、植物に直接物理的損傷を引き起こします2,4。作物への直接的な被害の複数の経路にもかかわらず、これらの昆虫が作物の健康に与える最大の影響は、トウモロコシモザイクウイルス(MMV)およびトウモロコシストライプウイルスのベクターとして機能することにより、間接的です5,6。MMVは、そのP. maidis ベクターの体内で複製することができ、ウイルスが一生を通じて個々の昆虫に存続することを可能にするため、ウイルスを新しい宿主植物に拡散し続けることができます7,8。P. maidis、したがってそれが媒介するウイルスを制御するための最も一般的な方法は殺虫剤です。
残念ながら、これらの製品の管理ミスは、標的害虫の耐性の発達と環境の汚染を引き起こしました9。したがって、この昆虫/ウイルス害虫の組み合わせによる作物の損失を減らすには、新しい戦略が必要です。これまでの研究では、RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA(dsRNA)を摂取しても遺伝子発現のダウンレギュレーションを受けやすいため、P. maidisの効果的な制御方法となることが実証されました10。しかし、野外でdsRNAを投与する最も効果的な方法は、昆虫が餌とする植物を使用することです。したがって、作物は昆虫がすでに運んでいるウイルスの影響を受けやすい可能性があります。CRISPR/Cas9ゲノム編集の出現により、Cas9ベースの遺伝子ドライブ11,12を含む新しい害虫駆除戦略が可能になり、害虫集団のサイズを縮小したり、当該個体群をベクターウイルスに耐性のある個体に置き換えることができます。
しかし、あらゆる種類の遺伝子駆動システムの開発と展開には、トランスジェニック技術の開発が必要です。P. maidis では RNAi の効率により、dsRNA および/または siRNA が細胞膜を通過できると推定されるため、このような方法は P. maidis で RNAi 実験を行うのに必要ではなかった 10,13。これは、従来のトランスジェネシスやCas9ベースの遺伝子編集で採用されているDNAやタンパク質には当てはまらず、どちらも遺伝子ドライブを運ぶ昆虫を作る前兆となるでしょう。遺伝子編集または他の形態の生殖細胞系変換を達成するために、これらのDNAおよびタンパク質は、昆虫の胚が細胞化する前の合胞体胚葉段階で胚にマイクロインジェクションするのが理想的です。合胞子期は開発の最も初期の部分であるため、タイミングは重要です14,15。P. maidis の雌は植物組織に優先的に卵を産むため、マイクロインジェクションのために十分な量の前細胞胚を抽出することは、労働集約的で時間がかかる可能性があります。そのため、細胞化の前にP. maidis胚を迅速に収集してマイクロ注入するための新しい技術が開発されました。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 oz Containers</td>
			<td>Dart</td>
			<td>P100N</td>
			<td>Adult container for egg-laying setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-103</td>
			<td>Serves as collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-106</td>
			<td>For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>For handling planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspirator</td>
			<td>Fischer Technical</td>
			<td>LAV-3</td>
			<td>Vacuum for aspirating larger numbers of insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Spectrum LED Lights</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>GLP24FS/19W/LED</td>
			<td>Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>A36498</td>
			<td>Endonuclease for cutting planthopper genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Vinyl Tubing</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.</td>
			<td>Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn planthoppers</td>
			<td>North Carolina State University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Dr. Anna Whitfield&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch Double Sided Tape</td>
			<td>NA</td>
			<td>Holding eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early Sunglow corn</td>
			<td>Park Seed Company</td>
			<td>05093-PK-N</td>
			<td>Corn for rearing planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epTIPS Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjection System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td>Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Drosophila Agar</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>66-103</td>
			<td>Substrate for everything except egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4731</td>
			<td>Egg handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose LE Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-102</td>
			<td>Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifyer</td>
			<td>Homedics</td>
			<td>UHE-CM45</td>
			<td>For providing humidity in humidified hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>For holding injected embryos until hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing cages</td>
			<td>Bioquip (special order)</td>
			<td>Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)</td>
			<td>Cage for planthoppers on corn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Planthopper screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12-5</td>
			<td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td>For positioning microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td>For beveling injection needles / Used &#39;fine&#39; graded plate at 20&#176; angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>GT100 X-Y Gliding Table</td>
			<td>For positioning and moving embryos under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Paint Brush</td>
			<td>Testor #2 8733</td>
			<td>Sold in 3 pack 281206</td>
			<td>Fine paintbrushes for embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI-7</td>
			<td>For holding the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I41VLH3C8</td>
			<td>Rearing injectees until hatch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy Vector System I cloning kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>Cloning Pm white target site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides or coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-549-3</td>
			<td>Hold eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4200</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Glad ClingWrap Plastic Wrap</td>
			<td>NA</td>
			<td>Wrap the entire egg-laying chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>QF100-50-10</td>
			<td>For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen (White Organza Fabric)</td>
			<td>Joann Fabrics</td>
			<td>16023889</td>
			<td>For covering the adult container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>To make 10% sucorose solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing

トウモロコシのウンカ、Peregrinus maidisは、トウモロコシの害虫であり、いくつかのトウモロコシウイルスのベクターです。以前に発表された方法は、ニンフおよび成体への二本鎖RNA(dsRNA)のマイクロインジェクションによるP.maidisにおけるRNA干渉(RNAi)の誘発を説明している。RNAiの力にもかかわらず、この技術によって生成された表現型は一過性であり、長期的なメンデル遺伝を欠いています。したがって、P. maidis toolboxを拡張して、安定した変異株の生産を可能にする機能的ゲノムツールを含める必要があり、研究者がこの経済的に重要な害虫に耐える新しい防除方法をもたらすための扉を開きます。しかし、RNAiに使用されるdsRNAとは異なり、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集および生殖細胞系列形質転換に使用される成分は、細胞膜を容易に通過しません。その結果、胚が細胞化する前にプラスミドDNA、RNA、および/またはタンパク質を胚にマイクロインジェクションする必要があり、注入のタイミングが成功の重要な要素になります。そのために、アガロースを用いた産卵法を開発し、比較的短い間隔でP. maidis 雌から胚を採取できるようにしました。本明細書には、CRISPR成分(ガイドRNAと複合体化されたCas9ヌクレアーゼ)を有する前細胞P. maidis 胚を収集およびマイクロ注入するための詳細なプロトコルが提供され、P. maidis 目の色遺伝子である白色のCas9ベースの遺伝子ノックアウトの結果が提示される。これらのプロトコルは、P. maidisにおけるCRISPR/Cas9ゲノム編集を記述していますが、注射液の組成を変更するだけで、生殖細胞系列形質転換を介してトランスジェニックP. maidisを製造するためにも使用できます。

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Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

ここには、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集を介してゲノムを改変する目的で、または生殖系列形質転換を介して顕著な転移性要素を追加する目的で、前細胞トウモロコシウンカ胚を収集してマイクロ注入するためのプロトコルがあります。

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

今日まで、CRISPRはほんの一握りの半翅目でしか使用されていません。ここで概説されているプロトコルは、研究者が他の半翅目種にCRISPRと生殖細胞系列の形質転換を適用するのに役立つ可能性があります。このプロトコルは、乾燥に敏感な昆虫胚のために特別に開発されました。プロトコルの多くのステップは、他の昆虫種の転帰を改善する可能性があります。トランスジェニックウンカを生成する能力は、もはやウイルスを感染させることができない昆虫を作成するなど、新しい制御方法への扉を開きます。この技術は、西洋の花アザミウマなどの他の害虫の遺伝子機能を研究するための革命的であろう。このCRISPR技術をアザミウマの胚に適応させ、有望な結果をもたらしました。このシステムでの実践は成功に不可欠であることがわかりました。ここに示す方法は、日常的に実行すると、さまざまな設定で柔軟に使用できるはずです。成虫のPeregrinus maidis昆虫を保持するためのチャンバーを作るには、1オンスのカップの底に穴を開け、空気交換のために穴の上にスクリーンを接着します。生後1週間の成虫の雌昆虫を選択するには、コロニーを15ミリリットルの円錐形のチューブに1時間吸引してから、昆虫を氷上で短時間冷やします。腹部の腹側にある、通常は腹部の他の部分よりも暗い産卵管の存在によって女性を識別します。彼らが集められるとき、女性をカップに移します。15人の女性が選択されたら、5 x 5センチメートルのパラフィンワックスフィルムでカップを密封します。400マイクロリットルの10%スクロース溶液をフィルムの上部に塗布し、2番目の5 x 5センチメートルのフィルムを溶液の上に置きます。プラスチックパラフィンワックスフィルム側が産卵培地に直接接触した状態で採卵皿に成体室を置き、空気穴を覆わずに産卵室全体をラップで包みます。次に、チャンバーを摂氏25度、湿度70%、光14時間、暗10時間のサイクルに置きます。胚採取では、希望の産卵期間の後、22×30ミリメートルのカバースリップに1×15ミリメートルの両面テープを貼り、カバースリップを産卵室の産卵培地に置きます。細かいブラシと解剖顕微鏡を使用して、個々の半透明の胚を寒天表面から両面テープに移動します。約25個の胚を選択したら、バナナの形をした胚を横に配置し、大きい方の端をテープに貼り付けます。胚のマイクロインジェクションの場合、まず、加湿フード内の解剖顕微鏡下で1%寒天と同じ高さの100 x 15ミリリットルのペトリ皿にカバースリップを置きます。射出圧力を確認するには、石英注射針の先端を水滴に入れ、射出サイクルを開始します。圧力設定を確認後、カバースリップの左側から近づき、1つの胚の大きい方の端に針を挿入します。注射液を卵の中に届け、素早く針を引き抜きます。すべての卵が注入されたら、カバースリップを新しい1%寒天皿の表面に置き、皿を湿度チャンバーに入れます。6日後、きれいな水と細かいブラシを使用して、生き残った胚を水で湿らせたろ紙を含む35 x 10ミリメートルのペトリ皿に移します。ペトリ皿をプラスチックパラフィンワックスフィルムで密封し、孵化室を摂氏25度のインキュベーターに入れます。6〜8日後、細いブラシを使用して、出現した最初の齢のニンフを葉の切り抜きのペトリ皿に移し、プラスチックパラフィンワックスフィルムで皿を密封します。摂氏25度で48時間後、細いブラシを使用して、生後2日齢のすべてのニンフをトウモロコシの飼育ケージに移します。目に見える表現型を持つ注射者が十分な数で回収された場合、これらの昆虫を別々にケージに入れて、次世代の標的形質の回復を最大化します。必要に応じて新鮮なトウモロコシ植物に定期的に移して適切な温度と湿度の条件下で昆虫を飼育し、予想される表現型について子孫を定期的にスクリーニングし、目的の表現型を示す個体を自分のケージに入れてホモ接合系統を確立します。この代表的な分析では、4週間で合計645人の雌から合計6, 483個の卵子が採取されました。雌は通常、2日後に産卵を開始し、4日目から6日目にほとんどの卵子を提供し、産卵活動は9日目までに遅くなります。Cas99インジェクションは、インジェクションバッファー、Cas9を添加したインジェクションバッファー、Cas9および3つのガイドRNAを添加したインジェクションバッファーで処理した胚の発生率が類似しているため、P.maidisの発生に影響を与えません。バッファ コントロールと Cas9 コントロールのハッチング レートも同様です。ただし、3つのガイドミックスを受けている個人の孵化率は、通常、比較的低くなります。この代表的な実験では、発症した71人のガイド注射個体のうち、23人がある程度の色素喪失を示し、9人が孵化し、ノックアウト率が約30%になり、注射された個体から単離されたゲノムDNAから増幅されたPCR産物で観察されるように、3ガイドミックスは白い遺伝子座から約180塩基対を除去すると予想され、 また、それらの製品から生成された関連するシーケンスデータも含まれます。注射の外傷を最小限に抑えるために、斜めの針を使用することをお勧めします。注射後に胚が漏れているように見える場合は、より良い結果を得るために針先を調べてください。継続的な練習は胚の生存率を高めます。今日まで、半翅目の生殖細胞系列の形質転換を説明する出版物はありません。しかし、我々はこのプロトコルを使用してCas9発現ウンカを作製した。全体として、半翅目で生殖細胞系形質転換を行う能力は、幅広い遺伝的害虫管理戦略への扉を開き、それによって殺虫剤の使用を減らします。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

マイクロインジェクションアッセイをキズや<em&gt;インビボ</em&gt;表皮の局在は、応答記者傷<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚。

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル<em&gt;インビボ</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

CRISPR/Cas9 複合体の前核注入による遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの生産

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a サッカロマイセスセレビシエの多重ゲノム編集と酵母ピクセルアートの創造

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

メタ生物研究と保存のためのバイオレメディエーションおよびプロバイオティクス開発のための微生物株の探知

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション