Name: microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

El Departamento de Entomología y Fitopatología de la Universidad Estatal de Carolina del Norte es parte de un equipo que apoya el Programa de Aliados de Insectos de DARPA. Los puntos de vista, opiniones y / o hallazgos expresados son los de los autores y no deben interpretarse como representativos de los puntos de vista o políticas oficiales del Departamento de Defensa o del Gobierno de los Estados Unidos. Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos. MDL, DR y AEW concibieron el proyecto y proporcionaron fondos para la adquisición, administración del proyecto y recursos. FC, WK, NG y MDL concibieron y diseñaron los experimentos de microinyección; OH concibió y diseñó el método de puesta de huevos. FC y WK realizaron los experimentos; FC y WK analizaron los resultados; y FC, WK, NG y MDL escribieron el manuscrito. Los autores desean ofrecer un agradecimiento especial a Kyle Sozanski y Victoria Barnett por su ayuda en el mantenimiento de las colonias de P. maidis.

1. Crianza a nivel de colonia de adultos de P. maidis
<ol><li>Plante un mínimo de cuatro macetas de maíz por semana por jaula de cría, con 3-4 semillas por maceta. Cultiva en un ambiente libre de insectos.</li>
	<li>Cuando las plantas tengan ~ 5 semanas de edad, colóquelas dentro de una jaula de 30 cm x 30 cm x 60 cm.</li>
	<li>Obtenga una cantidad suficiente de adultos de P. maidis (~ 500) de un laboratorio de investigación o de la naturaleza, y colóquela en una jaula a prueba de insectos con 9-12 plantas de maíz (3-4 macetas).</li>
	<li>Mantener la colonia en una incubadora de cría de insectos a 25 °C (± 1 °C), con al menos un 70% de humedad y un ciclo de luz de 14:10.</li>
	<li>Para generar una colonia calibrada por edad, retire a todos los adultos iniciales después de cuatro días de puesta de huevos y permita que los embriones depositados en la jaula eclosionen y envejezcan naturalmente.</li>
	<li>Mueva los insectos P. maidis (adultos) de 5 semanas de edad a plantas de maíz frescas para su subcultivo semanal recolectando con un aspirador (Figura 1). Luego, libere a los adultos en una jaula limpia con plantas de maíz frescas. Para mantener un suministro constante de adultos jóvenes con fines experimentales, prepare jaulas frescas calibradas por edad cada semana.</li>
	<li>Riegue las macetas en las jaulas dos veces al día. Recorte periódicamente los tallos, retire el material vegetal en descomposición y reemplácelos con macetas de maíz frescas según sea necesario. NOTA: Con un mantenimiento adecuado, una colonia puede durar ~ 5 semanas (es decir, el tiempo suficiente para que los embriones colocados en la jaula se conviertan en adultos).</li>
</ol>2. Cámara de puesta de huevos a base de agarosa
<ol><li>Haga platos de recolección de huevos (medio de oviposición) vertiendo 1% p/v agarosa en agua en placas de Petri limpias de 100 mm x 15 mm. Conservar el medio de oviposición a 4 °C después de solidificarse.</li>
	<li>Prepare una solución de sacarosa al 10% p/v para alimentar a los adultos. Guarde la solución de sacarosa a -20 °C durante un máximo de un mes.</li>
	<li>Haga una cámara para sostener a los adultos cortando un agujero en el fondo de una taza de 1 oz (consulte la Tabla de materiales) y pegando una pantalla sobre el orificio para el intercambio de aire (Figura 2).</li>
	<li>Corte la película de cera de parafina plástica en cuadrados de 5 cm x 5 cm; Reserva 2 cuadrados para cada taza.</li>
	<li>Recolecte ~ 15 hembras adultas de 1 semana de edad de una colonia de P. maidis calibrada por edad. Para seleccionar hembras, examine el lado ventral del abdomen y busque el ovipositor, que generalmente es más oscuro que el resto del abdomen (Figura 3). Mantenga a los adultos hasta por una hora en un vial cónico de 15 ml si instala varias cámaras de puesta de huevos. Enfríe los insectos brevemente en hielo antes del sexado y transfiéralos al recipiente para adultos. NOTA: Este examen se puede hacer sin un microscopio. Las hembras adultas que han tenido tiempo de alimentarse y aparearse también suelen tener abdómenes más grandes que los machos adultos y son más dóciles; Por lo tanto, se pueden seleccionar más fácilmente de una población de jaulas.</li>
	<li>Transfiera las hembras a un recipiente para adultos y selle la taza con 1 capa de película de cera de parafina plástica estirándola uniformemente 3-4 veces su tamaño original (Figura 4A, B).</li>
	<li>Aplique 400 μL de solución de sacarosa al 10% p/v en la parte superior del sello de la película de cera de parafina plástica y agregue una segunda capa de película de cera de parafina plástica, estirando la película de cera de parafina plástica exactamente como se indica arriba (Figura 4C, D). NOTA: El sándwich de película de cera de parafina de plástico estirado presuriza la solución de sacarosa, que es muy importante para la alimentación de adultos, pero no evitará que las hembras perforen sus ovipositores hasta el medio de oviposición.</li>
	<li>Coloque la cámara para adultos en un plato de recolección de huevos con el lado de la película de cera de parafina de plástico directamente sobre el medio de oviposición, y envuelva toda la cámara de puesta de huevos con una envoltura de plástico sin cubrir los orificios de aire, ya que son necesarios para el intercambio de aire (Figura 5).</li>
	<li>Incubar cada cámara de puesta de huevos a 25 °C con un 70% de humedad y un ciclo de luz de 14:10.</li>
	<li>Cambie el sándwich de película de cera de parafina de plástico y la solución de sacarosa al 10% p/v diariamente, y elimine el agua que se acumule dentro de la taza.</li>
</ol>3. Recolección y alineación de embriones en un ambiente de alta humedad
<ol><li>Instale un sistema de microinyección basado en un microscopio estereoscópico en un espacio o campana humidificados (campana humidificada; Figura 6) para garantizar que el entorno de trabajo alcance al menos un 70% de humedad durante todo el proceso de microinyección.</li>
	<li>Verifique el medio de oviposición para ver si hay huevos después del período deseado de puesta de huevos. Haga esto en una campana humidificada u otro ambiente húmedo. NOTA: El período de puesta de huevos típicamente utilizado fue durante la noche, de 6 PM a 10 AM, con una duración de ~ 16 h.</li>
	<li>Si se ponen huevos en la agarosa, use pinzas finas para desenterrarlos cuidadosamente y colóquelos en la superficie de la agarosa para mantenerlos húmedos (Figura 7A).</li>
	<li>Aplique una tira de cinta de doble cara de 1 mm x 15 mm sobre un cubreobjetos de 22 mm x 30 mm (Figura 7B). Coloque el cubreobjetos con el lado de la cinta hacia arriba en el medio de oviposición (Figura 7C).</li>
	<li>Recoja cada huevo individual de la superficie del agar y muévase a la cinta de doble cara con un cepillo fino. Retire los huevos que sean completamente blancos o que tengan coloración negra. Los huevos sanos serán los semitransparentes.</li>
	<li>Coloque los huevos en forma de plátano de lado, con el extremo más grande pegado en la cinta de doble cara (Figura 7D). NOTA: Siempre mantenga los huevos en un ambiente de alta humedad, como una placa de Petri moldeada con una capa de agar al 1% en la parte inferior.</li>
</ol>4. Preparación de reactivos CRISPR y agujas de inyección
<ol><li>Tire de las agujas de cuarzo con un extractor de micropipetas tipo Flaming/Brown.</li>
	<li>Biselar las agujas de cuarzo con un biselado de micropipeta.</li>
	<li>Use cinta adhesiva de doble cara para asegurar las agujas tiradas en un recipiente transparente, como una placa de Petri, hasta que estén listas para usar.</li>
	<li>Preparar la solución inyectable combinando 0,5 μL de proteína Cas9 (solución madre de 5 μg/μL) y 0,5 μL de ARNg (solución madre de 4 μg/μL; véase la tabla de materiales) con 1 μL de tampón rojo fenol en un volumen final de 5 μL. Para precipitar partículas que podrían obstruir la aguja, haga un vórtice breve de la solución y centrifugar durante 3 minutos a velocidad máxima.</li>
	<li>Rellene la aguja de inyección, teniendo cuidado de dejar la mezcla de inyección cerca del extremo cónico de la aguja. Retire las burbujas, si las hay, de la punta de la aguja.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente la aguja rellena en el soporte de la aguja y apriete el collar de acero inoxidable para mantener la aguja firmemente en su lugar durante la microinyección.</li>
	<li>Genere un flujo confiable de solución inyectable de la aguja acariciando suavemente la punta biselada con un pincel fino y humedecido, mientras administra ráfagas de presión de aire a la aguja con el sistema de inyección. NOTA: La aguja está lista para la inyección cuando la mezcla de inyección puede salir de la punta en pequeñas cantidades.</li>
</ol>5. Microinyección y cuidados posteriores a la inyección
<ol><li>Prepare una plataforma de microinyección llenando una placa de Petri limpia de 100 mm x 15 mm con agar al 1% para formar una capa nivelada de agar que se enrasa con la parte superior del plato.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos previamente preparado con ~25 embriones sobre la plataforma de agar (Figura 8A). NOTA: Todos los pasos de inyección deben realizarse dentro de una campana humidificada (~70% de humedad).</li>
	<li>Compruebe la presión de inyección colocando la punta de la aguja en una gota de agua e iniciando el ciclo de inyección. NOTA: Una pequeña cantidad de solución inyectable debe dispersarse en el agua si el ajuste de presión es correcto (Figura 8B).</li>
	<li>Inserte la aguja en el extremo más grande del embrión, acercándose desde el lado izquierdo del cubreobjetos (Figura 8C). Administre la solución inyectable en el huevo y saque la aguja rápidamente.</li>
	<li>Después de inyectar todos los huevos, coloque el cubreobjetos en la superficie de un nuevo plato de agar al 1% y transfiera el plato a una cámara de humedad (Figura 9).</li>
</ol>6. Incubación y eclosión de embriones
<ol><li>Coloque la cámara de eclosión en una incubadora a 25 °C durante 6 días.</li>
	<li>Transfiera los embriones supervivientes, utilizando agua limpia y un cepillo fino, a una placa de Petri de 35 mm x 10 mm con papel de filtro humedecido en agua que cubra el fondo del plato. Selle la placa de Petri con una película de cera de parafina de plástico y mantenga a 25 °C para permitir que los embriones eclosionen. Comience a revisar la supervivencia de los embriones 6 días después de la inyección. NOTA: Las primeras ninfas del estadio comenzarán a eclosionar alrededor del día 8.</li>
	<li>Transfiera las ninfas, usando un cepillo fino, a una placa de Petri que contenga recortes de hojas. Cubra el plato y selle con una película de cera de parafina de plástico.</li>
	<li>Incubar el plato sellado de las crías en esquejes de hojas durante 48 h a 25 °C.</li>
	<li>Transfiera todas las ninfas de 2 días de edad de una ronda de inyecciones a una jaula de cría con plantas de maíz usando un cepillo fino. Si los inyectados con fenotipo visible se recuperan en cantidades suficientes, criarlos por separado para maximizar la recuperación del rasgo objetivo en la próxima generación. De lo contrario, realice el apareamiento masivo de todos los inyectados. NOTA: Coloque las crías suavemente en el verticilo de la planta de maíz para proporcionar refugio y garantizar la humedad adecuada de su entorno inmediato.</li>
	<li>Criar los insectos en las condiciones descritas anteriormente, asegurando la temperatura adecuada, la humedad y las transferencias regulares a las plantas de maíz fresco.</li>
	<li>Progenie de detección de fenotipos esperados. Coloque a los individuos que exhiben el fenotipo deseado en su propia jaula para establecer líneas homocigóticas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Namba, R., Higa, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+studies+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+in+Hawaii.">Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii.</a> Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).</li><li>Singh, B. U., Seetharama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+interactions+of+the+corn+planthopper,+Peregrinus+maidis+Ashm.(Homoptera:+Delphacidae)+in+maize+and+sorghum+agroecosystems.">Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems.</a> Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).</li><li>Tsai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+a+corn+disease+in+Florida+transmitted+by+Peregrinus+maidis.">Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis.</a> Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).</li><li>Chelliah, S., Basheer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+studies+of+Peregrinus+maidis+(Ashmead)+(Araeopidae:+Homoptera)+on+sorghum.">Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum.</a> Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).</li><li>Lastra, J., Esparza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+vesicular+stomatitis+virus+in+the+leafhopper+Peregrinus+maidis+(Ashm.),+a+vector+of+a+plant+rhabdovirus.">Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus.</a> Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).</li><li>Nault, L. R., Ammar, E. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leafhopper+and+planthopper+transmission+of+plant+viruses.">Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).</li><li>Ammar, E. -. D., Tsai, C. -. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+acquisition+and+titer+of+Maize+mosaic+rhabdovirus+in+its+vector,+Peregrinus+maidis+(Hemiptera:+Delphacidae).">Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae).</a> Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).</li><li>Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+residual+effects+of+seven+insecticides+on+Dalbulus+maidis+(Homoptera:+Cicadellidae)+and+Peregrinus+maidis+(Homoptera:+Delphacidae).">Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae).</a> Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).</li><li>Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+RNAi+methods+for+Peregrinus+maidis,+the+corn+planthopper.">Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper.</a> PloS One. 8 (8), 70243 (2013).</li><li>Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technology:+concerning+RNA-guided+gene+drives+for+the+alteration+of+wild+populations.">Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations.</a> Elife. 3, 03401 (2014).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+maize+mosaic+virus+to+planthopper+vectors+by+microinjection+increases+infection+efficiency+and+facilitates+functional+genomics+experiments+in+the+vector.">Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector.</a> Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).</li><li>Kimelman, D., Martin, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+patterning+in+early+development:+three+strategies.">Anterior-posterior patterning in early development: three strategies.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).</li><li>Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+insect+development:+to+the+hemimetabolous+paradigm.">Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 20 (4), 355-361 (2010).</li><li>Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCs+of+eye+color+in+Tribolium+castaneum:+orthologs+of+the+Drosophila+white,+scarlet,+and+brown+Genes.">The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes.</a> Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).</li><li>Xue, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+knockout+of+two+eye+pigmentation+genes+in+the+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(Hemiptera:+Delphacidae).">CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase.">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).</li><li>Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera,+embryos+for+germline+transformation,+or+CRISPR/Cas9+genome+editing.">Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).</li><li>Brent, C. S., Hull, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+eye+coloration+genes+in+the+western+tarnished+plant+bug+(Lygus+hesperus+Knight).">RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).</li><li>Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ABCs+of+eye+color+in+Helicoverpa+armigera+with+CRISPR/Cas9-induced+mutations.">Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas+systems+in+genome+editing:+methodologies+and+tools+for+sgRNA+design,+off-target+evaluation,+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects.">CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Calidad de la puesta de huevos y nutrición Recientemente, los investigadores que trabajan con una especie relacionada, Nilaparvata lugens, obtuvieron los huevos que usaron para microinyecciones directamente de la hoja, manteniendo los huevos inyectados en el tejido de la hoja hasta que eclosionaron17. Si bien este método basado en hojas proporcionó un entorno más natural para el desarrollo embrionario, también aumentó las posibilidades de infecciones y daños en los huevos durante el proceso de eliminación. El sistema de oviposición artificial presentado aquí proporciona un ambiente más uniforme y reduce las posibilidades de daño a los huevos por la manipulación. Al instalar las copas de oviposición el viernes, la mayoría de los huevos ovipositos se recolectaron durante una semana de trabajo típica, en beneficio de quienes realizan el trabajo de microinyección. Una advertencia a este método, sin embargo, es que la falta de nutrientes en la dieta de solución de sacarosa al 10% eventualmente afectará la salud de los insectos, y las hembras en las copas generalmente comienzan a morir después de solo 10 días. La calidad del huevo también comienza a disminuir después de 6 días, como lo demuestra un aumento en los huevos muertos o de aspecto poco saludable. Como resultado, es importante ser selectivo de los huevos utilizados para microinyecciones y no mantener a las hembras después del día 6.
Tasa de supervivencia y humedad Dos factores parecen ser críticos para la supervivencia embrionaria a través del proceso de microinyección. El aspecto más desafiante del manejo de embriones de P. maidis es evitar que se desecen después de la extracción del medio de oviposición y durante la microinyección. Como los huevos generalmente se ponen dentro del tejido vegetal, carecen de una cáscara adecuada para prevenir la deshidratación. Incluso en la campana humidificada se perdieron juegos enteros de huevos debido a la desecación. Sin embargo, una humedad excesivamente alta también podría afectar las microinyecciones si se acumula agua en la cinta de doble cara o en el endoscopio. Desafortunadamente, la deshidratación del huevo generalmente no era fácil de notar durante el proceso de microinyección, y con frecuencia parecían normales hasta 2 o 3 días después, cuando se volvieron completamente transparentes, sin mostrar signos de desarrollo.
La calidad de la aguja también parece desempeñar un papel importante en la supervivencia. La aguja debe ser biselada para minimizar el daño innecesario al huevo. Cuando la aguja está bloqueada, el uso de la función de limpieza en el inyector mientras se acaricia suavemente la punta de la aguja con un pincel humedecido (ver paso 4.7) normalmente devuelve la aguja a un estado funcional. En cualquier caso, se recomienda colocar solo pequeñas cantidades de solución inyectable (~0.25 μL) en cada aguja y cambiar a una aguja nueva cada pocos portaobjetos (~50-60 huevos) para garantizar que la calidad de la aguja se mantenga durante todo el proceso de inyección.
Generación exitosa de un fenotipo knockout Para transformar con éxito las células germinales, las microinyecciones embrionarias generalmente deben realizarse lo antes posible antes de la celularización. Dependiendo de la especie de insecto, la ventana de tiempo para completar las microinyecciones varía de solo un par de horas hasta un día completo14,15,20. Todavía no está claro cuándo los embriones de P. maidis se someten a celularización. El knockout mediado por Cas9 se probó en embriones tan jóvenes como 4 h después de la puesta de huevos (pel) hasta 16 h pel, y los fenotipos esperados se observaron en todos los experimentos, lo que sugiere que todas las microinyecciones se realizaron dentro de la ventana de precelurización.
El ortólogo de P. maidis del gen del color de ojos, blanco, fue seleccionado porque se esperaba que el fenotipo knockout fuera fácil de detectar en inyectores debido a su naturaleza autónoma celular. De hecho, como era de esperar, tanto los knockouts en mosaico como los totales fueron claramente identificables entre los embriones que recibieron la mezcla de inyección que contenía Cas9 y ARN guía. Desafortunadamente, ningún inyectado con nocaut completo eclosionó, y un apareamiento masivo de inyectados sobrevivientes no logró generar progenie de ojos blancos. Sin embargo, más tarde se generó con éxito una línea mutante dirigida a un gen diferente (Klobasa et al., en progreso). Esto sugeriría que el fracaso para establecer una línea mutante blanca es más probable debido a efectos fuera del objetivo (es decir, Cas9 cortando regiones importantes en otras partes del genoma) generando una mutación letal estrechamente vinculada, o a un papel crítico imprevisto para el blanco en P. maidis.
Los datos fenotípicos y moleculares (Figura 8 y Figura 9) afirman que se creó un knockout significativo en el locus blanco en una muestra de embriones inyectados, lo que resultaría en la pérdida total de la función génica. Además, aunque las mutaciones en blanco son viables en algunas especies, existe un precedente de reducción de la actividad blanca que es perjudicial21,22. Dicho esto, los efectos fuera del objetivo no se pueden descartar por completo. La predicción de posibles objetivos fuera de los objetivos requiere datos precisos de la secuencia del genoma23, lo que el estado actual de los recursos genómicos en P. maidis hace imposible de hacer en este momento. En cualquier caso, con estos nuevos métodos, las pruebas de otros genes objetivo se pueden hacer con confianza, incluso avanzando hacia una transgénesis más tradicional en un esfuerzo por traer nuevas herramientas genéticas a esta plaga perniciosa.

El saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, es una plaga económicamente importante del maíz 1,2,3. Causan daño físico directo a la planta, tanto mientras se alimentan con sus piezas bucales perforadoras-chupadoras, como durante la reproducción cuando ponen sus embriones directamente en el tejido vegetal 2,4. A pesar de las múltiples rutas de daño directo a los cultivos, el mayor impacto que estos insectos tienen en la salud de los cultivos es indirecto, al actuar como vector del virus del mosaico del maíz (MMV) y del virus de la raya del maíz 5,6. MMV es capaz de replicarse en el cuerpo de su vector P. maidis, permitiendo que el virus persista en insectos individuales durante toda su vida, por lo que pueden continuar propagando el virus a nuevas plantas huésped 7,8. Los métodos más comunes para controlar P. maidis, y por lo tanto los virus que transmite, son los insecticidas.
Desafortunadamente, el mal manejo de estos productos ha causado el desarrollo de resistencia en la plaga objetivo, así como la contaminación del medio ambiente9. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias para reducir las pérdidas de cultivos de esta combinación de insectos / virus y plagas. Trabajos previos demostraron que la interferencia de ARN (ARNi) podría ser un método de control efectivo para P. maidis porque son susceptibles a la regulación negativa en la expresión génica incluso cuando se ingiere ARN bicatenario (dsRNA)10. Sin embargo, la forma más efectiva de administrar dsRNA en el campo sería a través de las plantas de las que se alimentan los insectos; Por lo tanto, los cultivos aún podrían ser susceptibles a cualquier virus que los insectos ya estén portando. Con el advenimiento de la edición del genoma CRISPR / Cas9, son posibles nuevas estrategias de control de plagas, incluido el impulsor genético basado en Cas911,12, que podría usarse para reducir el tamaño de una población de plagas o para reemplazar dicha población con individuos resistentes a los virus que transmiten.
Sin embargo, el desarrollo y despliegue de cualquier tipo de sistema de impulsores genéticos requerirá el desarrollo de técnicas transgénicas. Tales métodos no fueron necesarios para llevar a cabo experimentos de ARNi en P. maidis porque se presume que los dsRNAs y/o siRNAs pueden atravesar las membranas celulares debido a la eficiencia del RNAi en P. maidis10,13. Esto no es cierto para los ADN y / o proteínas empleadas en la transgénesis tradicional o en la edición de genes basada en Cas9, cualquiera de los cuales sería un precursor de la creación de insectos portadores de un impulso genético. Para lograr la edición de genes u otras formas de transformación de la línea germinal, estos ADN y proteínas se microinyectan idealmente en embriones durante la etapa de blastodermo sincitial, antes de que el embrión del insecto se celularice. El tiempo es crítico, porque la etapa sincitial es la primera parte del desarrollo14,15. Como las hembras de P. maidis ponen preferentemente sus huevos en el tejido vegetal, la extracción de cantidades suficientes de embriones precelulares para microinyecciones puede ser laboriosa y llevar mucho tiempo. Por lo tanto, se desarrollaron nuevas técnicas para recolectar y microinyectar rápidamente embriones de P. maidis antes de la celularización.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 oz Containers</td>
			<td>Dart</td>
			<td>P100N</td>
			<td>Adult container for egg-laying setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-103</td>
			<td>Serves as collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Genesee 28-106</td>
			<td>For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>For handling planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspirator</td>
			<td>Fischer Technical</td>
			<td>LAV-3</td>
			<td>Vacuum for aspirating larger numbers of insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Spectrum LED Lights</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>GLP24FS/19W/LED</td>
			<td>Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>A36498</td>
			<td>Endonuclease for cutting planthopper genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Vinyl Tubing</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.</td>
			<td>Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn planthoppers</td>
			<td>North Carolina State University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Dr. Anna Whitfield&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch Double Sided Tape</td>
			<td>NA</td>
			<td>Holding eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early Sunglow corn</td>
			<td>Park Seed Company</td>
			<td>05093-PK-N</td>
			<td>Corn for rearing planthoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epTIPS Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjection System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247</td>
			<td>Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Drosophila Agar</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>66-103</td>
			<td>Substrate for everything except egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4731</td>
			<td>Egg handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose LE Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-102</td>
			<td>Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)</td>
			<td>RNA guides for targeting planthopper white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifyer</td>
			<td>Homedics</td>
			<td>UHE-CM45</td>
			<td>For providing humidity in humidified hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>For holding injected embryos until hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing cages</td>
			<td>Bioquip (special order)</td>
			<td>Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)</td>
			<td>Cage for planthoppers on corn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Planthopper screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ12-5</td>
			<td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td>For positioning microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td>For beveling injection needles / Used &#39;fine&#39; graded plate at 20&#176; angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>GT100 X-Y Gliding Table</td>
			<td>For positioning and moving embryos under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Paint Brush</td>
			<td>Testor #2 8733</td>
			<td>Sold in 3 pack 281206</td>
			<td>Fine paintbrushes for embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI-7</td>
			<td>For holding the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I41VLH3C8</td>
			<td>Rearing injectees until hatch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T Easy Vector System I cloning kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>Cloning Pm white target site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Microscope Slides or coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-549-3</td>
			<td>Hold eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4200</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Glad ClingWrap Plastic Wrap</td>
			<td>NA</td>
			<td>Wrap the entire egg-laying chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>25 nmole DNA Oligo</td>
			<td>Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>QF100-50-10</td>
			<td>For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen (White Organza Fabric)</td>
			<td>Joann Fabrics</td>
			<td>16023889</td>
			<td>For covering the adult container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>To make 10% sucorose solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of corn planthopper, peregrinus maidis, embryos for crispr/cas9 genome editing

El saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, es una plaga del maíz y un vector de varios virus del maíz. Los métodos publicados anteriormente describen el desencadenamiento de la interferencia de ARN (ARNi) en P. maidis a través de la microinyección de ARN bicatenario (dsRNA) en ninfas y adultos. A pesar del poder del ARNi, los fenotipos generados a través de esta técnica son transitorios y carecen de herencia mendeliana a largo plazo. Por lo tanto, la caja de herramientas de P. maidis debe ampliarse para incluir herramientas genómicas funcionales que permitan la producción de cepas mutantes estables, abriendo la puerta para que los investigadores introduzcan nuevos métodos de control para influir en esta plaga económicamente importante. Sin embargo, a diferencia de los dsRNAs utilizados para el ARNi, los componentes utilizados en la edición del genoma basada en CRISPR / Cas9 y la transformación de la línea germinal no cruzan fácilmente las membranas celulares. Como resultado, los ADN, ARN y / o proteínas plásmidos deben microinyectarse en embriones antes de que el embrión se celularice, lo que hace que el momento de la inyección sea un factor crítico para el éxito. Con ese fin, se desarrolló un método de puesta de huevos a base de agarosa para permitir que los embriones se cosechen de hembras de P. maidis a intervalos relativamente cortos. Aquí se proporcionan protocolos detallados para recolectar y microinyectar embriones precelulares de P. maidis con componentes CRISPR (nucleasa Cas9 que ha sido complejada con ARN guía), y se presentan los resultados de la eliminación del gen basado en Cas9 de un gen del color de ojos de P. maidis, blanco. Aunque estos protocolos describen la edición del genoma CRISPR/Cas9 en P. maidis, también se pueden utilizar para producir P. maidis transgénico a través de la transformación de la línea germinal simplemente cambiando la composición de la solución inyectable.

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Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Aquí hay protocolos para recolectar y microinyectar embriones precelulares de saltamontes de maíz con el fin de modificar su genoma a través de la edición del genoma basada en CRISPR / Cas9 o para la adición de elementos transponibles marcados a través de la transformación de la línea germinal.

Microinyección de saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, embriones para la edición del genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Hasta la fecha, CRISPR solo se ha utilizado en un puñado de hemípteros. El protocolo descrito aquí podría ayudar a los investigadores a aplicar CRISPR y la transformación de la línea germinal en otras especies de hemípteros. Este protocolo fue desarrollado específicamente para embriones de insectos que son sensibles a la desecación.Muchos pasos en el protocolo podrían mejorar los resultados en otras especies de insectos. La capacidad de generar saltamontes transgénicos abre la puerta a nuevos métodos de control, como la creación de insectos que ya no pueden transmitir virus. Esta técnica será revolucionaria para estudiar la función génica en otras plagas, como los trips de las flores occidentales.Hemos adaptado esta técnica CRISPR para embriones de trips con resultados prometedores. Encontramos que la práctica en este sistema es esencial para el éxito. Los métodos que se muestran aquí, cuando se realizan de forma rutinaria, deben permitir un uso flexible en una variedad de entornos.Para hacer una cámara para sostener a los insectos adultos Peregrinus maidis, haga un agujero en el fondo de una taza de una onza y pegue una pantalla sobre el agujero para el intercambio de aire. Para la selección de insectos hembra adultos de una semana de edad, aspire la colonia en un tubo cónico de 15 mililitros durante una hora, antes de enfriar brevemente los insectos en hielo. Identifique a las hembras por la presencia del ovipositor, que es típicamente más oscuro que el resto del abdomen, en el lado ventral del abdomen.Transfiera las hembras a la copa a medida que se recogen. Cuando se hayan seleccionado 15 hembras, selle la taza con una película de cera de parafina de cinco por cinco centímetros. Aplique 400 microlitros de una solución de sacarosa al 10% en la parte superior de la película y coloque una segunda pieza de película de cinco por cinco centímetros sobre la solución.Coloque la cámara para adultos en un plato de recolección de huevos con el lado de la película de cera de parafina de plástico en contacto directo con el medio de oviposición, y envuelva toda la cámara de puesta de huevos con una envoltura de plástico sin cubrir los orificios de aire. Luego, coloque la cámara a 25 grados centígrados con 70% de humedad y 14 horas de luz, ciclo oscuro de 10 horas. Para la recolección de embriones, después del período de puesta de huevos deseado, aplique una tira de uno por 15 milímetros de cinta adhesiva de doble cara sobre un cubreobjetos de 22 por 30 milímetros y coloque el cubreobjetos en el medio de oviposición de la cámara de puesta de huevos.Usando un cepillo fino y un microscopio de disección, mueva embriones semitransparentes individuales de la superficie del agar a la cinta de doble cara. Cuando se hayan seleccionado unos 25 embriones, coloque los embriones en forma de plátano en sus lados con los extremos más grandes pegados en la cinta. Para la microinyección de los embriones, primero, coloque el deslizamiento de la cubierta en una placa de Petri de 100 por 15 mililitros al ras con agar al 1% bajo un microscopio de disección dentro de una campana humidificada.Para verificar la presión de inyección, coloque la punta de una aguja de inyección de cuarzo en una gota de agua e inicie el ciclo de inyección. Después de confirmar el ajuste de presión, acercándose desde el lado izquierdo del cubreobjetos, inserte la aguja en el extremo más grande de un embrión. Administre la solución inyectable en el huevo y saque rápidamente la aguja.Cuando se hayan inyectado todos los huevos, coloque el deslizamiento de la cubierta sobre la superficie de un nuevo plato de agar al 1% y coloque el plato en una cámara de humedad. Después de seis días, use agua limpia y cepillo fino para transferir cualquier embrión sobreviviente a una placa de Petri de 35 por 10 milímetros que contenga papel de filtro humedecido con agua. Selle la placa de Petri con una película de cera de parafina de plástico y coloque la cámara de eclosión en una incubadora de 25 grados centígrados.Después de seis a ocho días, use un cepillo fino para transferir cualquier ninfa emergente del primer estadio a una placa de Petri de recortes de hojas y selle el plato con una película de cera de parafina de plástico. Después de 48 horas a 25 grados centígrados, use un cepillo fino para transferir a todas las ninfas de dos días de edad a una jaula de cría con plantas de maíz. Si los inyectados con fenotipo visible se recuperan en cantidades suficientes, enjaular estos insectos por separado para maximizar la recuperación del rasgo objetivo en la próxima generación.Criar a los insectos bajo las condiciones apropiadas de temperatura y humedad con transferencias regulares a plantas de maíz fresco según sea necesario, y examinar a la progenie regularmente para detectar fenotipos esperados, colocando a los individuos que exhiben el fenotipo deseado en sus propias jaulas para establecer líneas homocigóticas. En este análisis representativo, se recolectaron un total de 6, 483 huevos de un total de 645 hembras en cuatro semanas. Las hembras generalmente comienzan a poner huevos después de dos días y proporcionan la mayoría de los huevos desde el día cuatro hasta el seis, con la actividad de oviposición disminuyendo en el día nueve.La inyección de Cas9 nueve no afecta el desarrollo de P. maidis, ya que las tasas de desarrollo para embriones tratados con tampón de inyección, tampón de inyección suplementado con Cas9 y tampón de inyección suplementado con Cas9 y tres ARN guía son similares. Las velocidades de sombreado para el búfer y los controles Cas9 también son similares. Sin embargo, las tasas de eclosión de los individuos que reciben la mezcla de tres guías suelen ser relativamente más bajas.En este experimento representativo, de los 71 individuos inyectados en guía que se desarrollaron, 23 mostraron algún grado de pérdida de pigmento y nueve eclosionaron, lo que resultó en una tasa de nocaut de aproximadamente el 30%. Se espera que la mezcla de tres guías elimine aproximadamente 180 pares de bases del locus blanco, como se observa en los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico aislado de individuos inyectados. así como en los datos de secuencia asociados generados a partir de esos productos. Recomendamos el uso de agujas biseladas para minimizar el trauma de la inyección. Si los embriones parecen tener fugas después de la inyección, examine las puntas de las agujas para obtener mejores resultados.La práctica continua aumentará la supervivencia del embrión. Hasta la fecha, no hay publicaciones que describan la transformación de la línea germinal en los hemípteros. Sin embargo, hemos utilizado este protocolo para hacer saltamontes que expresan Cas9.En general, la capacidad de realizar la transformación de la línea germinal en los hemípteros abre la puerta a una amplia gama de estrategias genéticas de manejo de plagas, reduciendo así el uso de insecticidas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinyección de Heridas Ensayo y<em&gt; In vivo</em&gt; Localización de la herida epidérmica Reporteros de respuesta en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Investigación

Bioingeniería

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Producción de hámsters sirios dorados genéticamente por inyección Pronuclear del complejo CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Muy largo leer la secuencia para el análisis de la DNA de Genomic entero

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

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CRISPR/Cas12a Multiplex Genoma Edición de Saccharomyces cerevisiae y la creación de Arte de píxeles de levadura

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospección de cepas microbianas para la biorremediación y el desarrollo de probióticos para la investigación y conservación de metaorganismos

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...