Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

BEMÆRK: Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Icahn School of Medicine på Mount Sinai institutionelle kerne og brug udvalg.
1. Forberedelse før ventilcelleisolering fra voksne mus
<ol><li>Rengør og steriliser alle de kirurgiske instrumenter, der er vist i figur 1A, ved at bruge 70% v/v ethanol og efterfølgende autoklavere dem i 30 minutter.</li>
	<li>Der tilsættes 500 μL penicillin-streptomycin til 50 ml 10 mm HEPES. Forbered en al...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., G&#233;n&#233;reux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+treatment+of+aortic+stenosis.">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li><li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stenosis+and+heart+failure:+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials.">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+follows+function:+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering.">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li><li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve+interstitial+cells:+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification.">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li><li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics:+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification:+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling.">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA/ROCK-dependent+mechanism.">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol over museventilcelleisolering til primær kultur. Tre aortaklapper fra 8 uger gamle mus blev samlet for at opnå et tilstrækkeligt antal celler. Derudover beskriver denne protokol karakteriseringen af VIC-fænotype og in vitro mineraliseringsanalysen. Metoden blev tilpasset fra den tidligere beskrevne protokol fra Mathieu et al.7.
Under isolering af aortaklapper skal man sørge for at undgå alle kild...

Forkalket aortaklappen sygdom (CAVD) er den mest udbredte valvular hjertesygdom i vestlige populationer, der påvirker næsten 2,5% af ældre personer over 65 år1. CAVD påvirker over seks millioner amerikanere og er forbundet med ændringer i de mekaniske egenskaber af foldere, der forringer normal blodgennemstrømning1,2. I øjeblikket er der ingen farmakologisk behandling for at stoppe sygdommens progression eller for at aktivere mineralregression. Den eneste effektive behandling til behandling af CAVD er udskiftning af aortaklappen ved operation eller transkatheter aortaklappenudskiftning3. Det er derfor bydende nødvendigt at undersøge de molekylære mekanismer, der fører til ventilmineralisering, for at identificere nye farmakologiske mål. Faktisk har ikke-behandlet aorta stenose flere negative konsekvenser såsom venstre ventrikel dysfunktion og hjertesvigt4.
Aortaklappen består af tre lag kendt som fibrosa, spongiosa og ventriker, der indeholder VIC'er som den fremherskende celletype5. Fibrosaen og ventrikierne er dækket af et lag vaskulære endotelceller (VEC)5. VEC'erne regulerer gennemtrængeligheden af inflammatoriske celler samt parakrinesignaler. Øget mekanisk stress kan påvirke VEC'ernes integritet og forstyrre aortaklappens homøostase, hvilket fører til inflammatorisk celleinvasion6. Scanning af elektronmikroskopianalyser viste forstyrret endotel i en forkalket aortaventil hos mennesker7. 
Histologiske analyser af forkalket væv afslører tilstedeværelsen af osteoblaster og osteoklaster. Desuden blev der observeret osteogen differentiering af VIC'er både in vitro og i humant ventilvæv8. Denne proces er hovedsageligt orkestreret af Runt-relaterede transskription faktor 2 (Runx2) og knoglen morfogenetiske proteiner (BMPs)8,9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

Forkalkningen af aortaklappen celler er kendetegnende for aorta stenose og er forbundet med ventil cusp fibrose. Valve interstitial celler (VICs) spiller en vigtig rolle i forkalkningsprocessen i aorta stenose gennem aktivering af deres dedifferentiation program til osteoblast-lignende celler. Mouse VICs er et godt in vitro-værktøj til belysning af de signalveje, der driver mineraliseringen af aortaklappen. Den metode, der er beskrevet heri, og som disse forfattere har anvendt med succes, forklarer, hvordan man får frisk isolerede celler. Der blev udført en totrins kollagenprocedure med 1 mg/mL og 4,5 mg/mL. Det første skridt er afgørende for at fjerne det endotelcellelag og undgå forurening. Den anden kollagen inkubation er at lette migrationen af VICs fra vævet til pladen. Derudover diskuteres en immunfluorescens farvningsprocedure for fænotypekarakterisering af de isolerede museventilceller. Desuden blev forkalkningsanalysen udført in vitro ved hjælp af calciumreagensmålingsproceduren og alizarin rød farvning. Brugen af museventilcelle primærkultur er afgørende for test af nye farmakologiske mål for at hæmme cellemineralisering in vitro.

Da murin aortaklappen typisk er 1 mm i diameter, skal mindst tre ventiler samles for at indsamle en million levedygtige celler til forskellige forsøgsprocedurer. De forskellige trin i VIC-isolationsprocessen er vist i figur 1 og figur 2. Da det er vanskeligt manuelt at skrabe ventilvævet, er det at foretrække at bruge forskydningsstress skabt ved hvirvelstrømning for at fjerne VEC'erne. Resultaterne af cd31-immunfluorescensdætningen viste faktisk, at der ik...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

I denne artikel beskrives isoleringen af musaortaklappeceller ved hjælp af en totrins kollagenprocedure. Isolerede museventilceller er vigtige for at udføre forskellige assays, såsom denne in vitro-forkalkningsanalyse, og for at undersøge de molekylære veje, der fører til aortaklappens mineralisering.

Isolering af mus interstitielle ventilceller til undersøgelse af forkalkning af aortaklappen In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Brugen af isolerede museventilceller er afgørende for at undersøge signalvejen, der fører til ventilforkalkning ved brug af genetisk modificerede celler fra transgene mus. Den to-trins fordøjelse er en hurtig og effektiv metode. Den mest udfordrende del af denne protokol er isoleringen af aortaklappen fra otte uger mus.Det er bedre at øve på ældre mus for at visualisere aortaklappen bedre. Før du starter eksperimentet, rengør og steriliser alle kirurgiske instrumenter og arbejdsområde med 70% ethanol og autoklave de kirurgiske instrumenter i 30 minutter. Når den indledende opsætning er klar, skal du starte med at rense brystet og maven på en otte uger gammel aflivet mus ved hjælp af ethanol.Brug saks, åbne maven og brystet af musen, derefter skæres mellem venstre atrium og venstre hjertekammer med små kirurgiske saks. Fjern blod fra hjertet ved at perfusing 10 milliliter kold PBS og skære hjertet, holde tre millimeter af den opstigende aorta. Under et stereomikroskop dissekeres aortaklappen ved at skære hjertet vandret midt i hjertekamrene og skære venstre ventrikel mod aorta og derefter forsigtigt dissekere aortaklappen.Saml ventilerne sammen i en lille 35 millimeter vævskultur skål. Vask de isolerede ventiler i en 75 milliliter cellekultur skål med fem milliliter frisklavet 10 millimolar kold HEPES suppleret med antibiotika og inkuber i fem milliliter kollagen type en i 30 minutter ved 37 grader Celsius med kontinuerlig rysten. Efter inkubation, centrifuge røret i fem minutter, ved 150 gange G og vask pellet gang med to milliliter af 10 millimolar HEPES med hvirvlende ved høj hastighed i 30 sekunder.Saml den resulterende suspension fra røret i en 35 millimeter kultur skål og brug tynde pincet til omhyggeligt at overføre vævsfragmenterne til et frisk rør. Derefter inkuberes pellet i en 15 milliliter rør med fem milliliter kollagen type en ved 37 grader Celsius under kontinuerlig omrøring i 35 minutter. Adskil cellerne ved at genbruge med en en milliliter pipette og centrifuge ved 150 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Rengør cellerne to gange ved at genbruge den adskilte pellet i to milliliter komplet DMEM og centrifuging ved 150 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Til plating, genbruge pellet i en milliliter af komplet medium og tilføje det til en brønd af en seks godt celle kultur parabol i et minimum af medium. Hold pladerne uforstyrret ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Efter tre dages inkubation skal du bekræfte væksten tæt på vævsresterne ved at observere cellerne under mikroskopet. Når 1.000 celler er synlige, skal du forsigtigt fjerne vævsresterne med autoklaveret pincet og ændre mediet. Trypsinize cellerne efter at have nået 70% sammenløb og overføre dem til en 75 milliliter vævskultur parabol.Før du begynder analysen, rengør biosikkerhedshætten med 70% ethanol og varm DMEM-mediet til 37 grader Celsius. Dernæst frø 100.000 celler per tilstand i seks godt plader i komplet DMEM og kultur ved 37 grader Celsius. Efter 24 timer skal du udskifte det supernatantmedie med forkalkningsmediet og inkubere cellerne i syv dage ved 37 grader Celsius og erstatte mediet på den tredje dag.Efter syv dage måles calciumkoncentrationen i en 96-brøndplade ved hjælp af Arsenazo III-reagenset og registrering af absorbansen ved 650 nanometer. I den repræsentative analyse blev forskellige ventilcellephoenotyper identificeret med immunfluorescerende farvning efter tre til fem dages kultur. Mouse VIC's udtrykte vimentin og alfa SMA, de betydelige markører af ventilceller.Derudover bekræftede CD31 immunfluorescent farvning ingen forurening fra endotelceller i VIC kultur. Dyrkning VIC's med fosfat rige forkalkning medium stimulere en forkalkning i cellerne, yderligere bekræftet med den røde positive farvning for calciumknuder. Protokollen er baseret på en pulje på tre til fem ventil fra forskellige mus.Brugen af strøelse mate og tre forskellige biologiske replikater er vigtigt at validere resultaterne. Brugen af museventilceller er afgørende for at forstå den molekylære vej, der fører til aorta stenose ved at isolere celler fra transgene mus. Denne protokol har tidligere været anvendt til at undersøge konsekvenserne af vejen til receptor i mineralregression af forkalket aortaklappen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiering af Nyfødte musehud afledt stamceller i Germ-lignende celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering af murint Ventil endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Proteinisolering fra udviklingslandene Embryonale Mouse hjerteklap Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Isolation og 3D kollagen sandwich kultur af primære mus hepatocytter at studere rollen af cytoskelet i galde Canalicular dannelse in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Isolering af primære ventilceller til in vitro-sygdomsmodellering

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...