Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

REMARQUE: Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par l’École de médecine Icahn du noyau institutionnel et du comité d’utilisation du Mont Sinaï.
1. Préparation avant l’isolement des cellules valvulaires de souris adultes
<ol><li>Nettoyer et stériliser tous les instruments chirurgicaux illustrés à la figure 1A en utilisant 70% d’éthanol v/v et ensuite les autoclaver pendant 30 min. nettoyer l’espace de travail chiru...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., G&#233;n&#233;reux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+treatment+of+aortic+stenosis.">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li><li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stenosis+and+heart+failure:+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials.">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification:+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling.">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA/ROCK-dependent+mechanism.">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

Cet article présente un protocole détaillé d’isolement de cellules de valve de souris pour la culture primaire. Trois valves aortiques de souris de 8 semaines ont été mises en commun pour obtenir un nombre proportionné de cellules. De plus, ce protocole décrit la caractérisation du phénotype VIC et l’analyse de minéralisation in vitro. La méthode a été adaptée du protocole précédemment décrit de Mathieu et al.7.
Lors de l’isolem...

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est la maladie cardiaque valvulaire la plus répandue dans les populations occidentales, affectant près de 2,5 % des personnes âgées de plus de 65 ans1. Le CAVD affecte plus de six millions d’Américains et est associé à des changements dans les propriétés mécaniques des folioles qui altèrent le flux sanguin normal1,2. Actuellement, il n’existe aucun traitement pharmacologique pour arrêter la progression de la maladie ou pour activer la régression minérale. La seule thérapie efficace pour traiter le CAVD est le remplacement de la valve aortique par chirurgie ou le remplacement de la valve aortique transcathéter3. Il est donc impératif d’étudier les mécanismes moléculaires conduisant à la minéralisation valvulaire pour identifier de nouvelles cibles pharmacologiques. En effet, la sténose aortique non traitée a plusieurs conséquences néfastes telles que le dysfonctionnement du ventricule gauche et l’insuffisance cardiaque4.
La valve aortique se compose de trois couches connues sous le nom de fibrosa, spongiosa, et ventriculaireis, qui contiennent des VICs comme type prédominant de cellules5. La fibrose et le ventriculaire sont recouverts d’une couche de cellules endothéliales vasculaires (VECs)5. Les VECs règlent la perméabilité des cellules inflammatoires ainsi que des signaux paracrines. Une augmentation du stress mécanique peut affecter l’intégrité des VECs et perturber l’homéostasie de la valve aortique, conduisant à une invasion cellulaire inflammatoire6. Les analyses de microscopie électronique de balayage ont montré l’endothélium perturbé dans une valve aortique calcifiée humaine7.
Les analyses histologiques du tissu calcifié indiquent la présence des osteoblasts et des osteoclasts. En outre, la différenciation ostéogénique des CCI a été observée à la fois in vitro et dans le tissu valvulaire humain8. Ce processus est principalement orchestré par le facteur de transcription lié à Runt 2 (Runx2) et les protéines morphogénétiques osseuses (PGO)8,9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

La calcification des cellules de valve aortique est le cachet de la sténose aortique et est associée à la fibrose de cuspide de valve. Les cellules interstitielles valvulaires (VICs) jouent un rôle important dans le processus de calcification dans la sténose aortique par l’activation de leur programme de dédifférenciation aux cellules osteoblast-comme. Les circuits vit de souris sont un bon outil in vitro pour l’élucidation des voies de signalisation conduisant à la minéralisation de la cellule valvulaire aortique. La méthode décrite ici, utilisée avec succès par ces auteurs, explique comment obtenir des cellules fraîchement isolées. Un procédé en deux étapes de collagénase a été exécuté avec 1 mg/mL et 4.5 mg/mL. La première étape est cruciale pour enlever la couche cellulaire endothéliale et éviter toute contamination. La deuxième incubation de la collagénase consiste à faciliter la migration des CCI du tissu vers la plaque. En outre, un procédé de souillure d’immunofluorescence pour la caractérisation de phénotype des cellules d’isolement de valve de souris est discuté. En outre, l’analyse de calcification a été exécutée in vitro en utilisant le procédé de mesure de réactif de calcium et la souillure rouge d’alizarin. L’utilisation de la culture primaire de cellules de valve de souris est essentielle pour tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin d’inhiber la minéralisation cellulaire in vitro.

Comme les valves aortiques murines mesurent généralement 1 mm de diamètre, au moins trois valves doivent être regroupées pour recueillir un million de cellules viables pour différentes procédures expérimentales. Les différentes étapes du processus d’isolation VIC sont illustrées à la figure 1 et à la figure 2. Comme il est difficile de gratter manuellement le tissu valvulaire, il est préférable d’utiliser le stress de cisaillement créé par l...

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Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Cet article décrit l’isolement des cellules de valve aortique de souris par un procédé en deux étapes de collagénase. Les cellules valvulaires isolées de la souris sont importantes pour effectuer différents essais, tels que ce test de calcification in vitro, et pour étudier les voies moléculaires menant à la minéralisation de la valve aortique.

Isolement des cellules valvulaires interstitielles de souris pour étudier la calcification de la valve aortique in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

L’utilisation de cellules isolées de valve de souris est essentielle pour étudier la voie de signalisation menant à la calcification de valve dans l’utilisation des cellules génétiquement modifiées de souris transgéniques. La digestion en deux étapes est une méthode rapide et efficace. La partie la plus difficile de ce protocole est l’isolement de la valve aortique des souris de huit semaines.Il est préférable de pratiquer sur des souris plus âgées pour mieux visualiser la valve aortique. Avant de commencer l’expérience, nettoyez et stérilisez tous les instruments chirurgicaux et l’espace de travail avec de l’éthanol à 70% et autoclavez les instruments chirurgicaux pendant 30 minutes. Lorsque la configuration initiale est prête, commencez par nettoyer la poitrine et la région de l’abdomen d’une souris euthanasiée de huit semaines à l’aide d’éthanol.À l’aide de ciseaux, ouvrez l’abdomen et la poitrine de la souris, puis coupez entre l’oreillette gauche et le ventricule gauche avec de petits ciseaux chirurgicaux. Retirez le sang du cœur en perfusant 10 millilitres de PBS froid et coupez le cœur, en gardant trois millimètres de l’aorte ascendante. Sous stéréomicroscope, disséquer la valve aortique en coupant le cœur horizontalement au milieu des ventricules et en coupant le ventricule gauche vers l’aorte, puis disséquer soigneusement la valve aortique.Regroupez les valves dans un petit plat de culture de tissus de 35 millimètres. Laver les valves isolées dans un plat de culture cellulaire de 75 millilitres avec cinq millilitres de HEPES froid 10 millimolaires fraîchement préparés complétés par des antibiotiques et incuber dans cinq millilitres de collagénase de type un pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec une secousse continue. Après incubation, centrifuger le tube pendant cinq minutes, à 150 fois G et laver la pastille une fois avec deux millilitres de 10 millilitres d’HEPES 10 millimolaires avec vortex à grande vitesse pendant 30 secondes.Recueillir la suspension résultante du tube dans un plat de culture de 35 millimètres et utiliser une pince à épiler mince pour transférer soigneusement les fragments de tissu dans un tube frais. Incuber ensuite le culot dans un tube de 15 millilitres avec cinq millilitres de collagénase de type un à 37 degrés Celsius sous agitation continue pendant 35 minutes. Séparer les cellules en les ressuscitant à l’aide d’une pipette d’un millilitre et centrifuger à 150 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Nettoyez les cellules deux fois en ressuscitant la pastille séparée dans deux millilitres de DMEM complet et en centrifugant à 150 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Pour le placage, ressusciter le culot dans un millilitre de milieu complet et l’ajouter à un puits d’un plat de culture cellulaire de six puits dans une quantité minimale de milieu. Gardez les plaques intactes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Après trois jours d’incubation, confirmer la croissance près des débris tissulaires en observant les cellules au microscope. Une fois que 1 000 cellules sont visibles, retirez soigneusement les débris tissulaires à l’aide d’une pince autoclavée et changez le milieu. Trypsiniser les cellules après avoir atteint 70% de confluence et les transférer dans un plat de culture de tissu de 75 millilitres.Avant de commencer le test, nettoyez la hotte de biosécurité avec de l’éthanol à 70% et réchauffez le milieu DMEM à 37 degrés Celsius. Ensuite, ensemencez 100 000 cellules par condition dans six plaques de puits en DMEM complet et en culture à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, remplacez le milieu surnageant par le milieu calcifiant et incuber les cellules pendant sept jours à 37 degrés Celsius, en remplaçant le milieu le troisième jour.Après sept jours, mesurer la concentration de calcium dans une plaque de 96 puits en utilisant le réactif Arsenazo III et en enregistrant l’absorbance à 650 nanomètres. Dans l’analyse représentative, de divers phénotypes de cellules de valve ont été identifiés avec la souillure immunofluorescente après trois à cinq jours de culture. Le VImentin et l’alpha SMA exprimés par vic de souris, les marqueurs significatifs des cellules de valve.En plus, la souillure immunofluorescente CD31 n’a vérifié aucune contamination des cellules endothéliales dans la culture de VIC. La culture de VIC avec le milieu calcifiant riche en phosphate stimule une calcification en cellules, plus loin confirmée avec la souillure positive rouge pour des noeuds de calcium. Le protocole est basé sur un pool de trois à cinq valves de différentes souris.L’utilisation de maté de litière et de trois répétitions biologiques différentes est importante pour valider les résultats. L’utilisation de cellules valvulaires de souris est essentielle pour comprendre la voie moléculaire menant à la sténose aortique en isolant les cellules des souris transgéniques. Ce protocole a été employé précédemment pour étudier l’implication de la voie au récepteur dans la régression minérale de la valve aortique calcifiée.

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