Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
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HINWEIS: Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai Institutional Core and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung vor der Ventilzellisolierung von erwachsenen Mäusen
<ol><li>Reinigen und sterilisieren Sie alle in Abbildung 1A gezeigten chirurgischen Instrumente, indem Sie 70% v/v Ethanol verwenden und anschließend 30 min. autoklavieren. Reinigen Sie den chirurgischen Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. 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A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll der Isolierung von Mausklappenzellen für die Primärkultur vor. Drei Aortenklappen von 8 Wochen alten Mäusen wurden gepoolt, um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Charakterisierung des VIC-Phänotyps und den In-vitro-Mineralisierungsassay. Die Methode wurde aus dem zuvor beschriebenen Protokoll von Mathieu et al.7adaptiert.
Bei der Isolieru...

Die verkalkte Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist die häufigste Herzklappenerkrankung in der westlichen Bevölkerung und betrifft fast 2,5% der älteren Menschen über 65 Jahre1. CAVD betrifft über sechs Millionen Amerikaner und ist mit Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der Blättchen verbunden, die den normalen Blutfluss beeinträchtigen1,2. Derzeit gibt es keine pharmakologische Behandlung, um das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen oder die Mineralregression zu aktivieren. Die einzige wirksame Therapie zur Behandlung von CAVD ist der Aortenklappenersatz durch Operation oder der Transkatheter-Aortenklappenersatz3. Es ist daher unerlässlich, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die zur Klappenmineralisierung führen, um neue pharmakologische Ziele zu identifizieren. In der Tat hat eine nicht behandelte Aortenstenose mehrere nachteilige Folgen wie Funktionsstörungen des linken Ventrikels und Herzinsuffizienz4.
Die Aortenklappe besteht aus drei Schichten, die als Fibrosa, Spongiosa und Ventricularis bekannt sind und VICs als vorherrschenden Zelltyp5enthalten. Die Fibrosa und die Ventricularis sind von einer Schicht vaskulärer Endothelzellen (VECs) bedeckt5. Die VECs regulieren die Durchlässigkeit von Entzündungszellen sowie parakrine Signale. Erhöhte mechanische Belastung kann die Integrität der VECs beeinträchtigen und die Homöostase der Aortenklappe stören, was zu einer entzündlichen Zellinvasion führt6. Rasterelektronenmikroskopische Analysen zeigten gestörtes Endothel in einer menschlichen verkalkten Aortenklappe7. 
Histologische Analysen von verkalktem Gewebe zeigen das Vorhandensein von Osteoblasten und Osteoklasten. Weiterhin wurde eine osteogene Differenzierung von VICs sowohl in vitro als auch im menschlichen Klappengewebe beobachtet8. Dieser Prozess wird hauptsächlich durch den Runt-verwandten Transkriptionsfaktor 2 (Runx2) und die knochenmorphogenetischen Proteine (BMPs)8,9orchestriert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

Die Verkalkung von Aortenklappenzellen ist das Kennzeichen der Aortenstenose und ist mit klappenhekrose Fibrose verbunden. Valve Interstitial Cells (VICs) spielen eine wichtige Rolle im Verkalkungsprozess bei Aortenstenosen durch die Aktivierung ihres Dedifferenzierungsprogramms gegenüber osteoblastenähnlichen Zellen. Maus-VICs sind ein gutes In-vitro-Werkzeug zur Aufklärung der Signalwege, die die Mineralisierung der Aortenklappenzelle vorantreiben. Die hier beschriebene Methode, die von diesen Autoren erfolgreich eingesetzt wird, erklärt, wie man frisch isolierte Zellen erhält. Ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren wurde mit 1 mg/ml und 4,5 mg/ml durchgeführt. Der erste Schritt ist entscheidend, um die Endothelzellschicht zu entfernen und jegliche Kontamination zu vermeiden. Die zweite Kollagenase-Inkubation soll die Migration von VICs vom Gewebe zur Platte erleichtern. Darüber hinaus wird ein Immunfluoreszenz-Färbeverfahren zur Phänotypcharakterisierung der isolierten Mausklappenzellen diskutiert. Darüber hinaus wurde der Verkalkungsassay in vitro unter Verwendung des Calciumreagenz-Messverfahrens und der Alizarinrotfärbung durchgeführt. Die Verwendung von Mausklappenzellprimialkultur ist unerlässlich, um neue pharmakologische Ziele zur Hemmung der Zellmineralisierung in vitro zu testen.

Da murine Aortenklappen typischerweise einen Durchmesser von 1 mm haben, müssen mindestens drei Klappen gebündelt werden, um eine Million lebensfähige Zellen für verschiedene experimentelle Verfahren zu sammeln. Die verschiedenen Schritte des VIC-Isolationsprozesses sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Da es schwierig ist, das Klappengewebe manuell abzukratzen, ist es vorzuziehen, die durch Wirbel erzeugte Scherspannung zu verwenden, um die VECs ...

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Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Aortenklappenzellen der Maus durch ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren. Isolierte Mausklappenzellen sind wichtig für die Durchführung verschiedener Assays, wie diesen In-vitro-Verkalkungsassay, und für die Untersuchung der molekularen Wege, die zur Aortenklappenmineralisierung führen.

Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Die Verwendung isolierter Mausklappenzellen ist unerlässlich, um den Signalweg zu untersuchen, der zu einer Klappenverkalkung bei der Verwendung genetisch veränderter Zellen von transgenen Mäusen führt. Die zweistufige Verdauung ist eine schnelle und effiziente Methode. Der schwierigste Teil dieses Protokolls ist die Isolierung der Aortenklappe von achtwöchigen Mäusen.Es ist besser, an älteren Mäusen zu üben, um die Aortenklappe besser zu visualisieren. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen und sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente für 30 Minuten. Wenn die ersteinrichtung fertig ist, beginnen Sie mit der Reinigung der Brust und der Bauchregion einer acht Wochen alten eingeschläferten Maus mit Ethanol.Öffnen Sie mit einer Schere den Bauch und die Brust der Maus und schneiden Sie dann mit einer kleinen chirurgischen Schere zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel. Entfernen Sie Blut aus dem Herzen, indem Sie 10 Milliliter kaltes PBS durchtreiben und das Herz schneiden, wobei Sie drei Millimeter der aufsteigenden Aorta halten. Unter einem Stereomikroskop die Aortenklappe sezieren, indem Sie das Herz horizontal in der Mitte der Ventrikel schneiden und den linken Ventrikel in Richtung Aorta schneiden, dann sezieren Sie vorsichtig die Aortenklappe.Die Ventile werden in einer kleinen 35-Millimeter-Gewebekulturschale zusammengepoolt. Waschen Sie die isolierten Ventile in einer 75 Milliliter Zellkulturschale mit fünf Millilitern frisch zubereitetem 10 Millimolar kaltem HEPES, ergänzt mit Antibiotika, und inkubieren Sie in fünf Millilitern Kollagenase Typ eins für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 150 mal G und waschen das Pellet einmal mit zwei Millilitern 10 Millimolar HEPES mit Wirbeln bei hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden.Sammeln Sie die resultierende Suspension aus dem Röhrchen in eine 35-Millimeter-Kulturschale und verwenden Sie eine dünne Pinzette, um die Gewebefragmente vorsichtig in ein frisches Röhrchen zu überführen. Anschließend wird das Pellet in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Kollagenase Typ eins bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Bewegung für 35 Minuten inkubiert. Trennen Sie die Zellen, indem Sie sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette und einer Zentrifuge bei 150 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius erneut ausbelasten.Reinigen Sie die Zellen zweimal, indem Sie das getrennte Pellet in zwei Millilitern vollständigem DMEM erneut auffüllen und bei 150 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Zum Plattieren das Pellet in einem Milliliter des vollständigen Mediums wieder aufsuchen und in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Zellkulturschale in einer minimalen Menge Medium hinzufügen. Halten Sie die Platten ungestört bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Bestätigen Sie nach drei Tagen Inkubation das Wachstum in der Nähe der Gewebetrümmer, indem Sie die Zellen unter dem Mikroskop beobachten. Sobald 1.000 Zellen sichtbar sind, entfernen Sie vorsichtig die Gewebeablagerungen mit einer autoklavierten Pinzette und wechseln Sie das Medium. Trypsinisieren Sie die Zellen nach Erreichen einer 70% Konfluenz und übertragen Sie sie in eine 75 Milliliter Gewebekulturschale.Bevor Sie mit dem Assay beginnen, reinigen Sie die Biosicherheitshaube mit 70% Ethanol und erwärmen Sie das DMEM-Medium auf 37 Grad Celsius. Als nächstes säen Sie 100.000 Zellen pro Bedingung in sechs Bohrplatten in vollständigem DMEM und Kultur bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das überstandende Medium durch das kalzifizierende Medium und inkubieren Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius, wobei das Medium am dritten Tag ersetzt wird.Messen Sie nach sieben Tagen die Kalziumkonzentration in einer 96-Well-Platte, indem Sie das Arsenazo III-Reagenz verwenden und die Absorption bei 650 Nanometern aufzeichnen. In der repräsentativen Analyse wurden verschiedene Klappenzellphänotypen mit immunfluoreszierender Färbung nach drei bis fünf Tagen Kultur identifiziert. Maus-VIMentin und Alpha-SMA, die signifikanten Marker von Klappenzellen, exprimieren.Darüber hinaus bestätigte die immunfluoreszierende CD31-Färbung keine Kontamination durch Endothelzellen in VIC-Kultur. Die Kultivierung von VIC's mit phosphatreichem verkalkendem Medium stimuliert eine Verkalkung in den Zellen, was durch die rote positive Färbung für Kalziumknoten weiter bestätigt wird. Das Protokoll basiert auf einem Pool von drei bis fünf Ventilen von verschiedenen Mäusen.Die Verwendung von Streupartnern und drei verschiedenen biologischen Replikaten ist wichtig, um die Ergebnisse zu validieren. Die Verwendung von Mausklappenzellen ist wichtig, um den molekularen Weg zu verstehen, der zur Aortenstenose führt, indem Zellen von transgenen Mäusen isoliert werden. Dieses Protokoll wurde bereits verwendet, um die Implikation des Signalwegs zum Rezeptor bei der mineralischen Regression der verkalkten Aortenklappe zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Isolation und 3D Kollagen Sandwich Kultur der primären Maus Hepatozyten, um die Rolle des Zytoskeletts in Bile Canalicular Formation In Vitro zu studieren

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Isolierung humaner primärer Klappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...