Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
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참고: 여기에 설명된 모든 동물 절차는 마운트 시나이 기관 핵심 및 사용 위원회에서 Icahn 의과 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 성인 마우스에서 밸브 세포 격리 전에 준비
<ol><li>도 1A에 표시된 모든 수술 기구를 70% v/v 에탄올을 사용하고 30분 동안 자동 으로 자동화하여 모든 수술 기구를 청소하고 살균합니다.</li>
	<li>페니실린 연쇄 절제술 500μL을 10mm H...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. 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A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

이 문서에서는 1차 배양에 대한 마우스 밸브 셀 격리의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 8주 된 마우스의 3개의 대동맥 판막은 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 풀링되었습니다. 또한, 본 프로토콜은 VIC 표현형및 체외 광물화 분석의 특성화를설명합니다. 이 방법은 이전에 설명된 마티유 등으로부터 이전에 설명된 프로토콜로부터 적용하였다.7.
?...

석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 1 세 이상 노인 개인의 거의 2.5 %에 영향을 미치는 서양 인구에서 가장 널리 퍼진 valvular 심장질환입니다. CAVD는 6백만 명 이상의 미국인에게 영향을 미치며 정상적인 혈류를 통해1,2를 손상시키는 전단지의 기계적 특성의 변화와 관련이있습니다. 현재 질병의 진행을 중단하거나 미네랄 회귀를 활성화하는 약리학적 치료법은 없습니다. CAVD를 치료하는 유일한 효과적인 치료법은 수술 또는 경피 대동맥 판막 교체3에의한 대동맥 판막 교체입니다. 따라서 새로운 약리학적 인 표적을 식별하기 위해 밸브 광물화로 이어지는 분자 메커니즘을 조사하는 것이 필수적입니다. 실제로, 비처리 대동맥 협착증은 좌심실 기능 장애 및 심부전 4와 같은 몇몇 불리한 결과를 가지고있습니다.
대동맥 판막은 주성 세포 유형5로VICs를 포함하는 섬유증, 스폰지 오사 및 심실증으로 알려진 3 개의 층으로 구성됩니다. 섬유증 및 심실증은 혈관 내피 세포(VEC)5층으로덮여 있다. VEC는 염증 성 세포의 투과성뿐만 아니라 파라크린 신호를 조절합니다. 증가된 기계적 응력은 VEC의 무결성에 영향을 미치고 대동맥 판막의 항상성을 방해하여 염증성 세포 침입6으로이어질 수 있다. 스캐닝 전자 현미경 분석은 인간 석회화 대동맥 판막7에서중단된 내피엄을 보였다. 
석회화 된 조직의 조직학적 분석은 골세포와 골세포의 존재를 드러낸다. 더욱이, VIC의 골성 분화는 체외 및 인간 판막 조직8모두에서 관찰되었다. 이 과정은 주로 Runt 관련 전사 인자 2 (Runx2) 및 뼈 형태 유전학 단백질 (BmPs)8,9에의해 오케스트레이션된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

대동맥 판막 세포의 석회화는 대동맥 협착증의 특징이며 판막 cusp 섬유증과 관련이 있습니다. 판막 간질 세포(VIC)는 골다브라스트와 같은 세포에 대한 그들의 비차별 프로그램의 활성화를 통해 대동맥 협착증의 석회화 과정에서 중요한 역할을 한다. 마우스 VICs는 대동맥 밸브 셀의 광물화를 구동하는 신호 경로의 용해를 위한 좋은 시험관내 도구입니다. 본 명세서에 기술된 방법은, 이 저자에 의해 성공적으로 이용되고, 새로 고립된 세포를 얻는 방법을 설명합니다. 2 단계 콜라게나아제 절차는 1 mg/mL 및 4.5 mg/mL로 수행되었습니다. 첫 번째 단계는 내피 세포 층을 제거하고 오염을 피하는 것이 중요합니다. 두 번째 콜라게나아제 인큐베이션은 조직에서 플레이트로 의 VICs의 이동을 용이하게 하는 것이다. 또한, 분리된 마우스 밸브 세포의 표현형 특성화를 위한 면역형 염색 절차가 논의된다. 더욱이, 석회화 분석법은 칼슘 시약 측정 절차 및 알리자린 붉은 염색을 사용하여 체외에서 수행되었다. 마우스 밸브 세포 1 차 배양의 사용은 체외에서 세포 광물화를 억제하기 위해 새로운 약리학적 표적을 테스트하는 데 필수적입니다.

murine 대동맥 판막은 일반적으로 직경이 1mm이기 때문에, 다른 실험 절차를 위해 백만 개의 실행 가능한 세포를 수집하기 위해 적어도 3 개의 밸브를 풀링해야합니다. VIC 격리 프로세스의 다른 단계는 도 1 및 도 2에표시됩니다. 밸브 조직을 수동으로 긁어내는 것이 어렵기 때문에, VEC를 제거하기 위해 소용돌이에 의해 생성된 전단 응력사용이 바람직하다...

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Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

이 문서에서는 2단계 콜라게나아제 절차에 의한 마우스 대동맥 판막 세포의 분리에 대해 설명합니다. 격리된 마우스 밸브 세포는 체외 석회화 분석과 같은 상이한 분석체를 수행하고 대동맥 판막 광물화로 이어지는 분자 경로를 조사하는 데 중요합니다.

시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

분리된 마우스 판막 세포의 사용은 형질전환 마우스에서 유전자 변형 된 세포의 사용에 밸브 석회화로 이어지는 신호 경로를 조사하는 데 필수적이다. 2단계 소화는 빠르고 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 8 주 마우스에서 대동맥 판막의 격리입니다.대동맥 판막을 더 잘 시각화하기 위해 오래된 마우스를 연습하는 것이 좋습니다. 실험을 시작하기 전에 모든 수술 기구와 작업 공간을 70 %의 에탄올로 청소하고 살균하고 수술 기구를 30 분 동안 자동 복제하십시오. 초기 설정이 준비되면 에탄올을 사용하여 8 주 된 안락사 마우스의 가슴과 복부 부위를 청소하는 것으로 시작합니다.가위를 사용하여 복부와 마우스 가슴을 열고 왼쪽 아트리움과 왼쪽 심실 사이를 작은 수술 가위로 잘라냅니다. 차가운 PBS의 10 밀리리터를 퍼포워심장에서 혈액을 제거하고 심장을 잘라 서 기른 대어타3밀리미터를 유지합니다. 스테레오현미경으로 심실 중간에 심장을 수평으로 절단하고 좌심실을 대동맥쪽으로 절단한 다음 대동맥 판막을 조심스럽게 해부합니다.작은 35밀리미터 조직 배양 접시에 함께 밸브를 풀링합니다. 75 밀리리터 세포 배양 접시에 분리된 밸브를 세척하여 항생제로 보충된 10밀리머 콜드 헤페스 5밀리리터를 넣고 37도에서 30분 동안 콜라게나아제 타입 의 5밀리리터를 배양합니다. 인큐베이션 후, 튜브를 150배 G로 5분간 원심분리하고 10밀리미터 HEPES 2밀리리터로 30초 동안 고속으로 겔화하여 펠릿을 한 번 씻습니다.35밀리미터 배양 접시에 튜브에서 결과 현탁액을 수집하고 조심스럽게 신선한 튜브로 조직 조각을 전송하는 얇은 핀셋을 사용합니다. 그런 다음 15 밀리리터 튜브에 펠릿을 배양하고 35 분 동안 지속적인 동요하에서 섭씨 37도에서 콜라게나아제 타입 1 5 밀리리터를 사용합니다. 섭씨 4도에서 5분간 1밀리리터 파이펫과 원심분리기를 150회 G로 재연하여 세포를 분리합니다.완전한 DMEM의 2밀리리터에서 분리된 펠릿을 다시 중단하고 섭씨 4도에서 5분 동안 150회 G에서 원심분리하여 세포를 두 번 청소하십시오. 도금의 경우, 완전한 매체의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단하고 최소 한량의 배지로 6개의 잘 된 세포 배양 접시 중 하나에 첨가하십시오. 이산화탄소5%를 37도에서 방해받지 않도록 플레이트를 보관하십시오.3일간의 잠복 후, 현미경의 밑에 세포를 관찰하여 조직 파편에 가까운 성장을 확인합니다. 일단 1, 000 세포가 보이는, 신중하게 자동 적인 핀셋으로 조직 파편을 제거하고 매체를 변경합니다. 70%의 합류에 도달한 후 세포를 트립시닉하고 75 밀리리터 조직 배양 접시로 옮기습니다.분석을 시작하기 전에 생체 안전 후드를 70%에탄올로 청소하고 DMEM 중간을 섭씨 37도로 데우도록 데워주세요. 다음으로, 조건당 100, 000세포를 완전한 DMEM및 37도의 배양으로 6개의 우물 판으로 넣습니다. 24시간 후, 상체 배지를 석회화 매체로 교체하고 7일간 세포를 섭씨 37도에서 배양하여 3일째배지를 교체한다.7일 후, 아르세나조 III 시약을 사용하고 650나노미터에서 흡광도를 기록하여 96웰 플레이트에서 칼슘 농도를 측정한다. 대표적인 분석에서, 다양한 판막 세포 표현형은 3~5일 의 배양 후 면역형 염색으로 확인되었다. 마우스 VIC의 발현 바이멘틴 과 알파 SMA, 밸브 세포의 중요한 마커.추가적으로, CD31 면역형광 염색은 VIC 배양에 있는 내피 세포에서 오염이 확인되지 않았습니다. 인산염이 풍부한 석회화 매체를 가진 VIC를 배양하면 세포의 석회화를 자극하며 칼슘 노드에 대한 적색 양성 얼룩으로 더욱 확인됩니다. 프로토콜은 다른 마우스에서 3 ~ 5 밸브의 풀을 기반으로합니다.쓰레기 메이트와 세 가지 다른 생물학적 복제의 사용은 연구 결과를 검증하는 것이 중요합니다. 마우스 판막 세포의 사용은 형질전환 마우스에서 세포를 격리하여 대동맥 협착증으로 이어지는 분자 경로를 이해하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 석회화 대동맥 판막의 미네랄 회귀에서 수용체에 통로의 의미를 조사하기 위해 이전에 사용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

마우스의 Cajal (ICC) 네트워크의 중간 세포의 시각화

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...