Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

MERK: Alle dyreprosedyrer som er beskrevet her, er godkjent av Icahn School of Medicine ved Mount Sinai institusjonelle kjerne- og brukskomité.
1. Klargjøring før ventilcelleisolasjon fra voksne mus
<ol><li>Rengjør og steriliser alle kirurgiske instrumenter som er vist i figur 1A ved å bruke 70 % v/v etanol og deretter autoklavere dem i 30 min. Rengjør det kirurgiske arbeidsområdet med 70 % etanol.</li>
	<li>Tilsett 500 μL penicillin-streptomycin til 50 ...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., G&#233;n&#233;reux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+treatment+of+aortic+stenosis.">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li><li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stenosis+and+heart+failure:+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials.">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+follows+function:+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering.">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li><li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve+interstitial+cells:+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification.">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li><li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics:+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification:+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling.">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA/ROCK-dependent+mechanism.">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for museventilcelleisolasjon for primærkultur. Tre aortaventiler fra 8 uker gamle mus ble samlet for å oppnå et tilstrekkelig antall celler. I tillegg beskriver denne protokollen karakteriseringen av VIC fenotype og in vitro mineraliseringsanalysen. Metoden ble tilpasset fra den tidligere beskrevne protokollen fra Mathieu et al.7.
Under isolering av aortaventiler må det tas hensyn til å unngå a...

Forkalket aortaklaffsykdom (CAVD) er den mest utbredte valvulære hjertesykdommen i vestlige populasjoner, som påvirker nesten 2,5% av eldre personer over 65 år1. CAVD påvirker over seks millioner amerikanere og er forbundet med endringer i de mekaniske egenskapene til brosjyrene som svekker normal blodstrømgjennomstrømning 1,2. For tiden er det ingen farmakologisk behandling for å stoppe sykdomsprogresjonen eller for å aktivere mineralregresjon. Den eneste effektive behandlingen for å behandle CAVD er aortaventilutskifting ved kirurgi eller transkateter aortaventil erstatning3. Det er derfor viktig å undersøke molekylære mekanismer som fører til ventilmineralisering for å identifisere nye farmakologiske mål. Faktisk har ikke-behandlet aortastenose flere negative konsekvenser som venstre ventrikel dysfunksjon og hjertesvikt4.
Aortaventilen består av tre lag kjent som fibrosa, spongiosa og ventrikulæris, som inneholder VICer som den dominerende celletypen5. Fibrosa og ventrikkel er dekket av et lag av vaskulære endotelceller (VECer)5. VECene regulerer permeabiliteten til inflammatoriske celler samt parakrinesignaler. Økt mekanisk stress kan påvirke integriteten til VECene og forstyrre homeostase av aortaventilen, noe som fører til inflammatorisk celleinvasjon6. Skanning av elektronmikroskopianalyser viste forstyrret endotel i en menneskelig forkalket aortaventil7. 
Histologiske analyser av forkalket vev avslører tilstedeværelsen av osteoblaster og osteoklaster. Videre ble osteogen differensiering av VICs observert både in vitro og i humant ventilvev8. Denne prosessen er hovedsakelig orkestrert av Runt-relatert transkripsjonsfaktor 2 (Runx2) og benmorfogenetiske proteiner (BMPer)8,9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

Forkalkning av aortaventilceller er kjennetegnet på aortastenose og er forbundet med ventil cusp fibrose. Ventilinterstitielle celler (VICs) spiller en viktig rolle i forkalkningsprosessen i aortastenose gjennom aktivering av deres dedifferentiasjonsprogram til osteoblastlignende celler. Mouse VICs er et godt in vitro-verktøy for belysning av signalveiene som driver mineraliseringen av aortaventilcellen. Metoden beskrevet heri, vellykket brukt av disse forfatterne, forklarer hvordan du får tak i nyisolerte celler. En to-trinns kollagenalisseprosedyre ble utført med 1 mg/ml og 4,5 mg/ml. Det første trinnet er avgjørende for å fjerne endotelcellelaget og unngå forurensning. Den andre kollagenalinkubasjonen er å lette migreringen av VIC-er fra vevet til platen. I tillegg diskuteres en immunfluorescensfargingsprosedyre for fenotypekarakterisering av de isolerte museventilcellene. Videre ble forkalkningsanalysen utført in vitro ved hjelp av kalsiumreagensmålingsprosedyren og alizarin rød farging. Bruk av museventilcelle primærkultur er avgjørende for å teste nye farmakologiske mål for å hemme cellemineralisering in vitro.

Siden murine aortaventiler vanligvis er 1 mm i diameter, må minst tre ventiler samles for å samle en million levedyktige celler for forskjellige eksperimentelle prosedyrer. De ulike trinnene i VIC-isolasjonsprosessen er vist i figur 1 og figur 2. Siden det er vanskelig å skrape ventilvevet manuelt, er det å foretrekke å bruke skjærspenning opprettet ved vortexing for å fjerne VECene. Faktisk viste CD31 immunfluorescence farging resultater fraværet av end...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Denne artikkelen beskriver isolering av museaortaventilceller ved hjelp av en to-trinns kollagenalensprosedyre. Isolerte museventilceller er viktige for å utføre forskjellige analyser, for eksempel denne in vitro-forkalkningsanalysen, og for å undersøke de molekylære veiene som fører til aortaventilmineralisering.

Isolering av mus interstitial ventilceller for å studere forkalkning av aortaventilen in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Bruken av isolerte museventilceller er avgjørende for å undersøke signalveien som fører til ventilforkalkning ved bruk av genetisk modifiserte celler fra transgene mus. Totrinns fordøyelsen er en rask og effektiv metode. Den mest utfordrende delen av denne protokollen er isolering av aortaventilen fra åtte uker mus.Det er bedre å øve på eldre mus for å visualisere aortaventilen bedre. Før du starter eksperimentet, rengjør og steriliser alle kirurgiske instrumenter og arbeidsområde med 70% etanol og autoklaver de kirurgiske instrumentene i 30 minutter. Når det første oppsettet er klart, begynn med å rengjøre brystet og mageregionen til en åtte uker gammel euthanized mus ved hjelp av etanol.Bruk saks, åpne magen og brystet på musen, og kutt deretter mellom venstre atrium og venstre ventrikel med liten kirurgisk saks. Fjern blod fra hjertet ved å parfyme 10 milliliter kald PBS og kutte hjertet, og hold tre millimeter av den stigende aorta. Under et stereomikroskop dissekerer du aortaventilen ved å kutte hjertet horisontalt midt på ventriklene og kutte venstre ventrikel mot aorta, og deretter forsiktig dissekere aortaventilen.Pulje ventilene sammen i en liten 35 millimeter vev kultur parabolen. Vask de isolerte ventilene i en 75 milliliter cellekulturrett med fem milliliter nylagde 10 millimolar kald HEPES supplert med antibiotika og inkuber i fem milliliter kollagenaliser type en i 30 minutter ved 37 grader Celsius med kontinuerlig risting. Etter inkubasjon, sentrifuger røret i fem minutter, ved 150 ganger G og vask pellet en gang med to milliliter 10 millimolar HEPES med virvel i høy hastighet i 30 sekunder.Samle den resulterende suspensjonen fra røret i en 35 millimeter kulturrett og bruk tynne pinsett for å forsiktig overføre vevsfragmentene til et friskt rør. Inkuber deretter pelletsen i et 15 milliliter rør med fem milliliter kollagenaliser type en ved 37 grader Celsius under kontinuerlig agitasjon i 35 minutter. Skill cellene ved å resuspendere med en milliliter pipette og sentrifuge ved 150 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Rengjør cellene to ganger ved å resuspendere den separerte pellet i to milliliter fullstendig DMEM og sentrifugering ved 150 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. For plating, resuspend pellet i en milliliter av komplett medium og legg den til en brønn av en seks brønncelle kulturrett i et minimum av medium. Hold platene uforstyrret ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Etter tre dager med inkubasjon, bekreft vekst nær vevsavfallet ved å observere cellene under mikroskopet. Når 1000 celler er synlige, fjern forsiktig vevsrester med autoklavede pinsett og bytt medium. Prøv cellene etter å ha nådd 70% samløp og overfør dem til en 75 milliliter vevskulturrett.Før du begynner analysen, rengjør den biosikkerhetshetten med 70% etanol og varm DMEM-mediet til 37 grader Celsius. Deretter frø 100.000 celler per tilstand i seks brønnplater i komplett DMEM og kultur ved 37 grader Celsius. Etter 24 timer erstatter du det supernatante mediet med forkalkningsmediet og inkuberer cellene i syv dager ved 37 grader Celsius, og erstatter mediet på den tredje dagen.Etter syv dager måler du kalsiumkonsentrasjonen i en 96 brønnplate ved å bruke Arsenazo III-reagenset og registrere absorbansen ved 650 nanometer. I den representative analysen ble ulike ventilcellefenotyper identifisert med immunfluorescerende farging etter tre til fem dager med kultur. Mouse VIC uttrykte vimentin og alfa SMA, de betydelige markørene til ventilceller.I tillegg bekreftet CD31 immunfluorescerende farging ingen forurensning fra endotelceller i VIC-kulturen. Culturing VIC's med fosfatrik forkalkningsmedium stimulerer en forkalkning i celler, ytterligere bekreftet med den røde positive fargingen for kalsiumnoder. Protokollen er basert på et basseng på tre til fem ventiler fra forskjellige mus.Bruk av kullsør og tre forskjellige biologiske replikeringer er viktig for å validere funnene. Bruken av museventilceller er viktig for å forstå den molekylære banen som fører til aortastenose ved å isolere celler fra transgene mus. Denne protokollen har tidligere blitt brukt til å undersøke implikasjonen av veien til reseptor i mineralregresjon av forkalket aortaventil.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differensiering av nyfødte mus Skin Avledet stamceller inn Germ-lignende celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av Murint Valve endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Protein Isolasjon fra utviklings Embryonic Mouse hjertet ventil Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Isolasjon og 3D kollagen sandwich kultur av primær mus hepatocytter å studere rollen til cytoskeleton i galle Canalicular dannelse in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Isolering av humane primære ventilceller for in vitro sykdomsmodellering

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...