Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

NOTA: Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no comitê institucional de núcleo e uso do Monte Sinai.
1. Preparação antes do isolamento da célula da válvula de camundongos adultos
<ol><li>Limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos mostrados na Figura 1A utilizando 70% de v/v de etanol e, posteriormente, autoclavando-os por 30 minutos. limpe o espaço cirúrgico com 70% de etanol.</li>
	<li>Adici...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., G&#233;n&#233;reux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+treatment+of+aortic+stenosis.">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li><li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stenosis+and+heart+failure:+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials.">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+follows+function:+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering.">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li><li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve+interstitial+cells:+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification.">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li><li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics:+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification:+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling.">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA/ROCK-dependent+mechanism.">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

Este artigo apresenta um protocolo detalhado do isolamento celular da válvula do rato para a cultura primária. Três válvulas aórticas de camundongos de 8 semanas foram agrupadas para obter um número adequado de células. Além disso, este protocolo descreve a caracterização do fenótipo VIC e o ensaio de mineralização in vitro. O método foi adaptado do protocolo descrito anteriormente por Mathieu et al.7.
Durante o isolamento das válvulas ...

A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD) é a doença cardíaca valvular mais prevalente nas populações ocidentais, afetando quase 2,5% dos idosos com mais de 65 anos de idade1. Cavd afeta mais de seis milhões de americanos e está associado a mudanças nas propriedades mecânicas dos folhetos que prejudicam o fluxo sanguíneo normal1,2. Atualmente, não há tratamento farmacológico para impedir a progressão da doença ou ativar a regressão mineral. A única terapia eficaz para tratar cavd é a substituição da válvula aórtica por cirurgia ou substituição da válvula aórtica transcateter3. Por isso, é imprescindível investigar os mecanismos moleculares que levam à mineralização da válvula para identificar novos alvos farmacológicos. De fato, a estenose aórtica não tratada tem várias consequências adversas, como disfunção ventrículo esquerda e insuficiência cardíaca4.
A válvula aórtica consiste em três camadas conhecidas como fibrosa, esponiosa e ventricular, que contêm VICs como a célula predominante tipo5. A fibrosa e a ventricular são cobertas por uma camada de células endoteliais vasculares (VECs)5. Os VECs regulam a permeabilidade das células inflamatórias, bem como os sinais paracrinos. O aumento do estresse mecânico pode afetar a integridade dos VECs e perturbar a homeostase da válvula aórtica, levando à invasão celular inflamatória6. As análises de microscopia eletrônica de varredura mostraram endotélio interrompido em uma válvula aórtica calcificada humana7. 
Análises histológicas do tecido calcificado revelam a presença de osteoblastos e osteoclartos. Além disso, observou-se diferenciação osteogênica dos VICs tanto in vitro quanto no tecido da válvula humana8. Este processo é orquestrado principalmente pelo fator de transcrição relacionado ao Runt 2 (Runx2) e pelas proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs)8,9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

A calcificação das células válvulas aórticas é a marca registrada da estenose aórtica e está associada à fibrose da cúmlica da válvula. As células intersticiais da válvula (VICs) desempenham um papel importante no processo de calcificação na estenose aórtica através da ativação de seu programa de desdiferente para células semelhantes a osteoblastos. Os VICs do mouse são uma boa ferramenta in vitro para a elucidação das vias de sinalização que conduzem a mineralização da célula da válvula aórtica. O método aqui descrito, utilizado com sucesso por esses autores, explica como obter células recém-isoladas. Foi realizado um procedimento de colagem em duas etapas com 1 mg/mL e 4,5 mg/mL. O primeiro passo é crucial para remover a camada celular endotelial e evitar qualquer contaminação. A segunda incubação de colagem é facilitar a migração de VICs do tecido para a placa. Além disso, discute-se um procedimento de coloração de imunofluorescência para a caracterização do fenótipo das células da válvula isolada do rato. Além disso, o ensaio de calcificação foi realizado in vitro utilizando-se o procedimento de medição do reagente de cálcio e a coloração vermelha de alizarina. O uso da cultura primária da célula de válvula de camundongos é essencial para testar novos alvos farmacológicos para inibir a mineralização celular in vitro.

Como as válvulas aórticas murinas têm tipicamente 1 mm de diâmetro, pelo menos três válvulas devem ser agrupadas para coletar um milhão de células viáveis para diferentes procedimentos experimentais. As diferentes etapas do processo de isolamento VIC são mostradas na Figura 1 e Figura 2. Como é difícil raspar manualmente o tecido da válvula, é preferível usar o estresse de tesoura criado por vórtice para remover os VECs. De fato, os resultados da...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Este artigo descreve o isolamento das células da válvula aórtica do rato por um procedimento de colagem de duas etapas. Células de válvulas isoladas do rato são importantes para a realização de diferentes ensaios, como este ensaio de calcificação in vitro, e para investigar as vias moleculares que levam à mineralização da válvula aórtica.

Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

O uso de células válvulas isoladas de camundongos é essencial para investigar a via de sinalização que leva à calcificação da válvula no uso de células geneticamente modificadas de camundongos transgênicos. A digestão em duas etapas é um método rápido e eficiente. A parte mais desafiadora deste protocolo é o isolamento da válvula aórtica de oito semanas de ratos.É melhor praticar em ratos mais velhos para visualizar melhor a válvula aórtica. Antes de iniciar o experimento, limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e espaço de trabalho com 70% de etanol e autoclave os instrumentos cirúrgicos por 30 minutos. Quando a configuração inicial estiver pronta, comece com a limpeza do peito e da região do abdômen de um rato eutanizado de oito semanas usando etanol.Usando uma tesoura, abra o abdômen e o peito do rato, depois corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo com uma pequena tesoura cirúrgica. Remova o sangue do coração perfundiando 10 mililitros de PBS frio e corte o coração, mantendo três milímetros da aorta ascendente. Sob um estereótipo, disseca a válvula aórtica cortando o coração horizontalmente no meio dos ventrículos e cortando o ventrículo esquerdo em direção à aorta, em seguida, dissecar cuidadosamente a válvula aórtica.Misture as válvulas em um pequeno prato de cultura de tecido de 35 milímetros. Lave as válvulas isoladas em um prato de cultura de células de 75 mililitros com cinco mililitros de HEPES frios recém-preparados de 10 mililitros complementados com antibióticos e incubar em cinco mililitros de colagenase tipo um por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação contínua. Após a incubação, centrifugar o tubo por cinco minutos, a 150 vezes G e lavar a pelota uma vez com dois mililitros de 10 mililitros HEPES com vórtice em alta velocidade por 30 segundos.Colete a suspensão resultante do tubo em um prato de cultura de 35 milímetros e use pinças finas para transferir cuidadosamente os fragmentos de tecido para um tubo fresco. Em seguida, incubar a pelota em um tubo de 15 mililitros com cinco mililitros de colagenase tipo um a 37 graus Celsius sob agitação contínua por 35 minutos. Separe as células reutilizando com uma pipeta de um mililitro e centrífuga a 150 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Limpe as células duas vezes, reutilizando a pelota separada em dois mililitros de DMEM completos e centrifugando a 150 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Para chapeamento, resuspengue a pelota em um mililitro de meio completo e adicione-a a um poço de um prato de cultura de seis poços em uma quantidade mínima de meio. Mantenha as placas intactas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Após três dias de incubação, confirme o crescimento próximo aos detritos teciduais observando as células sob o microscópio. Uma vez que 1.000 células são visíveis, remova cuidadosamente os detritos teciduais com pinças autoclavadas e mude o meio. Trypsinize as células depois de atingir 70% de confluência e transfira-as para um prato de cultura de tecido de 75 mililitros.Antes de iniciar o ensaio, limpe o capô de biossegurança com 70% de etanol e aqueça o MMEM médio a 37 graus Celsius. Em seguida, sementes 100.000 células por condição em seis placas de poço em DMEM completo e cultura a 37 graus Celsius. Após 24 horas, substitua o meio supernante pelo meio calcificador e incuba as células por sete dias a 37 graus Celsius, substituindo o meio no terceiro dia.Após sete dias, meça a concentração de cálcio em uma placa de 96 poços usando o reagente Arsenazo III e registrando a absorvância em 650 nanômetros. Na análise representativa, vários fenótipos de células válvulas foram identificados com coloração imunofluorescente após três a cinco dias de cultura. Mouse VIC expressou vimentina e Alpha SMA, os marcadores significativos das células válvulas.Além disso, a coloração imunofluorescente CD31 não verificou contaminação de células endoteliais na cultura VIC. Vic's de culturing com meio calcificador rico em fosfato estimulam uma calcificação nas células, ainda confirmada com a coloração positiva vermelha para nódulos de cálcio. O protocolo é baseado em um pool de três a cinco válvulas de diferentes ratos.O uso de erva-ninhada e três diferentes réplicas biológicas é importante para validar os achados. O uso de células válvulas de camundongos é vital para entender o caminho molecular que leva à estenose aórtica isolando células de camundongos transgênicos. Este protocolo tem sido usado anteriormente para investigar a implicação do caminho para o receptor na regressão mineral da válvula aórtica calcificada.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Visualização das células intersticiais de Cajal Network (ICC) em ratos

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Isolamento e cultura sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários para estudar o papel do citoesqueleto na formação bile canalicular in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...