Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры для животных, описанные здесь, были одобрены Медицинской школой Икана в Институциональном ядре и комитете по использованию горы Синай.
1. Подготовка перед изоляцией клеток клапана у взрослых мышей
<ol><li>Очистите и стерилизуйте все хирургические...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., G&#233;n&#233;reux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+treatment+of+aortic+stenosis.">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li><li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stenosis+and+heart+failure:+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials.">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+follows+function:+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering.">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li><li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve+interstitial+cells:+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification.">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li><li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics:+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification:+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling.">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA/ROCK-dependent+mechanism.">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

В этой статье представлен подробный протокол изоляции клеток мышиного клапана для первичной культуры. Три аортального клапана у 8-недельных мышей были объединены для получения достаточного количества клеток. Кроме того, этот протокол описывает характеристику фенотипа ВИЦ и анализ ми?...

Кальцинированная болезнь аортального клапана (CAVD) является наиболее распространенным заболеванием клапанного сердца в западных популяциях, затрагивающим почти 2,5% пожилых людей старше 65 лет1года. CAVD поражает более шести миллионов американцев и связан с изменениями механических свойств листочков, которые ухудшают нормальный кровоток -1,2. В настоящее время не существует фармакологического лечения, чтобы остановить прогрессирование заболевания или активировать минеральную регрессию. Единственной эффективной терапией для лечения CAVD является замена аортального клапана хирургическим путем или транскатетерная замена аортального клапана3. Поэтому крайне важно исследовать молекулярные механизмы, ведущие к минерализации клапанов, для выявления новых фармакологических мишеней. Действительно, нелеченный стеноз аорты имеет несколько неблагоприятных последствий, таких как дисфункция левого желудочка и сердечная недостаточность4.
Аортального клапана состоит из трех слоев, известных как фиброза, губчатая и желудочковая, которые содержат ВИК как преобладающий тип клеток5. Фиброза и желудочковые покрыты слоем эндотелиальных клеток сосудов (VEC)5. VEC регулируют проницаемость воспалительных клеток, а также паракринные сигналы. Повышенное механическое напряжение может повлиять на целостность VEC и нарушить гомеостаз аортального клапана, что приводит к воспалительной инвазии клеток6. Анализ сканирующей электронной микроскопии показал нарушение эндотелия в кальцинированном аортального клапане человека7.
Гистологические анализы кальцинированной ткани выявляют наличие остеобластов и остеокластов. Кроме того, остеогенная дифференцировка ВИК наблюдалась как in vitro, так и в ткани клапана человека8. Этот процесс в основном управляется связанным с Runt фактором транскрипции 2 (Runx2) и костными морфогенетическими белками (BMP)8,9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

Кальцификация клеток аортального клапана является отличительной чертой аортального стеноза и связана с фиброзом клапанного куспида. Клапанные интерстициальные клетки (ВИК) играют важную роль в процессе кальцификации при стенозе аорты путем активации их программы дедифференциации к остеобластоподобным клеткам. Мышиные ВИК являются хорошим инструментом in vitro для выяснения сигнальных путей, приводящих к минерализации клетки аортального клапана. Способ, описанный в настоящем описании, успешно используемый этими авторами, объясняет, как получить свежеизолированные клетки. Двухэтапная процедура коллагеназы проводилась с 1 мг/мл и 4,5 мг/мл. Первый шаг имеет решающее значение для удаления слоя эндотелиальных клеток и предотвращения любого загрязнения. Вторая инкубация коллагеназы предназначена для облегчения миграции ВИК из ткани в пластину. Кроме того, обсуждается процедура иммунофлуоресцентного окрашивания для фенотипной характеристики изолированных клеток мышиного клапана. Кроме того, анализ кальцификации проводили in vitro с использованием процедуры измерения кальциевого реагента и окрашивания ализарином красным цветом. Использование первичной культуры клеток мышиного клапана имеет важное значение для тестирования новых фармакологических мишеней для ингибирования минерализации клеток in vitro.

Поскольку мышиные аортальные клапаны обычно имеют диаметр 1 мм, по крайней мере три клапана должны быть объединены, чтобы собрать миллион жизнеспособных клеток для различных экспериментальных процедур. Различные этапы процесса изоляции ВМЦ показаны на рисунках 1 и <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

В этой статье описывается изоляция клеток аортального клапана мыши с помощью двухэтапной коллагеназы. Изолированные клетки мышиного клапана важны для выполнения различных анализов, таких как этот анализ кальцификации in vitro, и для исследования молекулярных путей, ведущих к минерализации аортального клапана.

Выделение клеток интерстициального клапана мыши для изучения кальцификации аортального клапана in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Использование изолированных клеток мышиного клапана имеет важное значение для исследования сигнального пути, ведущего к кальцификации клапана при использовании генетически модифицированных клеток трансгенных мышей. Двухэтапное пищеварение является быстрым и эффективным методом. Наиболее сложной частью этого протокола является изоляция аортального клапана от восьминедельных мышей.Лучше попрактиковаться на старых мышах, чтобы лучше визуализировать аортальный клапан. Перед началом эксперимента очистите и стерилизуйте все хирургические инструменты и рабочее пространство 70% этанолом и автоклавируйте хирургические инструменты в течение 30 минут. Когда первоначальная установка будет готова, начните с очистки груди и области живота восьминедельной усыпленной мыши с использованием этанола.С помощью ножниц откройте живот и грудную клетку мыши, затем разрезайте между левым предсердием и левым желудочком небольшими хирургическими ножницами. Удалить кровь из сердца путем перфузии 10 миллилитров холодного PBS и разрезать сердце, сохранив три миллиметра восходящей аорты. Под стереомикроскопом рассеките аортальный клапан, разрезав сердце горизонтально в середине желудочков и разрезав левый желудочек по направлению к аорте, затем тщательно рассеките аортальный клапан.Объедините клапаны вместе в небольшую 35-миллиметровую чашку для культивирование тканей. Промыть изолированные клапаны в чашке для культивации клеток 75 миллилитров с пятью миллилитрами свежеприготовленного 10-миллимолярного холодного HEPES, дополненного антибиотиками, и инкубировать в пяти миллилитрах коллагеназы типа один в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия с непрерывным встряхиванием. После инкубации центрифугируют трубку в течение пяти минут, при 150 раз G и промыть гранулу один раз двумя миллилитрами 10 миллимолярных HEPES с вихрем на высокой скорости в течение 30 секунд.Соберите полученную суспензию из трубки в 35-миллиметровую чашку для культивирования и используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно перенести фрагменты ткани в свежую трубку. Затем инкубируют гранулу в 15-миллилитровой трубке с пятью миллилитрами коллагеназы типа один при 37 градусах Цельсия при непрерывном перемешивании в течение 35 минут. Разделите ячейки путем повторного использования с помощью одной миллилитровой пипетки и центрифуги в 150 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Очистите ячейки дважды, повторно инсценировка отделенной гранулы в двух миллилитрах полного DMEM и центрифугирование при 150 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Для нанесения покрытия повторно суспендируют гранулу в одном миллилите полной среды и добавляют ее в одну лунку чашки для культивирования шести лунок в минимальном количестве среды. Держите пластины нетронутыми при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.После трех дней инкубации подтвердите рост вблизи тканевого мусора, наблюдая за клетками под микроскопом. Как только будет видно 1000 клеток, аккуратно удалите остатки тканей автоклавным пинцетем и измените среду. Трипсинизируют клетки после достижения 70% слияния и переносят их в 75-миллилитрную чашку для культуры тканей.Перед началом анализа очистите вытяжку биобезопасности 70% этанолом и нагрейте среду DMEM до 37 градусов по Цельсию. Затем посейте 100 000 клеток в каждое условие в шесть пластин скважины в полном DMEM и культивирует при 37 градусах Цельсия. Через 24 часа замените надпочивающую среду кальцифицирующим средством и инкубируйте клетки в течение семи дней при 37 градусах Цельсия, заменяя среду на третий день.Через семь дней измерьте концентрацию кальция в 96-скважинной пластине с помощью реагента Arsenazo III и записав поглощение на 650 нанометров. В репрезентативном анализе различные фенотипы клеток клапана были идентифицированы с иммунофлуоресцентным окрашиванием после трех-пяти дней культивирования. Мышиные ВИК экспрессировали виментин и альфа-SMA, значимые маркеры клеток клапана.Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание CD31 подтвердило отсутствие загрязнения эндотелиальными клетками в культуре ВМЦ. Культивирование ВИЦ с богатой фосфатами кальцифицирующей средой стимулирует кальцификацию в клетках, что дополнительно подтверждается красным положительным окрашиванием для кальциевых узлов. Протокол основан на пуле от трех до пяти клапанов от разных мышей.Использование помета и трех различных биологических реплик важно для подтверждения результатов. Использование клеток мышиного клапана жизненно важно для понимания молекулярного пути, ведущего к стенозу аорты, путем выделения клеток от трансгенных мышей. Этот протокол использовался ранее для исследования значения пути к рецептору в минеральной регрессии кальцинированного аортального клапана.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Визуализация интерстициальные клетки Кахала (МУС) в сети Мыши

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Генерация Мыши, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Дифференциация новорожденных кожи мышей стволовые клетки в зародышевые-подобных клеток<em&gt; В пробирке</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Белок Выделение из развивающихся эмбриональных Mouse клапанов сердца регионе

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Изоляция и 3D коллаген сэндвич культуры первичных гепатоцитов мыши для изучения роли цитоскелета в Bile Canalicular Формирование в Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Выделение клеток первичного клапана человека для моделирования заболеваний in vitro

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...