Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
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NOTA: Todos los procedimientos animales descritos aquí han sido aprobados por la Escuela de Medicina Icahn en el núcleo institucional y el comité de uso de Mount Sinai.
1. Preparación antes del aislamiento de células valvulares de ratones adultos
<ol><li>Limpiar y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos mostrados en la Figura 1A utilizando etanol al 70% v/v y posteriormente autoclavándolos durante 30 min.</li>
	<li>Añadir 500 μL de penicilina-est...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., G&#233;n&#233;reux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+treatment+of+aortic+stenosis.">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li><li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stenosis+and+heart+failure:+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials.">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. 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T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+follows+function:+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering.">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li><li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve+interstitial+cells:+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification.">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li><li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics:+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification:+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling.">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA/ROCK-dependent+mechanism.">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

Este artículo presenta un protocolo detallado del aislamiento de la célula de la válvula del ratón para la cultura primaria. Tres válvulas aórticas de ratones de 8 semanas de edad se agruparon para obtener un número adecuado de células. Además, este protocolo describe la caracterización del fenotipo VIC y el ensayo de mineralización in vitro. El método fue adaptado del protocolo previamente descrito de Mathieu et al.7.
Durante el aislamien...

La valvulidad aórtica calcificada (CAVD) es la cardiopatía valvular más prevalente en poblaciones occidentales, afectando a casi el 2,5% de los ancianos mayores de 65 años1. CAVD afecta a sobre seis millones de americanos y se asocia a los cambios en las propiedades mecánicas de los prospectos que empeoran la sangre normal fluir-a través1,2. Actualmente, no existe ningún tratamiento farmacológico para detener la progresión de la enfermedad o para activar la regresión mineral. La única terapia eficaz para tratar la CAVD es el reemplazo de la válvula aórtica por cirugía o el reemplazo de la válvula aórtica transcatéter3. Por lo tanto, es imperativo investigar los mecanismos moleculares que conducen a la mineralización valvular para identificar nuevas dianas farmacológicas. De hecho, la estenosis aórtica no tratada tiene varias consecuencias adversas como la disfunción del ventrículo izquierdo y la insuficiencia cardíaca4.
La válvula aórtica consta de tres capas conocidas como fibrosa, espongiosa y ventricularis, que contienen VICs como la célula predominante tipo5. La fibrosa y la ventricularis están cubiertas por una capa de células endoteliales vasculares (BIC)5. Los VÉS regulan la permeabilidad de las células inflamatorias, así como las señales paracrinas. El aumento del estrés mecánico puede afectar la integridad de los VE Y perturbar la homeostasis de la válvula aórtica, llevando a la invasión inflamatoriacelular 6. Los análisis de microscopía electrónica de barrido mostraron endotelio interrumpido en una válvula aórtica calcificada humana7. 
Los análisis histológicos del tejido calcificado revelan la presencia de osteoblastos y de osteoclasts. Además, se observó diferenciación osteogénica de los VICs tanto in vitro como en el tejido valvular humano8. Este proceso está orquestado principalmente por el factor de transcripción 2 relacionado con Runt (Runx2) y las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs)8,9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

La calcificación de las células de la válvula aórtica es el sello de la estenosis aórtica y se asocia a fibrosis de la cúspide de la válvula. Las células intersticiales valvulares (VIC) juegan un papel importante en el proceso de calcificación en la estenosis aórtica a través de la activación de su programa de desdiferenciación a células osteoblasto-similares. Los VICs de ratón son una buena herramienta in vitro para la elucidación de las vías de señalización que impulsan la mineralización de la célula de la válvula aórtica. El método descrito aquí, utilizado con éxito por estos autores, explica cómo obtener células recién aisladas. Un procedimiento de dos pasos de la colagenasa fue realizado con 1 mg/mL y 4.5 mg/mL. El primer paso es crucial para eliminar la capa de células endoteliales y evitar cualquier contaminación. La segunda incubación de colagenasa es para facilitar la migración de los VIC del tejido a la placa. Además, un procedimiento de coloración de la inmunofluorescencia para la caracterización del fenotipo de las células aisladas de la válvula del ratón se discute. Además, el análisis de la calcificación fue realizado in vitro usando el procedimiento de la medida del reactivo del calcio y la coloración roja del alizarin. El uso del cultivo primario de células de válvulas de ratón es esencial para probar nuevas dianas farmacológicas para inhibir la mineralización celular in vitro.

Como las válvulas aórticas murinas tienen típicamente 1 mm de diámetro, se deben agrupar al menos tres válvulas para recolectar un millón de células viables para diferentes procedimientos experimentales. Los diferentes pasos del proceso de aislamiento de VIC se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Como es difícil raspar manualmente el tejido de la válvula, es preferible utilizar la tensión de cizallamiento creada por el vórtice para eliminar los VÉ...

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Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Este artículo describe el aislamiento de las células de la válvula aórtica del ratón por un procedimiento de dos pasos de la colagenasa. Las células aisladas de la válvula de ratón son importantes para realizar diferentes ensayos, como este ensayo de calcificación in vitro, y para investigar las vías moleculares que conducen a la mineralización de la válvula aórtica.

Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

El uso de células aisladas de la válvula del ratón es esencial investigar el camino de la señalización que lleva a la calcificación de la válvula en el uso de células modificadas genético de ratones transgénicos. La digestión en dos pasos es un método rápido y eficiente. La parte más desafiante de este protocolo es el aislamiento de la válvula aórtica a partir de ratones de ocho semanas.Es mejor practicar en ratones mayores para visualizar mejor la válvula aórtica. Antes de comenzar el experimento, limpie y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y el espacio de trabajo con etanol al 70% y autoclave los instrumentos quirúrgicos durante 30 minutos. Cuando la configuración inicial esté lista, comience con la limpieza del pecho y la región del abdomen de un ratón eutanásico de ocho semanas de edad con etanol.Usando tijeras, abra el abdomen y el pecho del ratón, luego corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo con pequeñas tijeras quirúrgicas. Retire la sangre del corazón perfundiendo 10 mililitros de PBS frío y corte el corazón, manteniendo tres milímetros de la aorta ascendente. Debajo de un estereomicroscopio, diseccione la válvula aórtica cortando el corazón horizontalmente en el medio de los ventrículos y cortando el ventrículo izquierdo hacia la aorta, luego diseccione cuidadosamente la válvula aórtica.Aglutica las válvulas en un pequeño plato de cultivo de tejidos de 35 milímetros. Lave las válvulas aisladas en un plato de cultivo celular de 75 mililitros con cinco mililitros de HEPES frío de 10 milimolares recién preparados suplementado con antibióticos e incube en cinco mililitros de colagenasa tipo uno durante 30 minutos a 37 grados Centígrados con agitación continua. Después de la incubación, centrifugar el tubo durante cinco minutos, a 150 veces G y lavar el pellet una vez con dos mililitros de 10 milimolares HEPES con vórtice a alta velocidad durante 30 segundos.Recoja la suspensión resultante del tubo en un plato de cultivo de 35 milímetros y use pinzas delgadas para transferir cuidadosamente los fragmentos de tejido a un tubo fresco. Luego incubar el pellet en un tubo de 15 mililitros con cinco mililitros de colagenasa tipo uno a 37 grados Centígrados bajo agitación continua durante 35 minutos. Separe las células reutilizando con una pipeta de un mililitro y centrífuga a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Limpie las células dos veces reutilizando el pellet separado en dos mililitros de DMEM completo y centrifugando a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados. Para el revestimiento, resuspend el pellet en un mililitro de medio completo y añadirlo a un pozo de un plato de cultivo celular de seis pozos en una cantidad mínima de medio. Mantenga las placas sin ser molestadas a 37 grados Centígrados con un 5% de dióxido de carbono.Después de tres días de incubación, confirme el crecimiento cerca de los restos de tejido observando las células bajo el microscopio. Una vez que 1, 000 células son visibles, retire cuidadosamente los restos de tejido con pinzas en autoclave y cambie el medio. Tripsinizar las células después de alcanzar el 70% de confluencia y transferirlas a un plato de cultivo de tejido de 75 mililitros.Antes de comenzar el ensayo, limpie la campana de bioseguridad con etanol al 70% y caliente el medio DMEM a 37 grados Centígrados. A continuación, sembrar 100, 000 células por condición en seis placas de pozo en DMEM completo y cultivo a 37 grados centígrados. Después de 24 horas, reemplace el medio sobrenadante con el medio calcificante e incube las células durante siete días a 37 grados Celsius, reemplazando el medio en el tercer día.Después de siete días, mida la concentración de calcio en una placa de 96 pozos utilizando el reactivo Arsenazo III y registrando la absorbancia a 650 nanómetros. En el análisis representativo, varios fenotipos de la célula de la válvula fueron identificados con la coloración inmunofluorescente después de tres a cinco días de cultura. Ratón VIC de vimentina expresada y alfa SMA, los marcadores significativos de las células valvulares.Además, la coloración inmunofluorescente CD31 no verificó ninguna contaminación de las células endoteliales en cultura de VIC. El cultivo de VIC con medio calcificante rico en fosfato estimula una calcificación en las células, confirmada aún más con la tinción positiva roja para los ganglios de calcio. El protocolo se basa en un pool de tres a cinco válvulas de diferentes ratones.El uso de pareja de camada y tres réplicas biológicas diferentes es importante para validar los hallazgos. El uso de células de válvula de ratón es vital para comprender la vía molecular que conduce a la estenosis aórtica mediante el aislamiento de células de ratones transgénicos. Este protocolo se ha utilizado previamente para investigar la implicación del camino al receptor en la regresión mineral de la válvula aórtica calcificada.

Research

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Biology

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