Name: isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

OBS: Alla djurförsök som beskrivs här har godkänts av Icahn School of Medicine vid Mount Sinai institutionella kärna och användningskommitté.
1. Förberedelse före isolering av ventilceller från vuxna möss
<ol><li>Rengör och sterilisera alla kirurgiska instrument som visas i figur 1A med hjälp av 70 % v/v etanol och sedan autoklavera dem i 30 minuter.</li>
	<li>Tillsätt 500 μL penicillin-streptomycin till 50 ml 10 mm HEPES. Förbered en alikvot på...

<ol>
	<li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+disease+in+elderly.">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li><li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study.">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li><li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., G&#233;n&#233;reux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+treatment+of+aortic+stenosis.">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li><li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stenosis+and+heart+failure:+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials.">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+follows+function:+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering.">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li><li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve+interstitial+cells:+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification.">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li><li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics:+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis.">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification:+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling.">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li><li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA/ROCK-dependent+mechanism.">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+aortic+valve+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches.">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenazo+III:+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum.">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li><li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis.">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li></ol>

Den här artikeln presenterar ett detaljerat protokoll för musventil cell isolering för primär kultur. Tre aorta ventiler från 8 veckor gamla möss var poolade för att få ett tillräckligt antal celler. Dessutom beskriver detta protokoll karakteriseringen av VIC fenotyp och in vitro mineralisering analys. Metoden anpassades från det tidigare beskrivna protokollet från Mathieu et al.7.
Under isoleringen av kolorektalventiler måste man se till ...

Calcified aorta ventil sjukdom (CAVD) är den vanligaste valvular hjärtsjukdomar i västra populationer, påverkar nästan 2,5% av äldre individer över 65 år1. CAVD påverkar över sex miljoner amerikaner och är förknippat med förändringar i de mekaniska egenskaperna hos broschyrerna som försämrar normalt blodflöde genom1,2. För närvarande finns det ingen farmakologisk behandling för att stoppa sjukdomsförloppet eller aktivera mineralregression. Den enda effektiva behandlingen för behandling av CAVD är aorta ventil ersättning genom kirurgi eller transcatheter aorta ventil ersättning3. Det är därför absolut nödvändigt att undersöka de molekylära mekanismer som leder till ventilmineralisering för att identifiera nya farmakologiska mål. Faktum är att icke-behandlad aortastenos har flera negativa konsekvenser som vänster ventrikel dysfunktion och hjärtsvikt4.
Aortaventilen består av tre lager som kallas fibrosa, spongiosa och ventrikulära, som innehåller VIC som den dominerande celltypen5. Fibrosa och Ventrikulärt är täckta av ett lager av vaskulär endotelceller (VEC)5. VECs reglerar permeabiliteten hos inflammatoriska celler samt parakrina signaler. Ökad mekanisk stress kan påverka VECs integritet och störa aortaventilens homeostas, vilket leder till inflammatorisk cellinvasion6. Scanning elektronmikroskopi analyser visade stört endotel i en mänsklig calcified aorta ventil7. 
Histologiska analyser av förkalkad vävnad avslöjar förekomsten av osteoblaster och osteoklaster. Osteogenic differentiering av VIC observerades dessutom både in vitro och i mänskliga ventil vävnad8. Denna process orkestreras huvudsakligen av Den Runt-relaterade transkriptionsfaktorn 2 (Runx2) och benmorfogenetiska proteiner (BMPs)8,9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle Actin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arsenazo-III reagent set</td>
			<td>POINT SCIENTIFIC</td>
			<td>C7529-500</td>
			<td>a Kit to measure the concentration of calcium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydroxide</td>
			<td>SIGMA -Aldrich 31219</td>
			<td>31219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I&#160; (125 units/mg)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Tthermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco 16000044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M solution</td>
			<td>STEMCELLS TECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap</td>
			<td>Lanza</td>
			<td>VZA-2011</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse interstitial valve cells to study the calcification of the aortic valve in vitro

Förkalkning av aorta ventil celler är kännetecknet för aorta pylorusstenos och är associerad med ventil cusp fibros. Ventil interstitiella celler (VICs) spelar en viktig roll i förkalkningsprocessen i aorta stenos genom aktivering av deras dedifferentieringsprogram till osteoblastliknande celler. Mus-VICs är ett bra in vitro-verktyg för att belysa signalvägarna som driver mineraliseringen av aortaventilcellen. Metoden som beskrivs häri, framgångsrikt används av dessa författare, förklarar hur man får nyisolerade celler. En tvåstegs collagenase förfarande utfördes med 1 mg/mL och 4,5 mg/mL. Det första steget är avgörande för att ta bort det endotelcellsskiktet och undvika förorening. Den andra kollageninkubationen är att underlätta migreringen av VIC från vävnaden till plattan. Dessutom diskuteras en immunofluorescens färgning förfarande för fenotyp karakterisering av isolerade mus ventil celler. Dessutom utfördes förkalkningsanalysen in vitro med hjälp av kalciumreagensmätningsförfarandet och alizarinröd färgning. Användning av musventil cell primär kultur är avgörande för att testa nya farmakologiska mål för att hämma cellmineralisering in vitro.

Eftersom murinaortatikventiler vanligtvis är 1 mm i diameter måste minst tre ventiler slås samman för att samla in en miljon livskraftiga celler för olika experimentella förfaranden. De olika stegen i VIC-isoleringsprocessen visas i figur 1 och figur 2. Eftersom det är svårt att manuellt skrapa ventilvävnaden är det att föredra att använda savspänning som skapas genom virvel för att ta bort VEC: erna. Resultaten av CD31-immunofluorescensfärgning v...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro at JoVE.com

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Denna artikel beskriver isoleringen av musaortaklaffceller genom en tvåstegs kollagenasprocedur. Isolerade musventilceller är viktiga för att utföra olika analyser, såsom denna in vitro-förkalkningsanalys, och för att undersöka de molekylära vägarna som leder till aortaventilmineralisering.

Isolering av musinterstitiella ventilceller för att studera förkalkningen av aortaventilen in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Användningen av isolerade musventilceller är avgörande för att undersöka signalvägen som leder till ventilförkalkning vid användning av genetiskt modifierade celler från transgena möss. Tvåstegs matsmältningen är en snabb och effektiv metod. Den mest utmanande delen av detta protokoll är isoleringen av aortaklaffen från åtta veckors möss.Det är bättre att öva på äldre möss för att visualisera aortaventilen bättre. Innan du påbörjar experimentet, rengör och sterilisera alla kirurgiska instrument och arbetsyta med 70% etanol och autoklavera de kirurgiska instrumenten i 30 minuter. När den första installationen är klar, börja med att rengöra bröstet och bukregionen på en åtta veckor gammal avlivad mus med etanol.Öppna buken och musens bröst med hjälp av sax och skär sedan mellan det vänstra atriumet och vänster ventrikel med liten kirurgisk sax. Ta bort blod från hjärtat genom att perfusera 10 milliliter kall PBS och skär hjärtat och håll tre millimeter av den stigande aortan. Under ett stereomikroskop dissekerar du aortaventilen genom att skära hjärtat horisontellt i mitten av ventriklarna och skära den vänstra ventrikeln mot aortan och dissekera sedan försiktigt aortaventilen.Slå ihop ventilerna i en liten 35 millimeters vävnadskulturrätt. Tvätta de isolerade ventilerna i en 75 milliliter cellkulturrätt med fem milliliter nyberedd 10 millimolär kall HEPES kompletterad med antibiotika och inkubera i fem milliliter kollagenas typ ett i 30 minuter vid 37 grader Celsius med kontinuerlig skakning. Efter inkubation, centrifugera röret i fem minuter, vid 150 gånger G och tvätta pelleten en gång med två milliliter på 10 millimolar HEPES med virvel i hög hastighet i 30 sekunder.Samla den resulterande suspensionen från röret i en 35 millimeters odlingsform och använd tunna pincett för att försiktigt överföra vävnadsfragmenten till ett nytt rör. Inkubera sedan pelleten i ett 15 milliliter rör med fem milliliter kollagenas typ ett vid 37 grader Celsius under kontinuerlig agitation i 35 minuter. Separera cellerna genom att återanvända med en milliliter pipett och centrifugera vid 150 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Rengör cellerna två gånger genom att återanvända den separerade pelleten i två milliliter komplett DMEM och centrifugera vid 150 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. För plätering, återanvänd pelleten i en milliliter komplett medium och tillsätt den till en brunn av en sex brunns cellkulturrätt i en minsta mängd medium. Håll plattorna ostört vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid.Efter tre dagars inkubation, bekräfta tillväxt nära vävnadsskräpet genom att observera cellerna under mikroskopet. När 1 000 celler är synliga, ta försiktigt bort vävnadsskräpet med autoklaverade pincett och byt medium. Trypsinize cellerna efter att ha nått 70%confluency och överföra dem till en 75 milliliter vävnad kultur skål.Innan du påbörjar analysen, rengör biosäkerhetshuven med 70% etanol och värm DMEM-mediet till 37 grader Celsius. Därefter frö 100, 000 celler per tillstånd i sex brunnsplattor i komplett DMEM och kultur vid 37 grader Celsius. Efter 24 timmar, byt ut det övernaturliga mediet mot förkalkningsmediet och inkubera cellerna i sju dagar vid 37 grader Celsius och ersätt mediet på den tredje dagen.Efter sju dagar, mät kalciumkoncentrationen i en 96 brunnsplatta med arsenazo III-reagenset och registrera absorbansen vid 650 nanometer. I den representativa analysen identifierades olika ventil cell fenotyper med immunofluorescent färgning efter tre till fem dagar av kultur. Mus VIC uttrycks vimentin och alfa SMA, de betydande markörerna för ventilceller.Dessutom kontrollerade CD31 immunofluorescerande färgning ingen förorening från endotelceller i VIC kultur. Odling VIC med fosfatrika förkalkningsmedium stimulerar en förkalkning i celler, ytterligare bekräftas med den röda positiva färgningen för kalciumnoder. Protokollet är baserat på en pool av tre till fem ventiler från olika möss.Användningen av kull mate och tre olika biologiska replikat är viktigt för att validera resultaten. Användningen av musventilceller är avgörande för att förstå den molekylära vägen som leder till kolorektal stenos genom att isolera celler från transgena möss. Detta protokoll har använts tidigare för att undersöka implikationen av vägen till receptorn i mineral regression av förkalkad aorta ventil.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolering av näthinnan stamceller från mus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Visualisering av interstitiella celler i Cajal (ICC) Network i Möss

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiering av nyfödda mus härledda hudens stamceller i Germ-liknande celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Protein Isolering från utvecklings Embryonala Mus hjärtklaff Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Isolering och 3D Collagen Sandwich kultur primär mus hepatocyter att studera rollen av cytoskeleton i galla Kanalikulär formation in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Isolering av humana primära ventilceller för in vitro-sjukdomsmodellering

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...