Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.D由南佛罗里达大学分子医学系提供的启动资金以及CFF研究赠款（DARCH19G0）N.I.H（5R21AI147654-02（PI，Chen）和美国F微生物群系研究所提供支持。我们感谢怀特利实验室持续合作，涉及与此手稿相关的数据集。我们感谢查尔斯·塞克斯博士为FACS分拣提供便利。数字是由A.D.G和S.E.D使用 Biorender.com 创建的。

1. 准备合成囊性纤维化介质（SCFM2）
注：SCFM2的编制包括以下三个主要阶段（图2）。有关完整详细信息和参考，请参阅 9、10、12。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> 图2：SCFM2介质?...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

这项工作引入了方法，可以结合研究细菌聚集人群的存在和缺乏抗生素治疗。高分辨率 CLSM 允许在接触抗生素时实时可视化聚合生物量的变化和聚合物的结构方向。此外，可以量化抗生素治疗后剩余生物量的物理和结构特征，目的是利用RNA-seq将这些观测结果与未来的基因表达研究联系起来。虽然使用GFP表达细胞可以可视化抗生素耐药细胞的集体和个人行为，但它只提供了整体情况的一部分。从没...

伪多莫纳斯航空（Pa）是一种机会型病原体，可在免疫受损个体中建立慢性感染。对于那些有遗传性疾病囊性纤维化 （CF） 的人，这些感染可以跨越一生的过程。CF导致气道中粘稠、营养丰富的痰的积聚，随着时间的推移，这种痰会被各种微生物病原体殖民。Pa是最常见的CF病原体之一，在幼儿期殖民气道，并建立难以治疗的感染1。Pa仍然是一个严重的临床问题，被认为是CF患者的主要死因，尽管近年来治疗方案有所改善。这种持续表型和增加抗生素耐受性使Pa在疾病控制中心（CDC）和世界卫生组织（WHO）确定为开发新治疗策略的研究重点的病原体中占有一席之地——ESKAPE病原体4。
像其他ESKAPE病原体一样，获得抗生素耐药性在Pa中很常见，但也有许多内在特性有助于Pa抗菌耐药性。其中包括Pa形成+10-1，000细胞的聚集高度密集的集群的能力，这可以在多种感染中观察到，包括CF患者痰5，6。与其他生物膜系统研究的Pa相似，Pa聚合显示临床相关表型，如对抗生素的耐药性增加和细胞细胞通信（量子传感（QS）的激活。例如，Pa的聚合已被证明使用QS调节的行为来对抗其他微生物，以及耐受抗菌治疗，如生产皮奥氰宁7。研究这些行为的能力为人们提供了对细菌生态系统的令人兴奋的洞察，其环境与它们存在于人体中的生态系统相似。
研究Pa聚合物如何应对不断变化的痰环境的最大挑战之一是缺乏营养相关和强大的系统，促进聚合形成。关于Pa的很多已知的东西都是使用体外系统发现的，其中细胞以浮子或在一个典型的表面附着的"蘑菇"结构中生长，而这种结构在体内8中是没有观察到的。虽然经典的生物膜生长模型，如流动细胞或固体阿加，已经产生了关于细菌行为和抗生素耐受机制的广泛和有价值的知识，这些发现并不总是在体内转化。许多体外模型模仿人类感染部位生长环境的能力有限，因此需要昂贵的体内研究。反过来，许多体内模型缺乏体外技术提供的灵活性和分辨率。
合成囊性纤维化痰 （SCFM2） 旨在为Pa生长提供类似于 CF 肺慢性感染期间的环境。SCFM2 包括预期 CF 痰中发现的营养来源，以及粘液、脂质和 DNA。PA生长在SCFM2需要一个几乎相同的基因集，需要在实际痰生长，并支持自然Pa聚合形成9，10。接种后，浮子细胞形成聚合体，通过膨胀增加体积。单个细胞（称为移民）从聚合体中释放出来，迁移到非殖民化地区，并形成新的聚合体10。使用 CLSM 和图像分析在单个细胞的分辨率下观察到此生命史。在SCFM2中形成的Pa的聚合体与CF肺10中观察到的体积大小相似。此模型允许在微米尺度上实时和三维观察不同大小的多个聚合体。延时显微镜可在一个实验中跟踪数千个（+50，000）的聚合物。使用图像分析软件可以从显微图中量化聚合表型，包括聚合体积、表面积和位置三个维度，以最近的 0.1 μm 为数，包括单个聚合度和人口水平。能够按表型和位置对聚合进行分组，可以精确区分不同发育阶段的聚合，以及它们对不断变化的微环境6、11的反应。
SCFM2 应用于低体积和高吞吐量检测中的Pa聚合物研究，使其成为一个灵活、经济高效的模型。作为一种定义的介质，SCFM2在多个平台上提供均匀性和可重复性，为研究Pa聚合体外9提供了营养和物理相关的方法。应用包括它与 CLSM 结合使用，以高分辨率观察空间组织和抗生素耐受性（如本方法本文所述）。能够进行实验，提供实时的，微米级的数据，允许研究物种内部和物种间相互作用，因为它们可能发生在体内。例如，SCFM2以前曾被用来研究细胞细胞通信的空间动力学在总人口通过一个系统网络利用Pa用于调节多个基因，导致毒性和发病机理6。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> 图1：主要实验步骤的图形描述。（A） SCFM2与Pa细胞一起接种，并允许在玻璃底培养皿中形成聚合物。（B） 聚合物被转移到共聚焦显微镜，并添加抗生素。描述是三个技术复制（室1-3）和控制井（4）接种SCFM2没有抗生素治疗。聚合物在初始 18 小时成像后使用 CLSM进行成像，用碘化物处理聚合物，以可视化死细胞，使用 CLSM（D）使用所需表型的聚合物使用 FACS 从 SCFM2 中分离图像。缩写：SCFM2 = 合成囊性纤维化痰介质;帕=伪多莫纳斯航空;CLSM = 聚焦激光扫描显微镜;FACS = 荧光激活细胞排序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
在这里，SCFM2的效用，以研究抗生素治疗对Pa聚合物的实时影响，然后使用细胞分拣方法，以隔离人群与不同的表型进行下游分析（图1）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

伪多莫纳斯航空（Pa） 是与囊性纤维化（CF）相关的最常见的机会型病原体之一。 一旦Pa 殖民化建立，很大一部分感染细菌在气道痰中形成生物膜。从CF痰中分离出来的 Pa 生物膜已被证明生长在小而密集的聚集体中，这些聚合体为+10-1，000细胞，这些细胞在空间上组织起来，并表现出临床上相关表型，如抗菌耐受性。研究 Pa 聚合物如何应对不断变化的痰环境的最大挑战之一是缺乏营养相关和强大的系统，促进聚合形成。使用合成的 CF 痰介质 （SCFM2），可以使用共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 和单个细胞分辨率的图像分析来观察 Pa 聚合物的寿命历史。这种 体外 系统允许实时、三维和微米尺度观察数千个大小不一的聚合物。在个体和人口层面，能够按表型和位置对聚合进行分组，有助于观察处于不同发育阶段的聚合物，并有助于精确区分它们对微环境变化的反应，如抗生素治疗。

这项工作详细说明了观察Pa聚合在高分辨率和环境类似于慢性感染CF肺9，10，12。SCFM2提供了一个体外系统，促进Pa细胞的自然聚集，其大小与实际感染期间观察到的相似。SCFM2 作为定义介质的适应性可以利用它来接近许多研究途径。这项工作的目标是突出工作流程，包括显微镜和 FACS 的组?...

Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

合成囊性纤维化痰介质（SCFM2）可与共聚焦激光扫描显微镜和荧光活性细胞分拣相结合，以高分辨率观察细菌聚集物。本文详细介绍了在抗菌治疗期间评估总人口的方法，作为未来研究的平台。

伪多莫纳斯航空感染模型实时评估工具

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

我们的协议为我们提供了一种方法，在营养和物理环境中研究抗生素耐药细菌，类似于它们可能存在于体内的方式。这项技术的最大优点之一是能够捕获感染相关人群大小的细菌的高分辨率图像和表型数据。这是大约10到1000个细胞的聚合。演示这个程序的将是亚历克萨·甘农，一个来自我实验室的研究生研究助理。首先，在紫外线下对含粘液的介质进行四个小时的消毒。在无菌条件下将紫外线处理的粘液转移到无菌的 1.7 毫升管中，并将管子储存在零下 20 摄氏度。准备缓冲基座后，将粘液的库存溶液添加到包含 DNA 的缓冲基座中，如文本手稿中所述。在实验前一天晚上，用含有LB Agar板的抗生素接种5毫升LB肉汤，每分钟搅拌250转。第二天早上，在开始实验前至少两个小时，打开共聚焦激光扫描显微镜，打开相关成像软件中的孵化模块。将500微升培养物稀释在5毫升新鲜LB肉汤中，并以每分钟37摄氏度和250转的速度孵育细菌悬浮，每次60至90分钟。当细菌进入原木阶段时，通过离心将细菌细胞颗粒化，然后用过滤器消毒PBS清洗细胞三次。最后一次洗涤后，将颗粒重新用一毫升 PBS 重新使用。测量600纳米细菌细胞悬浮物的吸收量，以确定合成囊性纤维化痰介质介质中等5毫升中0.05的光学密度所需的培养体积。在介质和涡流中轻轻接种细菌细胞悬浮的计算体积，然后在四室光学培养皿的每个腔室中加入一毫升细胞，然后在37摄氏度的静态条件下孵育细菌4小时。通过共聚焦激光扫描显微镜对伪多莫纳斯气管聚集物进行成像，在孵化结束时，指定培养板的三口井作为抗生素治疗复制品，一口井以及一口没有治疗控制，并将板放在显微镜的加热阶段。选择 63X 油浸入目标并打开定位选项卡以识别明亮油田中的细菌聚合物。定义每个井内的成像区域，并使用位置模块存储区域位置。将激发波长设置为 488 纳米，将发射波长设置为 509 纳米。在采集模块中，选择 Z 堆栈选项来获取图像，并使用线平均模块来减少 Z 堆栈图像总体积内 GFP 通道中的背景荧光。设置时间系列选项，以 15 分钟间隔在每个井中捕获 60 片，持续 18 小时，并使用明确的对焦策略为每个位置存储一个焦距平面，该位置将在整个实验中每个时间点重新成像。建立成像实验后4-1~2小时，对每个位置进行成像，以确定添加抗生素之前四口井中每个井内的聚合生物量。六小时后，轻轻加入抗生素，在低于最低抑制浓度的两倍到每个井的中间，只需吹空气液体界面，然后点击开始实验，开始抗生素后治疗成像。为了隔离活细胞，在18小时成像期结束时，根据制造商的建议，给每口井中的细菌贴上适当数量的碘化物标签。在孵化结束时， 使用绝缘容器将板转移到流动细胞计，并设置细胞仪，使用 70 微米喷嘴检测 GFP 和碘化丙胺，然后以最低流量速率运行每个培养物的 1 毫升阿利奎特，对可行的 GFP 阳性和不可行的碘化物阴性伪伪多莫纳斯航空藻聚合物进行排序。要量化聚合动态，请将图像加载到适当的图像分析软件程序中，并创建 GFP 通道中未处理控制和抗生素治疗培养物产生的计数的直方图，以便量化背景荧光。为确保检测到的 GFP voxel 与细菌生物量相关，将 GFP 阳性 voxel 定义为大于或等于 GFP 背景计数值的 1.5 倍。为所有剩余的 voxels 生成 ISO 表面，并检测单个聚合体，启用拆分对象选项并将聚合体定义为对象。使用有利模块计算每个对象的 XYZ 体积和 GFP 词汇量。将此数据导出到外部统计平台。按大小过滤输出的数据，以定义体积大于或等于 5 立方微米的对象。移除小于 0.5 立方微米的对象，并使用有利模块计算每个对象与每个图像中其他对象的距离。或者，可以使用公式计算距离，然后使用总和和平均计算来确定平均总总体积中的生物量总量。虽然在抗生素应用四小时后仍保留着多个可行的细菌聚集物，但与未经治疗的培养物相比，抗生素治疗培养物中总种群的生物量显著减少。时间系列显微镜可用于确定抗生素治疗后敏感碘化物阳性和耐受GFP阳性聚合物之间的空间模式。通过计算不同大小的聚合物对总人口的贡献，可以确定聚合物对抗生素治疗的反应模式，以相对于其大小、形状和位置。抗生素治疗后，可行和不可行的聚合物可以根据荧光信号表达成功分离。我们希望这个协议能激励其他研究人员以类似的分辨率研究他们选择的有机体。我们的目标是在这些复杂的社区中找到共同的生物线，无论感染部位如何。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

共培养模型绿脓杆菌现场人类呼吸道细胞生长的生物膜

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

科研

免疫与感染

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

铜绿假单胞菌和酿酒酵母流细胞生物膜

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA的分离绿脓杆菌殖民小鼠胃肠道

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

使用人工痰介质测试抗生素药效试验<em&gt;绿脓杆菌</em&gt;更多相关的肺囊肿性纤维化的条件

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

长期慢性<em&gt;铜绿假单胞菌</em&gt;在呼吸道感染小鼠

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

绿脓杆菌引起的肺损伤模型

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

研究微生物群落<em&gt;在体内</em&gt;：主机之间介互动的典范<em&gt;白色念珠菌</em&gt;和<em&gt;铜绿假单胞菌</em&gt;在航空

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

来到光明的一面: 体内糖尿病无毛小鼠慢性伤口生物膜感染的监测

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

复制的有序, 非冗余图书馆的铜绿假单胞菌应变 PA14 座子插入突变体

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

铜绿假单胞菌感染肺内皮细胞后细胞毒性 Amyloids 的检测方法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...