Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.D er støttet af start-up midler fra Department of Molecular Medicine, The University of South Florida, samt en CFF forskningsbevilling (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) og USF Institute on Microbiomes. Vi takker Whiteley laboratoriet for løbende samarbejde med datasæt relateret til dette manuskript. Vi takker Dr. Charles Szekeres for at lette FACS sortering. Tallene blev skabt af A.D.G og S.E.D ved hjælp af Biorender.com.

1. Forbered syntetisk cystisk fibrose medium (SCFM2)
BEMÆRK: Forberedelsen af SCFM2 omfatter tre hovedfaser, der er beskrevet nedenfor (figur 2). Yderligere oplysninger og referencer finder du under9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> F...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

Dette arbejde har indført metoder, der kan kombineres for at studere bakterielle samlede populationer i nærvær og fravær af antibiotikabehandling. Høj opløsning CLSM tillader visualisering af ændringer i den samlede biomasse og den strukturelle orientering af aggregater over realtid, når de udsættes for antibiotika. Derudover kan fysiske og strukturelle træk ved den biomasse, der er tilbage efter behandling med antibiotika, kvantificeres med det formål at korrelere disse observationer med fremtidige genekspres...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) er et opportunistisk patogen, der etablerer kroniske infektioner hos immun-kompromitterede personer. For dem med den genetiske sygdom cystisk fibrose (CF), disse infektioner kan spænde over løbet af livet. CF forårsager ophobning af et tyktflydende, næringsrigt spyt i luftvejene, som bliver koloniseret af en række mikrobielle patogener over tid. Pa er en af de mest udbredte CF patogener, kolonisere luftvejene i den tidlige barndom og etablere vanskelige at behandle infektioner1. Pa er fortsat et betydeligt klinisk problem og betragtes som en førende årsag til dødelighed hos dem med CF, på trods af forbedrede behandlingsregimer i de seneste år2,3. Denne persistens fænotype og stigende antibiotika tolerance har tjent Pa en plads i en gruppe af patogener identificeret af både Centers for Disease Control (CDC) og Verdenssundhedsorganisationen (WHO) som forskningsprioriteter for udviklingen af nye terapeutiske strategier-ESKAPE patogener4.
Ligesom andre ESKAPE patogener, erhvervet antibiotikaresistens er almindelig i Pa, men der er også mange iboende egenskaber, der bidrager til Pa antimikrobiel tolerance. Blandt disse er Pa's evne til at danne aggregater meget tætte klynger af ~ 10-1.000 celler, som kan observeres i flere infektioner, herunder CF-patient spyt5,6. I lighed med Pa undersøgt i andre biofilm systemer, Pa aggregater vise klinisk relevante fænotyper såsom øget resistens over for antibiotika og aktivering af celle-celle kommunikation (quorum sensing (QS)). For eksempel har aggregater af Pa vist sig at bruge QS-regulerede adfærd til at bekæmpe andre mikrober samt tolerere antimikrobielle behandlinger såsom produktion af pyocyanin7. Evnen til at studere en sådan adfærd giver et spændende indblik i bakterielle økosystemer i et miljø, der ligner det, hvor de findes i menneskekroppen.
En af de største udfordringer ved at studere, hvordan Pa aggregater reagerer på det skiftende spyt miljø er manglen på ernæringsmæssigt relevante og robuste systemer, der fremmer den samlede dannelse. Meget af det, der er kendt om Pa er blevet opdaget ved hjælp af in vitro-systemer, hvor celler vokser planktonically eller i en karakteristisk overflade-vedhæftet, "champignon" arkitektur, der ikke er blevet observeret in vivo8. Mens klassiske biofilm vækstmodeller, såsom flowceller eller solid agar, har givet omfattende og værdifuld viden om bakteriel adfærd og mekanismer af antibiotika tolerance, disse resultater ikke altid oversætte in vivo. Mange in vitro-modeller har en begrænset evne til at efterligne vækstmiljøet på det menneskelige infektionssted, hvilket nødvendiggør dyre in vivo-undersøgelser. Til gengæld mangler mange in vivo-modeller den fleksibilitet og opløsning, som in vitro-teknikker giver.
Syntetisk cystisk fibrose spyt (SCFM2) er designet til at give et miljø for Pa vækst svarende til den, der opleves under kronisk infektion i CF lunge. SCFM2 omfatter ernæringsmæssige kilder identificeret i ekselleret CF sputa ud over mucin, lipider og DNA. Pa vækst i SCFM2 kræver en næsten identisk gen indstillet til den, der kræves for vækst i faktiske spyt og understøtter naturlige Pa aggregeret dannelse9,10. Efter podning danner planktoniske celler aggregater, der øges i størrelse gennem ekspansion. Individuelle celler (kaldet migranter) frigives fra aggregater, migrerer til ikke-kølloniserede områder og danner nye aggregater10. Denne livshistorie kan observeres ved hjælp af CLSM og billedanalyse ved opløsningen af en enkelt celle. Granulater af Pa dannet i SCFM2 er af samme størrelse som dem, der er observeret i CF lunge10. Denne model gør det muligt at observere flere aggregater af varierende størrelse i realtid og i tre dimensioner på mikronskalaen. Time-lapse mikroskopi tillader sporing af tusindvis (~ 50.000) af aggregater i et eksperiment. Brugen af billedanalysesoftware gør det muligt at kvantificere samlede fænotyper fra mikrografer, herunder samlet volumen, overfladeareal og placering i tre dimensioner til nærmeste 0,1 μm, både på de enkelte aggregat- og befolkningsniveauer. At have evnen til at gruppere aggregater efter fænotype og position gør det muligt at differentiere aggregater på forskellige udviklingsstadier med præcision samt deres reaktion på et skiftende mikromiljø6,11.
Anvendelsen af SCFM2 til at studere Pa aggregater i lav volumen og high-throughput assays gør det til en fleksibel, omkostningseffektiv model. Som et defineret medium tilbyder SCFM2 ensartethed og reproducerbarhed på tværs af flere platforme, hvilket giver en ernæringsmæssigt og fysisk relevant metode til at studere Pa aggregater in vitro9. Applikationer omfatter dens anvendelse i kombination med CLSM til at observere rumlig organisation og antibiotika tolerance ved høj opløsning (som beskrevet i denne metode papir). Evnen til at udføre eksperimenter, der giver realtidsdata i mikronskala, gør det muligt at studere interaktioner inden for arter og mellem arter, da de kan forekomme in vivo. For eksempel er SCFM2 tidligere blevet brugt til at studere den rumlige dynamik i cellecellekommunikation i samlede populationer via et netværk af systemer, der anvendes af Pa til at regulere flere gener, der bidrager til virulens og patogenese6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Figur 1: Grafisk skildring af de vigtigste eksperimentelle trin. (A) SCFM2 podes med Pa-celler og får lov til at danne aggregater i en glasbundet kulturskål. (B) Aggregater overføres til det konfokale mikroskop, og der tilsættes antibiotika. Afbildet er tre tekniske kopier (kamre 1-3) og en kontrol brønd (4) af podet SCFM2 uden antibiotikabehandling. Aggregater afbildes ved hjælp af CLSM i løbet af 18 timer (C) Efter den første 18-timers billeddannelse behandles aggregater med propidiumododi for at visualisere døde celler og afbildes ved hjælp af CLSM (D) Aggregater med ønsket fænotype adskilles fra SCFM2 ved hjælp af FACS. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose spyt medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokal laserscanningsmikroskopi; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Her demonstreres nytten af SCFM2 til at undersøge virkningen af antibiotikabehandling på pa aggregater i realtid, efterfulgt af brugen af en cellesorteringsmetode til at isolere populationer af aggregater med forskellige fænotyper til downstream-analyse (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) er en af de mest almindelige opportunistiske patogener forbundet med cystisk fibrose (CF). Når Pa kolonisering er etableret, en stor del af de inficerende bakterier danner biofilm i luftvejene spyt. Pa biofilm isoleret fra CF spyt har vist sig at vokse i små, tætte aggregater på ~ 10-1.000 celler, der er rumligt organiseret og udviser klinisk relevante fænotyper såsom antimikrobiel tolerance. En af de største udfordringer ved at studere, hvordan Pa aggregater reagerer på det skiftende spyt miljø er manglen på ernæringsmæssigt relevante og robuste systemer, der fremmer den samlede dannelse. Ved hjælp af en syntetisk CF spyt medium (SCFM2), levetiden af Pa aggregater kan observeres ved hjælp af confocal laser scanning mikroskopi (CLSM) og billedanalyse ved opløsningen af en enkelt celle. Dette in vitro-system gør det muligt at observere tusindvis af aggregater af varierende størrelse i realtid, tre dimensioner og på mikronskalaen. På individ- og befolkningsniveau gør det lettere at differentiere observationen af aggregater på forskellige udviklingsstadier, når de har evnen til at gruppere aggregater efter fænotype og position, og deres reaktion på ændringer i mikromiljøet, såsom antibiotikabehandling.

Dette arbejde beskriver metoder til at observere Pa aggregater i en høj opløsning og i et miljø svarende til kronisk infektion i CF lunge9,10,12. SCFM2 giver et in vitro-system, der fremmer naturlig sammenlægning af Pa-celler i størrelser svarende til dem, der observeres under den faktiske infektion10. SCFM2's tilpasningsevne som et defineret medium kan udnyttes til at nær...

Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Syntetisk cystisk fibrose spyt medium (SCFM2) kan udnyttes i kombination med både konfokal laser scanning mikroskopi og fluorescens-aktiveret celle sortering til at observere bakterielle aggregater ved høj opløsning. Dette dokument beskriver metoder til at vurdere samlede populationer under antimikrobiel behandling som en platform for fremtidige undersøgelser.

Værktøjer til realtidsvurdering af en Pseudomonas aeruginosa-infektionsmodel

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Vores protokol giver os mulighed for at studere antibiotikaresistente bakterier i et ernæringsmæssigt og fysisk miljø svarende til, hvordan de sandsynligvis eksisterer in vivo. En af de største fordele ved denne teknik er evnen til at fange billeder i høj opløsning og fænotypiske data af bakterier i infektionsrelevante befolkningsstørrelser. Det er aggregerede på mellem 10 og 1.000 celler.Demonstrere proceduren vil være Alexa Gannon, en kandidat forskningsassistent fra mit laboratorium. Til at begynde med sterilisere det mucinholdige medium under ultraviolet lys i fire timer. Overfør den UV-behandlede mucin til sterile 1,7 milliliterrør under sterile forhold og opbevar rørene ved minus 20 grader Celsius.Når du har forberedt den bufferede base, skal du tilføje lageropløsningen af mucin i den bufferede base, der indeholder DNA som beskrevet i tekstmanuskriptet. Aftenen før eksperimentet, pode fem milliliter af LB bouillon med flere kolonier af Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 fra et antibiotikum, der indeholder LB agar plade og kultur bakterier natten over ved 37 grader Celsius med agitation på 250 omdrejninger i minuttet. Næste morgen, mindst to timer før eksperimentet påbegyndes, tændes det konfokale laserscanningsmikroskop og åbner inkubationsmodulet i den tilhørende billedsoftware.Fortynd 500 mikroliter af kulturen i fem milliliter frisk LB bouillon og inkubere bakteriel suspension ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger i minuttet i 60 til 90 minutter. Når bakterierne er kommet ind i logfasen, pellet bakteriecellerne ved centrifugering og vaske cellerne tre gange med filtersteriliseret PBS. Efter den sidste vask skal pelleten genbruges i en milliliter PBS.Mål absorbansen af bakteriecelleopsendelse ved 600 nanometer for at bestemme det kulturvolumen, der kræves for en optisk tæthed på 0,05 i fem milliliter syntetisk cystisk fibrose spyt mellem to. Pod den beregnede mængde bakteriecelleopsenpension i mediet og hvirvle forsigtigt, før der tilføjes en milliliter celler til hvert kammer i en firekammeroptisk kulturskål, og inkuberer derefter bakterierne i fire timer under statiske forhold ved 37 grader Celsius. For at forestille pseudomonas aeruginosa aggregater ved confocal laser scanning mikroskop, i slutningen af inkubationen, udpege tre brønde af kulturpladen som antibiotikabehandling replikerer og en samt ingen behandling kontrol og placere pladen på det opvarmede stadium i mikroskopet.Vælg et 63X oliedypningsmål, og åbn find-fanen for at identificere bakterieaggregaterne i brightfield. Definer et område til billedbehandling i hver brønd, og brug positionsmodulet til at gemme områdepositionen. Indstil excitation bølgelængde til 488 nanometer og emission bølgelængde til 509 nanometer.I anskaffelsesmodulet skal du vælge Z-stack-indstillingen for at erhverve billederne og bruge linje-gennemsnitsmodulet til at reducere baggrundslyscensen i GFP-kanalen inden for den samlede mængde af Z-stack-billederne. Indstil tidsserieindstillingen for at fange 60 skiver i hver brønd med 15 minutters intervaller i 18 timer, og brug den bestemte fokusstrategi til at gemme et fokusplan for hver position, der vil blive rebilledet på hvert tidspunkt i hele eksperimentet. 4-1/2 time efter oprettelsen af billeddannelse eksperiment, billede hver position til at bestemme den samlede biomasse inden for hver af de fire brønde før tilsætning af antibiotika.Efter seks timer, forsigtigt tilføje antibiotika på to gange under den mindste hæmmende koncentration til midten af hver brønd bare blæse luften flydende interface og klik start eksperiment for at begynde post-antibiotikabehandling billeddannelse. For at isolere de levende celler, i slutningen af 18-timers billeddannelse periode, mærke bakterierne i hver brønd med den passende mængde propidium jod i henhold til producentens anbefalinger. I slutningen af inkubationen skal du bruge en isoleret beholder til at overføre pladen til flowcytometeret og indstille cytometeret til at detektere GFP og propidiumododi ved hjælp af en 70 mikron dyse, og kør derefter en milliliter aliquots af hver kultur supernatant ved den laveste strømningshastighed for at sortere de levedygtige GFP-positive og ikke-levedygtige propidiumodid negative Pseudomonas aeruginosa aggregater.For at kvantificere den samlede dynamik skal du indlæse billederne i et passende billedanalysesoftwareprogram og oprette histogrammer af de tal, der produceres til de ubehandlede kontrol- og antibiotikabehandlede kulturer i GFP-kanalen for at muliggøre kvantificering af baggrunden fluorescens. For at sikre, at de fundne GFP voxels korrelerer med bakteriebiomassen, skal du definere en GFP-positiv voxel som større end eller lig med 1,5 gange GFP-baggrundstællingsværdien. Producere ISO overflader for alle de resterende voxels og til at opdage individuelle aggregater, aktivere split objekter mulighed og definere aggregater som objekter.Brug udsigtsmodulet til at beregne diskenheden XYZ og summen af GFP voxels for hvert enkelt objekt. Eksporter disse data til en ekstern statistisk platform. Filtrer de eksporterede data efter størrelse for at definere objekter med diskenheder, der er større end eller lig med fem kubikmikrometre.Fjern objekter, der er mindre end 0,5 kubikmeter, og brug udsigtsmodulet til at beregne afstanden for hvert objekt i forhold til andre objekter i hvert billede. Alternativt kan afstanden beregnes ved hjælp af formlen og derefter bruge summen og de gennemsnitlige beregninger til at bestemme den samlede biomasse i den gennemsnitlige samlede mængde. Selv om der stadig er flere levedygtige bakterieaggregater tilbage efter fire timers anvendelse af antibiotika, reduceres den samlede biomasse af de samlede populationer inden for de antibiotikabehandlede kulturer betydeligt sammenlignet med ubehandlede kulturer.Tidsseriemikroskopi kan bruges til at bestemme de rumlige mønstre mellem følsomme propidiumiodid positive og tolerante GFP-positive aggregater efter antibiotikabehandling. Ved at beregne, hvordan aggregater af forskellige størrelser bidrager til den samlede befolkning, kan mønstre for, hvordan aggregater reagerer på antibiotikabehandling i forhold til deres størrelse, form og position, identificeres. Efter antibiotikabehandling kan levedygtige og ikke-levedygtige aggregater med succes adskilles i henhold til deres fluorescerende signaludtryk.Vi håber, at denne protokol inspirerer andre forskere til at studere deres foretrukne organisme ved en lignende beslutning. Vores mål er at finde fælles biologiske tråde i disse komplekse samfund uanset infektionsstedet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langtids kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftvejsinfektion i mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

At studere mikrobielle samfund<em&gt; In vivo</em&gt;: En model af Host-medieret samspil mellem<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I luftvejene

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: In Vivo overvågning af Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniske sår i en diabetisk Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering af bestilt, Nonredundant bibliotek af Pseudomonas aeruginosa stamme PA14 Transposon indsættelse mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder til påvisning af cytotoksiske Amyloids følgende infektion af pulmonal endotelceller af Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...