Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.D wird durch Start-up-Fonds des Department of Molecular Medicine, der University of South Florida, sowie ein CFF-Forschungsstipendium (DARCH19G0), das N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) und das USF Institute on Microbiomes unterstützt. Wir danken dem Whiteley-Labor für die kontinuierliche Zusammenarbeit mit Datensätzen zu diesem Manuskript. Wir danken Dr. Charles Szekeres für die Erleichterung der FACS-Sortierung. Die Figuren wurden von A.D.G und S.E.D mit Biorender.com erstellt.

1. Synthetisches Mukoviszidosemedium (SCFM2) vorbereiten
HINWEIS: Die Vorbereitung von SCFM2 umfasst drei Hauptphasen, die unten beschrieben werden (Abbildung 2). Ausführliche Informationen und Referenzen finden Sie unter9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"><br...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

Diese Arbeit hat Methoden eingeführt, die kombiniert werden können, um bakterielle Aggregatpopulationen in Gegenwart und Abwesenheit von Antibiotikabehandlung zu untersuchen. Hochauflösendes CLSM ermöglicht die Visualisierung von Veränderungen der aggregierten Biomasse und der strukturellen Orientierung von Aggregaten in Echtzeit, wenn sie Antibiotika ausgesetzt sind. Darüber hinaus können physikalische und strukturelle Merkmale der Biomasse, die nach der Behandlung mit Antibiotika übrig bleiben, quantifiziert we...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) ist ein opportunistischer Erreger, der chronische Infektionen bei immungeschwächten Personen hervorruft. Bei Menschen mit der Erbkrankheit Mukoviszidose (CF) können diese Infektionen den Verlauf eines Lebens umfassen. CF verursacht den Aufbau eines viskosen, nährstoffreichen Auswurfs in den Atemwegen, der im Laufe der Zeit von einer Vielzahl mikrobieller Krankheitserreger besiedelt wird. Pa ist einer der häufigsten CF-Erreger, der die Atemwege in der frühen Kindheit besiedelt und schwer zu behandelnde Infektionen etabliert1. Pa bleibt ein signifikantes klinisches Problem und gilt als eine der häufigsten Todesursachen bei Menschen mit CF, trotz verbesserter Therapieschemata in den letzten Jahren2,3. Dieser Persistenzphänotyp und die zunehmende Antibiotikatoleranz haben Pa einen Platz in einer Gruppe von Krankheitserregern eingebracht, die sowohl von den Centers for Disease Control (CDC) als auch von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als Forschungsprioritäten für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien identifiziert wurden - die ESKAPE-Erreger4.
Wie bei anderen ESKAPE-Erregern ist die erworbene Antibiotikaresistenz bei Paüblich, aber es gibt auch viele intrinsische Eigenschaften, die zur antimikrobiellen Toleranz von Pa beitragen. Dazu gehört die Fähigkeit von Pa, Aggregate zu bilden - hochdichte Cluster von ~ 10-1.000 Zellen, die bei mehreren Infektionen beobachtet werden können, einschließlich CF-Patienten-Sputum5,6. Ähnlich wie Pa, das in anderen Biofilmsystemen untersucht wurde, zeigen Pa-Aggregate klinisch relevante Phänotypen wie erhöhte Antibiotikaresistenz und Aktivierung der Zell-Zell-Kommunikation (Quorum Sensing (QS)). Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Aggregate von Pa QS-reguliertes Verhalten verwenden, um andere Mikroben zu bekämpfen und antimikrobielle Behandlungen wie die Produktion von Pyocyanin7zu tolerieren. Die Fähigkeit, solche Verhaltensweisen zu untersuchen, bietet einen spannenden Einblick in bakterielle Ökosysteme in einer Umgebung, die derjenigen ähnelt, in der sie im menschlichen Körper vorkommen.
Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung, wie Pa-Aggregate auf die sich verändernde Sputumumgebung reagieren, ist das Fehlen ernährungsrelevanter und robuster Systeme, die die Aggregatbildung fördern. Vieles von dem, was über Pa bekannt ist, wurde mit In-vitro-Systemen entdeckt, in denen Zellen planktonisch oder in einer charakteristischen oberflächengebundenen "Pilz"-Architektur wachsen, die in vivo8nicht beobachtet wurde. Während klassische Biofilm-Wachstumsmodelle wie Flusszellen oder fester Agar umfangreiches und wertvolles Wissen über bakterielles Verhalten und Mechanismen der Antibiotikatoleranz gewonnen haben, lassen sich diese Ergebnisse nicht immer in vivo übersetzen. Viele In-vitro-Modelle haben eine begrenzte Fähigkeit, die Wachstumsumgebung der menschlichen Infektionsstelle nachzuahmen, was kostspielige In-vivo-Studien erfordert. Im Gegenzug fehlt vielen In-vivo-Modellen die Flexibilität und Auflösung, die In-vitro-Techniken bieten.
Synthetischer Mukoviszidose-Sputum (SCFM2) wurde entwickelt, um eine Umgebung für das Pa-Wachstum zu schaffen, die der bei chronischen Infektionen in der CF-Lunge ähnelt. SCFM2 umfasst Nährstoffquellen, die in schleimlöserter CF-Sputa zusätzlich zu Mucin, Lipiden und DNA identifiziert wurden. Das Pa-Wachstum in SCFM2 erfordert ein nahezu identisches Gen, das für das Wachstum im tatsächlichen Sputum erforderlich ist, und unterstützt die natürlichePa-Aggregatbildung 9,10. Nach der Impfung bilden planktonische Zellen Aggregate, die durch Expansion an Größe zunehmen. Einzelne Zellen (als Migranten bezeichnet) werden aus Aggregaten freigesetzt, wandern in unbesilumisierte Gebiete und bilden neue Aggregate10. Diese Lebensgeschichte kann mittels CLSM und Bildanalyse bei der Auflösung einer einzelnen Zelle beobachtet werden. Die in SCFM2 gebildeten Pa-Aggregate sind ähnlich groß wie die in der CF-Lunge10beobachteten. Dieses Modell ermöglicht die Beobachtung mehrerer Aggregate unterschiedlicher Größe in Echtzeit und in drei Dimensionen im Mikrometerbereich. Die Zeitraffermikroskopie ermöglicht die Verfolgung von Tausenden (~ 50.000) aggregaten in einem Experiment. Die Verwendung von Bildanalysesoftware ermöglicht die Quantifizierung von aggregierten Phänotypen aus Mikroaufnahmen, einschließlich Aggregatvolumen, Oberfläche und Position in drei Dimensionen auf die nächsten 0,1 μm, sowohl auf der Ebene des einzelnen Aggregats als auch der Population. Die Fähigkeit, Aggregate nach Phänotyp und Position zu gruppieren, ermöglicht die präzise Differenzierung von Aggregaten in verschiedenen Entwicklungsstadien sowie ihre Reaktion auf eine sich verändernde Mikroumgebung6,11.
Die Anwendung von SCFM2 zur Untersuchung von Pa-Aggregaten in Assays mit geringem Volumen und hohem Durchsatz macht es zu einem flexiblen, kostengünstigen Modell. Als definiertes Medium bietet SCFM2 Einheitlichkeit und Reproduzierbarkeit über mehrere Plattformen hinweg und bietet eine ernährungsphysiologisch und physikalisch relevante Methode zur Untersuchung von Pa-Aggregaten in vitro9. Zu den Anwendungen gehört die Verwendung in Kombination mit CLSM zur Beobachtung der räumlichen Organisation und antibiotikatoleranz bei hoher Auflösung (wie in diesem Methodenpapier beschrieben). Die Fähigkeit, Experimente durchzuführen, die Echtzeitdaten im Mikrometerbereich liefern, ermöglicht die Untersuchung von Interaktionen innerhalb und zwischen Spezies, wie sie in vivoauftreten können. Zum Beispiel wurde SCFM2 zuvor verwendet, um die räumliche Dynamik der Zell-Zell-Kommunikation in aggregierten Populationen über ein Netzwerk von Systemen zu untersuchen, die von Pa verwendet werden, um mehrere Gene zu regulieren, die zur Virulenz und Pathogenese beitragen6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Abbildung 1: Grafische Darstellung der wichtigsten experimentellen Schritte. (A) SCFM2 wird mit Pa-Zellen geimpft und darf in einer Kulturschale mit Glasboden Aggregate bilden. (B) Aggregate werden auf das konfokale Mikroskop übertragen und Antibiotika hinzugefügt. Dargestellt sind drei technische Replikate (Kammern 1-3) und eine Kontrollbohrung (4) von geimpften SCFM2 ohne antibiotikafreie Behandlung. Aggregate werden mit CLSM im Laufe von 18 h abgebildet. (C) Nach der ersten 18-h-Bildgebung werden Aggregate mit Propidieniodid behandelt, um tote Zellen zu visualisieren, und mit CLSM abgebildet (D) Aggregate mit gewünschtem Phänotyp werden mitHILFE VON FACS von SCFM2 getrennt. Abkürzungen: SCFM2 = synthetisches Mukoviszidose-Sputummedium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokale Laserscanning-Mikroskopie; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Hier wird der Nutzen von SCFM2 zur Untersuchung der Auswirkungen der Antibiotikabehandlung auf Pa-Aggregate in Echtzeit demonstriert, gefolgt von der Verwendung eines Zellsortierungsansatzes zur Isolierung von Populationen von Aggregaten mit unterschiedlichen Phänotypen für die nachgelagerte Analyse (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) ist einer der häufigsten opportunistischen Erreger im Zusammenhang mit Mukoviszidose (CF). Sobald die Pa-Besiedlung etabliert ist, bildet ein großer Teil der infizierenden Bakterien Biofilme im Atemwegssputum. Pa-Biofilme, die aus CF-Sputum isoliert wurden, wachsen nachweislich in kleinen, dichten Aggregaten von ~ 10-1.000 Zellen, die räumlich organisiert sind und klinisch relevante Phänotypen wie antimikrobielle Toleranz aufweisen. Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung, wie Pa-Aggregate auf die sich verändernde Sputumumgebung reagieren, ist das Fehlen ernährungsrelevanter und robuster Systeme, die die Aggregatbildung fördern. Mit einem synthetischen CF-Sputummedium (SCFM2) kann die Lebensgeschichte von Pa-Aggregaten mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) und Bildanalyse mit der Auflösung einer einzelnen Zelle beobachtet werden. Dieses In-vitro-System ermöglicht die Beobachtung von Tausenden von Aggregaten unterschiedlicher Größe in Echtzeit, drei Dimensionen und im Mikrometerbereich. Auf Individueller und Populationsebene ermöglicht die Fähigkeit, Aggregate nach Phänotyp und Position zu gruppieren, die Beobachtung von Aggregaten in verschiedenen Entwicklungsstadien und deren Reaktion auf Veränderungen in der Mikroumgebung, wie z.B. Antibiotikabehandlung, präzise zu differenzieren.

Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Beobachtung von Pa-Aggregaten mit hoher Auflösung und in einer Umgebung, die der chronischen Infektion der CF-Lunge9,10,12ähnelt. SCFM2 bietet ein In-vitro-System, das die natürliche Aggregation von Pa-Zellen in Größen fördert, die denen ähneln, die während der tatsächlichen Infektion beobachtetwurden 10. Die Anpassungsfähigkeit von...

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Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetisches Mukoviszidose-Sputummedium (SCFM2) kann in Kombination mit konfokaler Laserscanning-Mikroskopie und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung verwendet werden, um bakterielle Aggregate mit hoher Auflösung zu beobachten. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Bewertung aggregierter Populationen während der antimikrobiellen Behandlung als Plattform für zukünftige Studien.

Werkzeuge zur Echtzeitbewertung eines Pseudomonas aeruginosa-Infektionsmodells

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Unser Protokoll bietet uns die Möglichkeit, antibiotikaresistente Bakterien in einer ernährungsphysiologischen und physischen Umgebung zu untersuchen, ähnlich wie sie wahrscheinlich in vivo existieren. Einer der größten Vorteile dieser Technik ist die Möglichkeit, hochauflösende Bilder und phänotypische Daten von Bakterien in infektionsrelevanten Populationsgrößen zu erfassen. Das sind Aggregate von etwa 10 bis 1.000 Zellen.Demonstriert wird das Verfahren von Alexa Gannon, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor. Zu beginnst du das mucinhaltige Medium unter ultraviolettem Licht vier Stunden lang sterilisieren. Das UV-behandelte Mucin unter sterilen Bedingungen in sterile 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen und bei minus 20 Grad Celsius lagern.Nachdem Sie die gepufferte Basis vorbereitet haben, fügen Sie die Stammlösung von Mucin in die gepufferte Base ein, die DNA enthält, wie im Textmanuskript beschrieben. Am Abend vor dem Experiment impfen Sie fünf Milliliter LB-Brühe mit mehreren Kolonien von Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 aus einer antibiotischen LB-Agarplatte und kultivieren Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Rührung bei 250 Umdrehungen pro Minute. Schalten Sie am nächsten Morgen, mindestens zwei Stunden vor Beginn des Experiments, das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein und öffnen Sie das Inkubationsmodul in der zugehörigen Bildgebungssoftware.500 Mikroliter der Kultur in fünf Millilitern frischer LB-Brühe verdünnen und die Bakteriensuspension bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute für 60 bis 90 Minuten inkubieren. Wenn die Bakterien in die Log-Phase eingetreten sind, pelletieren Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation und waschen Sie die Zellen dreimal mit filtersterilisiertem PBS. Nach der letzten Wäsche das Pellet in einem Milliliter PBS wieder auffüllen.Messen Sie die Absorption der bakteriellen Zellsuspension bei 600 Nanometern, um das Kulturvolumen zu bestimmen, das für eine optische Dichte von 0,05 in fünf Millilitern synthetischer Mukoviszidose-Sputummedium zwei erforderlich ist. Impfen Sie das berechnete Volumen der bakteriellen Zellsuspension im Medium und Wirbel vorsichtig, bevor Sie ein Milliliter Zellen in jede Kammer einer vierkammerigen optischen Kulturschale geben, und inkubieren Sie die Bakterien dann vier Stunden lang unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius. Um die Pseudomonas aeruginosa-Aggregate mit dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop abbilden zu können, bezeichnen Sie am Ende der Inkubation drei Vertiefungen der Kulturplatte als Antibiotika-Behandlungs-Replikate und eine sowie die No-Treatment-Kontrolle und legen Sie die Platte auf die beheizte Stufe im Mikroskop.Wählen Sie ein 63-faches Ölimmersionsziel und öffnen Sie die Registerkarte "Suchen", um die bakteriellen Aggregate im Hellfeld zu identifizieren. Definieren Sie einen Bereich für die Bildgebung innerhalb jedes Bohrplatzes und verwenden Sie das Positionsmodul, um die Bereichsposition zu speichern. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 488 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 509 Nanometer ein.Wählen Sie im Aufnahmemodul die Option Z-Stack aus, um die Bilder zu erfassen, und verwenden Sie das Linienmittelungsmodul, um die Hintergrundfluoreszenz im GFP-Kanal innerhalb des Gesamtvolumens der Z-Stack-Bilder zu reduzieren. Legen Sie die Zeitreihenoption so fest, dass 60 Scheiben in jeder Vertiefung in 15-Minuten-Intervallen für 18 Stunden erfasst werden, und verwenden Sie die definitive Fokusstrategie, um eine Fokusebene für jede Position zu speichern, die zu jedem Zeitpunkt während des Experiments neu abgebildet wird. 4-1/2 Stunden nach der Einrichtung des bildgebungsexperiments, stellen Sie jede Position ab, um die aggregierte Biomasse in jeder der vier Vertiefungen vor der Zugabe des Antibiotikums zu bestimmen.Nach sechs Stunden fügen Sie vorsichtig ein Antibiotikum zu zwei Malen unter der minimalen hemmenden Konzentration in die Mitte jedes Bohrplatzes hinzu, blasen Sie einfach die Luftflüssigkeitsschnittstelle und klicken Sie auf Experiment starten, um die Bildgebung der postantibiotischen Behandlung zu beginnen. Um die lebenden Zellen zu isolieren, kennzeichnen Sie am Ende der 18-stündigen Bildgebungsphase die Bakterien in jedem Brunnen mit dem entsprechenden Volumen an Propidieniodid gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Verwenden Sie am Ende der Inkubation einen isolierten Behälter, um die Platte auf das Durchflusszytometer zu übertragen, und stellen Sie das Zytometer so ein, dass GFP und Propidiodid mit einer 70-Mikron-Düse detektiert werden, und führen Sie dann einen Milliliter Aliquoten jedes Kulturüberstands mit der niedrigsten Durchflussrate aus, um die lebensfähigen GFP-positiven und nicht lebensfähigen Propidieniodid-negativen Pseudomonas aeruginosa-Aggregate zu sortieren.Um die aggregierte Dynamik zu quantifizieren, laden Sie die Bilder in ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm und erstellen Histogramme der Zählungen, die für die unbehandelten Kontroll- und Antibiotika-behandelten Kulturen im GFP-Kanal erzeugt wurden, um die Quantifizierung der Hintergrundfluoreszenz zu ermöglichen. Um sicherzustellen, dass die nachgewiesenen GFP-Voxel mit der bakteriellen Biomasse korrelieren, definieren Sie einen GFP-positiven Voxel als größer oder gleich dem 1,5-fachen des GFP-Hintergrundzählwerts. Erzeugen Sie die ISO-Flächen für alle verbleibenden Voxel und um einzelne Aggregate zu erkennen, aktivieren Sie die Option Split Objects und definieren Sie die Aggregate als Objekte.Verwenden Sie das Vantage-Modul, um das Volumen XYZ und die Summe der GFP-Voxel für jedes einzelne Objekt zu berechnen. Exportieren Sie diese Daten auf eine externe Statistikplattform. Filtern Sie die exportierten Daten nach Größe, um Objekte mit Volumina von mindestens fünf Kubikmikrometern zu definieren.Entfernen Sie alle Objekte mit weniger als 0,5 Kubikmikrometern und verwenden Sie das Sichtmodul, um die Entfernung jedes Objekts in Bezug auf andere Objekte in jedem Bild zu berechnen. Alternativ kann die Entfernung mit der Formel berechnet werden, dann verwenden Sie die Summen- und Durchschnittsberechnungen, um die Gesamtbiomasse im durchschnittlichen Aggregatvolumen zu bestimmen. Obwohl nach vier Stunden Antibiotikaanwendung mehrere lebensfähige Bakterienaggregate verbleiben, ist die Gesamtbiomasse der aggregierten Populationen innerhalb der mit Antibiotika behandelten Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kulturen signifikant reduziert.Mit der Zeitreihenmikroskopie können die räumlichen Muster zwischen empfindlichen Propidieniodid-positiven und toleranten GFP-positiven Aggregaten nach antibiotikaartiger Behandlung bestimmt werden. Durch die Berechnung, wie Aggregate unterschiedlicher Größe zur Gesamtpopulation beitragen, können Muster identifiziert werden, wie Aggregate auf die Antibiotikabehandlung in Bezug auf ihre Größe, Form und Position reagieren. Nach einer Antibiotikabehandlung können lebensfähige und nicht lebensfähige Aggregate erfolgreich nach ihrer fluoreszierenden Signalexpression getrennt werden.Wir hoffen, dass dieses Protokoll andere Forscher dazu inspiriert, ihren Organismus der Wahl mit einer ähnlichen Auflösung zu untersuchen. Unser Ziel ist es, in diesen komplexen Gemeinschaften unabhängig von der Infektionsstelle gemeinsame biologische Fäden zu finden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...