Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.Dは、南フロリダ大学分子医学部のスタートアップ資金と、CFF研究助成金(DARCH19G0)N.I.H(5R21AI147654 - 02(PI、陳))およびUSF微生物叢研究所によって支援されています。ホワイトリー・ラボは、この原稿に関連するデータセットを含む継続的なコラボレーションに感謝します。FACSの選別を促進してくれたチャールズ・シェカーズ博士に感謝します。数字は、Biorender.com を使用してA.D.GとS.E.Dによって作成されました。

1. 合成嚢胞性線維症培地(SCFM2)を調製する
注: SCFM2 の準備は、以下に概説する 3 つの主要な段階から構成されます (図 2)。詳細と参照については、9、 10、12を参照してください。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.j...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

この研究は、抗生物質治療の有無において細菌集合体集団を研究するために組み合わせることができる方法論を導入した。高解像度CLSMは、抗生物質にさらされると、凝集バイオマスの変化と、リアルタイムでの凝集物の構造的指向の可視化を可能にします。また、抗生物質による処理後に残るバイオマスの物理的・構造的特徴を定量化し、RNA-seqを用いた将来の遺伝子発現研究とこれらの観?...

緑膿菌(Pa)は、免疫障害を持つ個人に慢性感染を確立する日和見病原体です。遺伝性疾患嚢胞性線維症(CF)を有する人にとって、これらの感染症は一生に一度の経過に及ぶ可能性がある。CFは、気道に粘性のある栄養豊富な痰の蓄積を引き起こし、時間の経過とともに様々な微生物病原体によって植民地化される。Paは最も普及しているCF病原体の1つで、幼児期に気道を植民地化し、治療が困難な感染症1を確立する。Paは依然として重大な臨床的問題であり、近年2,3で改善された治療レジメンにもかかわらず、CFを有する人々における死亡率の主要な原因と考えられている。この持続性表現型および抗生物質耐性の増加は、新しい治療戦略の開発のための研究の優先事項として、疾病管理センター(CDC)と世界保健機関(WHO)の両方によって同定された病原体群のPaに位置を獲得している- ESKAPE病原体4。
他のESKAPE病原体と同様に、獲得した抗生物質耐性はPaでは一般的であるが、Pa抗菌耐性に寄与する多くの固有の特性もある。これらの中には、−10〜1,000細胞の凝集高密度クラスターを形成するPaの能力があり、これはCF患者痰5、6を含む複数の感染症で観察することができる。他のバイオフィルムシステムで研究されたPaと同様に、Pa凝集体は、抗生物質に対する耐性の増加や細胞間コミュニケーションの活性化(クォーラムセンシング(QS))などの臨床的に関連する表現型を表示する。例えば、Paの集合体は、他の微生物と戦うとともに、ピオシャニン7の産生などの抗菌治療を容認するためにQS規制行動を使用することが示されている。このような行動を研究する能力は、人体に存在する環境と同様の環境で細菌生態系に関するエキサイティングな洞察を提供します。
変化する痰環境にPa凝集体がどのように反応するかを研究する上で最大の課題の1つは、凝集形成を促進する栄養的に関連性の高い堅牢なシステムの欠如です。Paについて知られていることの多くは、細胞がプランクトニックに成長するインビトロシステムを使用して発見された、または生体内8で観察されていない特徴的な表面に付着した「キノコ」アーキテクチャで発見されている。フローセルや固体寒天などの古典的なバイオフィルム成長モデルは、細菌の挙動と抗生物質耐性のメカニズムに関する広範かつ貴重な知識を生み出していますが、これらの知見は必ずしもin vivoで翻訳されるとは限りません。多くのin vitroモデルは、ヒト感染部位の成長環境を模倣する能力が限られており、生体内研究では高価なコストが必要である。さらに、多くのin vivoモデルは、インビトロ技術によって得られる柔軟性と解像度を欠いている。
合成嚢胞性線維症痰(SCFM2)は、CF肺の慢性感染時に経験したようなPa成長の環境を提供するように設計されている。SCFM2は、ムチン、脂質、およびDNAに加えて、期待CF痰で同定された栄養源を含む。SCFM2のPa成長は、実際の痰の成長に必要なほぼ同一の遺伝子を必要とし、自然なPa凝集形成9、10をサポートする。接種後、プランクトニック細胞は膨張によって大きさが大きくなる凝集体を形成する。個々のセル (移民と呼ばれます) は、集合から解放され、非植民地化された領域に移行され、新しい集合体10を形成します。この生命史は、単一の細胞の解像度でCLSMおよび画像解析を使用して観察することができる。SCFM2で形成されたPaの集合体は、CF肺10で観察されるものと同様のサイズである。このモデルは、リアルタイムで、ミクロンスケールで3次元で様々なサイズの複数の集合体を観察することができます。タイムラプス顕微鏡は、1回の実験で数千個(約50,000)の集合体を追跡することを可能にします。画像解析ソフトウェアを使用することで、個々の集合体レベルと母集団レベルの両方で、3次元の集合体積、表面積、位置を含むマイクログラフの集合式の定量を可能にします。表現型と位置によって集合体をグループ化する能力を有することで、異なる発達段階での凝集体の分化と、変化する微小環境6,11への応答が可能となる。
SCFM2を使用してPa集合体を低容量および高スループットアッセイで研究すると、柔軟で費用対効果の高いモデルになります。定義された媒体として、SCFM2は複数のプラットフォームにわたって均一性および再現性を提供し、vitro9でPa集合体を研究するための栄養的および物理的に関連する方法を提供する。アプリケーションには、CLSMと組み合わせて空間組織と抗生物質耐性を高解像度で観察するアプリケーションが含まれます(この方法の論文で説明したように)。リアルタイムのミクロンスケールのデータを提供する実験を行う能力は、それらが生体内で起こり得る種間および種間相互作用の研究を可能にする。例えば、SCFM2は以前、P.が毒性および病原性に寄与する複数の遺伝子を調節するために利用するシステムのネットワークを介して、集合集団における細胞間コミュニケーションの空間的ダイナミクスを研究するために使用されてきた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> 図1: 主な実験工程のグラフィカル描写( A)SCFM2はPa細胞を接種し、ガラス底培養皿に凝集体を形成させる。(B)凝集体を共焦点顕微鏡に移し、抗生物質を加える。描かれているのは、抗生物質治療を伴わない3つの技術的複製(チャンバー1-3)と、接種されたSCFM2のコントロールウェル(4)である。凝集体は、18時間にわたってCLSMを用いて画像化され、(C)初期18時間イメージング後、死細胞を視覚化するためにヨウ化プロピジウムで骨材を処理し、所望の表現型を有する凝集体をFACSを用いてSCFM2から分離する。略語: SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地;Pa =緑膿菌CLSM = 共焦点レーザー走査顕微鏡;FACS = 蛍光活性化細胞分類。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここで、リアルタイムでPa集合体に対する抗生物質治療の影響を研究するSCFM2の有用性が示され、続いて下流分析のための明確な型素型を有する集合体の集団を分離する細胞選別アプローチの使用が示される(図1)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

緑膿菌(Pa)は 嚢胞性線維症(CF)に関連する最も一般的な日和見病原体の1つである。 Pa のコロニー形成が確立されると、感染菌の大部分が気道痰内にバイオフィルムを形成する。CF痰から分離された Pa バイオフィルムは、空間的に組織化され、抗菌耐性などの臨床的に関連する表現型を示す〜10〜1,000個の細胞の小さく密な凝集体で増殖することが示されている。変化する痰環境に Pa 凝集体がどのように反応するかを研究する上で最大の課題の1つは、凝集形成を促進する栄養的に関連性の高い堅牢なシステムの欠如です。合成CF痰培地(SCFM2)を用いて 、Pa 凝集体の寿命を観察するには、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)と単一細胞の分解能での画像解析を用いる。この インビトロ システムは、リアルタイム、3次元、およびミクロンスケールでの様々なサイズの数千の集合体の観察を可能にする。個体レベルおよび集団レベルでは、表現型および位置によって集合体をグループ化する能力を有することは、異なる発達段階での凝集体の観察を容易にし、抗生物質治療などの微小環境の変化に対する応答を精密に区別することを促進する。

この研究は、CF肺9、10、12の慢性感染と同様の環境において、高分解能でPa凝集体を観察する方法を詳述する。SCFM2は、実際の感染時に観察されたものと同様のサイズでPa細胞の自然な凝集を促進するインビトロシステムを提供する10。定義された媒体としてのSCFM2の適応性は、多くの研?...

Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

合成嚢胞性線維化痰培地(SCFM2)は、共焦点レーザー走査顕微鏡と蛍光活性化細胞選別の両方と組み合わせて利用して、細菌凝集体を高分解能で観察することができる。本論文では、将来の研究のためのプラットフォームとして抗菌治療中の集団を評価する方法を詳述する。

緑膿菌感染モデルのリアルタイム評価ツール

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

私たちのプロトコルは、生体内に存在する可能性が高い方法と同様に、栄養および物理的な環境で抗生物質耐性細菌を研究する方法を提供します。この技術の最大の利点の1つは、感染関連の集団サイズで細菌の高解像度画像とフェノールトデータをキャプチャする能力です。これは、約 10 ~ 1,000 個のセルの集計です。この手順を実証することは、私の研究室の大学院研究助手であるAlexa Gannonです。まず、ムチン含有培地を紫外光下で4時間殺菌する。UV処理されたムチンを無菌条件下で無菌1.7ミリリットルチューブに移し、マイナス20°Cでチューブを保管します。緩衝塩基を調製した後、テキスト原稿に記載されているように、DNAを含む緩衝塩基にムチンのストック溶液を加える。実験前の夕方、LB寒天プレートを含む抗生物質から緑膿菌PAO1 pMRP91のいくつかのコロニーを含むLBスープの5ミリリットルを接種し、毎分250回転で攪拌して摂氏37度で細菌を一晩培養する。翌朝、実験を開始する少なくとも2時間前に、共焦点レーザー走査顕微鏡をオンにして、関連するイメージングソフトウェアでインキュベーションモジュールを開きます。500マイクロリットルの培養液を5ミリリットルの新鮮なLBスープで希釈し、細菌懸濁液を摂氏37度、1分あたり250回転で60~90分間インキュベートします。細菌が対数相に入ると、遠心分離により細菌細胞をペレット化し、フィルター滅菌されたPBSで細胞を3回洗浄する。最後の洗浄後、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。600ナノメートルで細菌細胞懸濁液の吸光度を測定し、合成嚢胞性線維症痰培地2の5ミリリットルで0.05の光学密度に必要な培養体積を決定する。4チャンバー光学培養皿の各チャンバーに1ミリリットルの細胞を加える前に、培地および渦中の細菌細胞懸濁液の計算量を穏やかに接種し、37°Cの静的条件下で4時間細菌をインキュベートする。共焦点レーザー走査顕微鏡による緑膿菌凝集体を画像化するには、インキュベーションの終わりに、抗生物質治療が複製する培養プレートの3つのウェルと、治療制御なしと1つを指定し、顕微鏡の加熱段階にプレートを置きます。63X油浸漬目的を選択し、位置タブを開いて、明視野内の細菌凝集体を特定します。各ウェル内のイメージング領域を定義し、位置モジュールを使用してエリア位置を保存します。励起波長を488ナノメートル、発光波長を509ナノメートルに設定します。取得モジュールで Z-stack オプションを選択して画像を取得し、ライン平均モジュールを使用して Z スタック画像の総容量内で GFP チャネルのバックグラウンド蛍光を低減します。時系列オプションを設定して、各ウェルの60個のスライスを18時間15分間隔でキャプチャし、明確なフォーカス戦略を使用して、実験中の各時点で再画像化される各位置の焦点面を保存します。画像実験を設定してから4〜1/2時間後、各位置を画像化し、抗生物質を添加する前に4つのウェルのそれぞれ内の総量を決定した。6時間後、各井戸の中央に最小阻害濃度を2回下回る2回で抗生物質を穏やかに加え、空気液界面を吹き飛ばし、実験を開始して抗生物質後の治療イメージングを開始します。生きた細胞を単離するには、18時間のイメージング期間の終わりに、メーカーの勧告に従って適切な量のヨウ化プロピジウムを各ウェルにラベル付けします。インキュベーションの最後に、断熱容器を使用してプレートをフローサイトメーターに転送し、70ミクロンのノズルを使用してGFPとヨウ化プロピジウムを検出するためにサイトメーターを設定し、各培養上清の1ミリリットルのアリコートを最も低い流量で実行して、実行可能なGFP陽性および非生存性のプロピジウムヨウ化基体負性プロパチウム性のプロピドウム性の偽素基を並べ替えます。集合ダイナミクスを定量化するには、画像を適切な画像解析ソフトウェアプログラムにロードし、GFPチャネルで未処理の制御および抗生物質処理培養物のために生成された数のヒストグラムを作成して、バックグラウンド蛍光の定量を可能にします。検出されたGFPボクセルが細菌バイオマスに相関していることを確認するには、GFP陽性ボクセルをGFPバックグラウンドカウント値の1.5倍以上と定義します。残りのすべてのボクセルに対して ISO サーフェスを生成し、個々の集約を検出するには、分割オブジェクトオプションを有効にして、集計をオブジェクトとして定義します。見晴らしの良いモジュールを使用して、個々のオブジェクトのボリューム XYZ と GFP ボクセルの合計を計算します。このデータを外部の統計プラットフォームにエクスポートします。エクスポートされたデータをサイズでフィルタリングし、5立方メートル以上のボリュームを持つオブジェクトを定義します。0.5立方メートル未満のオブジェクトを除去し、見晴らしの良いモジュールを使用して、各画像内の他のオブジェクトとの相対距離を計算します。あるいは、距離を式を使用して計算し、次に合計と平均計算を使用して、平均総質量量の総バイオマスを決定することができます。抗生物質塗布の4時間後に複数の生存可能な細菌凝集体が残るが、抗生物質処理された培養物内の総集団の総バイオマスは、未治療の培養物と比較して有意に減少する。抗生物質治療後の高感度ヨウ化プロピジウム陽性および耐性GFP陽性集合体の間の空間パターンを決定するために、時系列顕微鏡を使用することができる。異なるサイズの集合体が全体の集団にどのように寄与するかを計算することによって、その大きさ、形状、位置に関連して、骨材が抗生物質治療にどのように反応するかのパターンを特定することができます。抗生物質治療後、生存可能な凝集体と生存不可能な凝集体は、蛍光シグナル発現に応じて正常に分離することができる。私たちは、このプロトコルが同様の解像度で選択した生物を研究するために他の研究者を鼓舞することを願っています。私たちの目標は、感染部位に関係なく、これらの複雑なコミュニティで一般的な生物学的糸を見つけることです。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...