Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.D는 분자 의학과, 사우스 플로리다 대학, N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, 첸) 및 미생물군유전체에 대한 USF 연구소에서 제공하는 창업 기금에 의해 지원됩니다. 이 원고와 관련된 데이터 세트와 관련된 지속적인 협업에 대해 Whiteley 연구소에 감사드립니다. FACS 분류를 촉진해 주신 찰스 세케레스 박사에게 감사드립니다. 수치는 Biorender.com 사용하여 A.D.G와 S.E.D에 의해 만들어졌습니다.

1. 합성 낭포성 섬유증 물질 준비 (SCFM2)
참고: SCFM2의 준비는 아래에 설명된 세 가지 주요 단계로구성됩니다(그림 2). 자세한 내용 및 참조는9,10,12를참조하십시오.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> <strong class="xf...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

이 작품은 항생제 치료의 존재와 부재에서 세균 성 집계 인구를 연구하기 위해 결합 될 수있는 방법론을 도입했다. 고해상도 CLSM은 항생제에 노출될 때 골재의 변화와 실시간으로 응집물의 구조적 방향을 시각화할 수 있게 합니다. 또한, 항생제로 치료 한 후 남아있는 바이오매스의 물리적 및 구조적 특징은 RNA-seq를 활용한 미래 유전자 발현 연구와 이러한 관찰을 상호 연관시키는 것을 목표로 정?...

슈도모나스 아에루기노사(Pa)는 면역이 손상된 개인에 있는 만성 감염을 설치하는 기회성 병원체입니다. 유전 질환 낭포성 섬유증 (CF)을 가진 사람들을 위해, 이 감염은 일생의 과정을 걸이 수 있습니다. CF는 시간이 지남에 따라 다양한 미생물 병원균에 의해 식민지화되는 기도에 점성영양이 풍부한 가래의 축적을 유발합니다. Pa는 가장 널리 퍼진 CF 병원체 중 하나이며, 어린 시절에 기도를 식민지화하고 치료하기 어려운 감염1을확립합니다. Pa는 중요한 임상 문제로 남아 있으며 최근2,3에서개선 된 치료 요법에도 불구하고 CF를 가진 사람들의 사망의 주요 원인으로 간주됩니다. 이러한 지속성 표현형과 항생제 내성이 증가하는 Pa는 새로운 치료 전략인 ESKAPE 병원균4의개발을 위한 연구 우선 순위로서 질병통제센터(CDC)와 세계보건기구(WHO)에 의해 확인된 병원균 군에서 Pa를 한 자리에 얻었다.
다른 ESKAPE 병원체와 마찬가지로, 취득한 항생제 내성은 Pa에서일반적이지만 Pa 항균 내성에도 기여하는 많은 본질적인 특성이 있습니다. 이들 중에서도 PA가 CF 환자 가래5,6을포함하여 다중 감염에서 관찰될 수 있는 ~10-1,000개의 세포의 고밀도 클러스터를 형성하는 능력이 있다. 다른 생물막 시스템에서 연구된 Pa 와 마찬가지로, Pa 골재는 항생제에 대한 내성 증가 및 세포 세포 통신의 활성화(쿼럼 센싱(QS)와 같은 임상적으로 관련된 표현형을 표시합니다. 예를 들어, Pa의 골재는 다른 미생물에 대항하고 피오시닌7의생산과 같은 항균 치료를 용인하기 위해 QS 조절 된 행동을 사용하는 것으로 나타났습니다. 이러한 행동을 연구하는 능력은 인체에 존재하는 것과 유사한 환경에서 세균 생태계에 대한 흥미로운 통찰력을 제공합니다.
Pa aggregates가 변화하는 가래 환경에 어떻게 반응하는지 연구하는 가장 큰 과제 중 하나는 집계 형성을 촉진하는 영양적으로 관련성이 있고 견고한 시스템이 부족하다는 것입니다. Pa에 대해 알려진 많은 것은 세포가 플랑크톤또는 생체 내에서 관찰되지 않은 특징적인 표면 부착된 "버섯" 아키텍처에서 자라는 체외 시스템을 사용하여 발견되었습니다. 유량 세포 또는 고체 천과 같은 고전적인 생물 막 성장 모델은 세균성 행동과 항생제 내성의 메커니즘에 대한 광범위하고 귀중한 지식을 산출했지만, 이러한 사실 인정은 항상 생체 내에서 번역되지 않습니다. 많은 시험관 내 모델은 인간 감염 부위의 성장 환경을 모방하는 제한된 능력을 가지고 있으며 생체 내 연구에 비용이 많이 듭니다. 차례로, 많은 생체 내 모델은 시험관 내 기술에 의해 제공되는 유연성과 해상도가 부족합니다.
합성 낭포성 섬유증 가래 (SCFM2)는 CF 폐에서 만성 감염 시 경험한 것과 유사한 Pa 성장을위한 환경을 제공하도록 설계되었습니다. SCFM2에는 뮤신, 지질 및 DNA 외에도 예상되는 CF 스푸타에서 확인된 영양 공급원이 포함됩니다. SCFM2의 Pa 성장은 실제 가래의 성장에 필요한 거의 동일한 유전자를 필요로 하며 천연 Pa 골재 형성9,10을지원합니다. 접종 후, 판자 세포는 확장을 통해 크기가 증가하는 응집체를 형성합니다. 개별 셀(이민자라고 함)은 골재에서 방출되고, 콜로니언 영역으로 마이그레이션하고, 새로운골재(10)를형성한다. 이러한 생명 기록은 단일 셀의 해상도에서 CLSM 및 이미지 분석을 사용하여 관찰할 수 있습니다. SCFM2에서 형성된 Pa의 응집체는 CF폐(10)에서관찰된 것과 유사한 크기이다. 이 모델을 사용하면 미크론 스케일에서 실시간으로 다양한 크기의 여러 응집체를 실시간으로 3차원에서 관찰할 수 있습니다. 시간 경과 현미경 검사법은 한 실험에서 수천(~50,000개)의 응집체를 추적할 수 있게 해줍니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하면 개별 집계 및 인구 수준에서 가장 가까운 0.1 μm에 대한 3차원의 집계 부피, 표면적 및 위치를 포함하여 현미경 그래프에서 집계 표현형의 정량화를 허용합니다. 표현형 및 위치에 의해 응집체를 그룹화할 수 있는 능력을 갖는 것은 변화하는 마이크로환경에 대한 반응뿐만 아니라 변화하는 마이크로환경에 대한 반응뿐만 아니라 정밀하게 다른 발달 단계에서 골재를 분화할 수 있게 한다6,11.
SCFM2를 적용하여 낮은 볼륨과 높은 처리량 분석으로 Pa 집계를 연구하면 유연하고 비용 효율적인 모델이 됩니다. 정의된 매체로서 SCFM2는 여러 플랫폼에서 균일성과 재현성을 제공하여 체외9에서 Pa 골재를 연구하는 영양및 신체적 관련 방법을 제공합니다. 응용 프로그램은 CLSM과 함께 고해상도에서 공간 조직 및 항생제 내성을 관찰하는 사용을 포함한다 (이 방법 종이에 설명된 바와 같이). 실시간 미크로네 규모의 데이터를 제공하는 실험을 수행하는 능력은 생체 내에서 발생할 수 있는 종 내 및 종 간 상호 작용에대한 연구를 가능하게 합니다. 예를 들어, SCFM2는 이전에 Pa가 이용한 시스템 네트워크를 통해 복합 체내 통신의 공간 역학을 연구하여 독성 및 발병률6에기여하는 다중 유전자를 조절하는 데 사용되어 왔다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> 그림 1: 주요 실험 단계의 그래픽 묘사. (A)SCFM2는 Pa 세포로 접종되어 유리 바닥 배양 접시에 골재를 형성할 수 있습니다. (B)골재는 공초점 현미경으로 옮겨지고 항생제가 첨가된다. 묘사된 3개의 기술 복제(챔버 1-3) 및 항생제 처리 없이 접종된 SCFM2의 제어 우물(4)이 묘사된다. 골재는 18h.(C)초기 18h 이미징 후 CLSM을 사용하여 이미지화되며, 골재는 죽은 세포를 시각화하기 위해 프로피듐 요오드로 처리되고 CLSM(D) 원하는 표현형을 사용한 골재는 FACS를 사용하여 SCFM2로부터 분리된다. 약어: SCFM2 = 합성 낭포성 섬유증 가래 배지; Pa = 슈도모나스 아루기노사; CLSM = 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사; FACS = 형광 활성화 셀 정렬. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
여기서, SCFM2의 실용성은 실시간으로 Pa 골재에 대한 항생제 치료의 영향을 연구하는 것이 입증되고, 다운스트림 분석을 위한 뚜렷한 표현형을 가진 골재의 집단을 격리하기 위한 세포 선별 접근법의 사용(그림1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
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tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

슈도모나스 아에루기노사(Pa)는 낭포성 섬유증(CF)과 관련된 가장 흔한 기회성 병원균 중 하나입니다. 일단 Pa 식민지가 확립되면, 감염박테리아의 큰 비율은 기도 가래 내의 생물막을 형성합니다. CF 가래로부터 분리된 Pa 생물막은 공간적으로 조직되고 항균 내성과 같은 임상적으로 관련된 표현형을 나타내는 ~ 10-1,000개의 세포의 작고 조밀한 응집체에서 성장하는 것으로 나타났습니다. Pa aggregates가 변화하는 가래 환경에 어떻게 반응하는지 연구하는 가장 큰 과제 중 하나는 집계 형성을 촉진하는 영양적으로 관련성이 있고 견고한 시스템이 부족하다는 것입니다. 합성 CF 가래 매체(SCFM2)를 사용하여 Pa 골재의 수명 기록은 단일 셀의 해상도에서 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM) 및 이미지 분석을 사용하여 관찰될 수 있다. 이 체외 계통은 실시간으로, 3 차원, 그리고 미크론 규모에 다양한 크기의 집계의 수천의 관찰을 할 수 있습니다. 개인 및 인구 수준에서, 표현형 및 위치에 의해 골재를 그룹화하는 능력을 갖는 것은 다른 발달 단계에서 골재의 관찰과 항생제 치료와 같은 미세 환경의 변화에 대한 반응을 정밀하게 분화할 수 있도록 용이하게 한다.

이 작품은 CF 폐9,10,12의만성 감염과 유사한 환경에서 고해상도 및 환경에서 Pa 골재를 관찰하는 방법을 자세히설명합니다. SCFM2는 실제감염(10)동안 관찰된 것과 유사한 크기로 Pa 세포의 자연적인 응집을 촉진하는 체외 시스템을 제공한다. 정의된 매체로 SCFM2의 적응성은 많은 연구 도로에 ?...

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Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

우리의 프로토콜은 우리가 생체 내에서 존재 할 가능성이 방법과 유사한 영양 및 물리적 환경에서 항생제 내성 박테리아를 연구 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점 중 하나는 감염 관련 인구 규모에서 박테리아의 고해상도 이미지와 현상 전도 데이터를 캡처할 수 있는 기능입니다. 이는 약 10~1, 000개의 셀의 집합체입니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 연구 조교 인 알렉사 Gannon이 될 것입니다. 시작하려면, 4 시간 동안 자외선 아래 mucin 함유 배지를 살균. UV 처리된 뮤신을 멸균 조건하에서 멸균 1.7 밀리리터 튜브로 옮기고 튜브를 영하 20도에 보관합니다.완충된 베이스를 준비한 후, 문헌에 설명된 바와 같이 DNA를 포함하는 완충된 베이스에 뮤신의 스톡 용액을 추가한다. 실험 전날 저녁에는 LB 한천판을 함유한 항생제로부터 슈도모나스 아에루기노사 PAO1 pMRP91의 여러 식민지를 가진 LB 국물의 5밀리리터를 접종하고 분당 250개의 회전으로 37도의 섭씨에서 하룻밤 사이에 박테리아를 배양한다. 다음 아침, 실험을 시작하기 전에 적어도 2 시간, 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 켜고 관련 이미징 소프트웨어에서 인큐베이션 모듈을 엽니다.500 마이크로리터를 신선한 LB 국물 5밀리리터로 희석하고 세균 현탁액을 섭씨 37도, 분당 250회전에서 60~90분 동안 배양합니다. 박테리아가 로그 단계에 들어갔을 때, 원심분리에 의해 세균 세포를 펠릿하고 필터 살균 PBS로 세포를 세 번 세척한다. 마지막 세척 후, PBS의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단.합성 낭포성 섬유증 가래 배지 2의 5 밀리리터에서 0.05의 광학 밀도에 필요한 배양 부피를 결정하기 위해 600 나노미터에서 세균 세포 현탁액의 흡광도를 측정한다. 4 챔버 광학 배양 접시의 각 챔버에 세포의 1 밀리리터를 추가하기 전에 중간 및 소용돌이에서 세균 세포 현탁액의 계산 된 볼륨을 부드럽게 접종 한 다음 37 섭씨37도에서 정적 조건하에서 4 시간 동안 박테리아를 배양합니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 의한 슈도모나스 아에루기노사 골재를 이미지하기 위해, 배양판의 3개의 우물을 항생제 치료가 복제하고 하나뿐만 아니라 치료 제어가 없는 것으로 지정하고 현미경의 가열된 단계에 플레이트를 배치한다.63X 오일 침지 목표를 선택하고 찾기 탭을 열어 브라이트필드에서 세균 성 골재를 식별합니다. 각 웰 내에서 이미징 영역을 정의하고 위치 모듈을 사용하여 영역 위치를 저장합니다. 488 나노미터로 발산 파장을 설정하고 방출 파장을 509 나노미터로 설정합니다.획득 모듈에서 Z 스택 옵션을 선택하여 이미지를 획득하고 라인 평균 모듈을 사용하여 Z 스택 이미지의 총 부피 내에서 GFP 채널의 배경 형광을 줄입니다. 타임 시리즈 옵션을 설정하여 각 웰의 60개의 슬라이스를 18시간 동안 15분 간격으로 캡처하고 명확한 초점 전략을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 각 시점에 다시 이미지화될 각 위치에 대해 초점 평면을 저장합니다. 이미징 실험을 설정한 후 4-1/2시간, 각 위치를 이미지하여 항생제를 첨가하기 전에 4개의 우물 내의 골재 바이오매스를 결정한다.6시간 후, 항생제를 각각의 중간까지 최소 억제 농도보다 2배 낮으로 부드럽게 첨가하면 공기액 인터페이스를 날려 버리고 시작 실험을 클릭하여 항생제 후 치료 영상을 시작한다. 살아있는 세포를 격리하기 위해, 18 시간 화상 진찰 기간의 끝에, 제조 업체의 권고에 따라 프로피듐 요오드의 적당한 양으로 각 우물에 있는 박테리아를 레이블. 인큐베이션의 끝에서, 절연 용기를 사용하여 플레이트를 유동 세포계로 옮기고 사이토미터를 설정하여 70 미크로네 노즐을 사용하여 GFP 및 프로피듐 요오드를 감지한 다음, 가능한 GFP 양성 및 비실행성 오퍼디드 디오디온 을 분류하기 위해 각 배양 체형의 1밀리리터 알리쿼시를 가장 낮은 유량으로 실행한다.골역학을 정량화하기 위해 이미지를 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 로드하고 GFP 채널에서 치료되지 않은 제어 및 항생제 처리 배양을 위해 생성된 카운트의 히스토그램을 만들어 배경 형광의 정량화를 허용한다. 검출된 GFP 복셀이 세균 바이오매스와 상관관계가 있는지 확인하기 위해 GFP 양성 복셀을 GFP 백그라운드 수 값의 1.5배 이상으로 정의합니다. 남은 모든 복셀에 대해 ISO 서피스를 생성하고 개별 집계를 감지하고 분할 객체 옵션을 활성화하고 집계를 개체로 정의합니다.유리한 모듈을 사용하여 각 개별 개체에 대한 볼륨 XYZ 및 GFP 복셀 합계를 계산합니다. 이 데이터를 외부 통계 플랫폼으로 내보냅니다. 내보낸 데이터를 크기별로 필터링하여 5입방 마이크로미터보다 크거나 동일한 볼륨을 가진 객체를 정의합니다.0.5입방마이크로미터 미만의 객체를 제거하고 유리한 모듈을 사용하여 각 이미지 내의 다른 개체와 관련하여 각 개체의 거리를 계산합니다. 또는, 거리는 수식을 사용하여 계산할 수 있고, 합계 및 평균 계산을 사용하여 평균 집계 부피의 총 바이오매스를 결정할 수 있다. 여러 개의 가능한 세균성 골재가 항생제 적용 후에 남아 있더라도, 항생제 처리한 배양 내의 총 집단의 총 바이오매스는 처리되지 않은 배양에 비해 현저하게 감소됩니다.타임시리즈 현미경검사는 항생제 치료 후 민감한 요오드 양성 및 내성 GFP 양성 골집 사이의 공간 패턴을 결정하는 데 사용될 수 있다. 다양한 크기의 골재가 전체 인구에 기여하는 방법을 계산함으로써, 골재가 그들의 크기, 모양 및 위치와 관련하여 항생제 치료에 어떻게 반응하는지의 패턴을 확인할 수 있습니다. 항생제 치료 후, 실행 가능한 및 비 실행 가능한 골재는 형광 신호 발현에 따라 성공적으로 분리 될 수 있습니다.우리는 이 프로토콜이 다른 연구자들이 비슷한 해상도로 선택의 유기체를 연구하도록 영감을 주기를 바랍니다. 우리의 목표는 감염 부위에 관계없이 이러한 복잡한 지역 사회에서 일반적인 생물학적 실을 찾는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...