Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.D støttes av oppstartsmidler levert av Department of Molecular Medicine, University of South Florida, samt et CFF-forskningsstipend (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) og USF Institute on Microbiomes. Vi takker Whiteley-laboratoriet for løpende samarbeid med datasett relatert til dette manuskriptet. Vi takker Dr. Charles Szekeres for å legge til rette for FACS-sortering. Tall ble opprettet av A.D.G og S.E.D ved hjelp av Biorender.com.

1. Forbered syntetisk cystisk fibrose medium (SCFM2)
MERK: Klargjøring av SCFM2 består av tre hovedtrinn som er beskrevet nedenfor (Figur 2). Hvis du vil ha fullstendig informasjon og referanser, kan du se9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> <strong class=...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

Dette arbeidet har innført metoder som kan kombineres for å studere bakterielle aggregerte populasjoner i nærvær og fravær av antibiotikabehandling. Høyoppløselig CLSM tillater visualisering av endringer i aggregert biomasse og strukturell orientering av aggregater over sanntid når de utsettes for antibiotika. I tillegg kan fysiske og strukturelle egenskaper ved biomassen som forblir etter behandling med antibiotika kvantifiseres, med sikte på å korrelere disse observasjonene med fremtidige genuttrykksstudier v...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) er et opportunistisk patogen som etablerer kroniske infeksjoner hos immun-kompromitterte individer. For de med den genetiske sykdommen cystisk fibrose (CF), kan disse infeksjonene strekke seg over livets løpet. CF forårsaker oppbygging av et viskøs, næringsrikt sputum i luftveiene, som blir kolonisert av en rekke mikrobielle patogener over tid. Pa er en av de mest utbredte CF patogener, koloniserer luftveiene i tidlig barndom og etablerer vanskelige å behandle infeksjoner1. Pa er fortsatt et betydelig klinisk problem og regnes som en ledende årsak til dødelighet hos de med CF, til tross for forbedrede terapiregimer de siste årene2,3. Denne utholdenhet fenotypen og økende antibiotikatoleranse har gitt Pa en plass i en gruppe patogener identifisert av både Centers for Disease Control (CDC) og Verdens helseorganisasjon (WHO) som forskningsprioriteringer for utvikling av nye terapeutiske strategier - ESKAPE patogener4.
Som andre ESKAPE-patogener er er ervervet antibiotikaresistens vanlig hos Pa, men det er også mange iboende egenskaper som bidrar til Pa antimikrobiell toleranse. Blant disse er Pas evne til å danne aggregater-svært tette klynger på ~ 10-1000 celler, som kan observeres ved flere infeksjoner, inkludert CF pasient sputum5,6. I likhet med Pa studert i andre biofilmsystemer, viser Pa aggregater klinisk relevante fenotyper som økt resistens mot antibiotika og aktivering av cellecellekommunikasjon (quorumssensor (QS)). For eksempel har aggregater av Pa vist seg å bruke QS-regulert oppførsel for å bekjempe andre mikrober, samt tolerere antimikrobielle behandlinger som produksjon av pyocyanin7. Evnen til å studere slik atferd gir et spennende innblikk i bakterielle økosystemer i et miljø som ligner det de eksisterer i menneskekroppen.
En av de største utfordringene med å studere hvordan Pa aggregater reagerer på det skiftende sputummiljøet, er mangelen på ernæringsmessig relevante og robuste systemer som fremmer aggregert dannelse. Mye av det som er kjent om Pa har blitt oppdaget ved hjelp av in vitro-systemer der celler vokser planktonisk eller i en karakteristisk overflatemontert, "sopp" arkitektur som ikke har blitt observert in vivo8. Mens klassiske biofilmvekstmodeller, som strømningsceller eller fast agar, har gitt omfattende og verdifull kunnskap om bakteriell atferd og mekanismer for antibiotikatoleranse, oversetter disse funnene ikke alltid in vivo. Mange in vitro-modeller har en begrenset evne til å etterligne vekstmiljøet på det menneskelige infeksjonsstedet, noe som krever kostbare in vivo-studier. I sin tur mangler mange in vivo-modeller fleksibiliteten og oppløsningen som gis av in vitro-teknikker. 
Syntetisk cystisk fibrose sputum (SCFM2) er designet for å gi et miljø for Pa vekst som ligner det som oppleves under kronisk infeksjon i CF-lungen. SCFM2 inkluderer ernæringskilder identifisert i ekspektorert CF-sputa i tillegg til mucin, lipider og DNA. Pa vekst i SCFM2 krever et nesten identisk gen satt til det som kreves for vekst i faktisk sputum og støtter naturlig Pa aggregertformasjon 9,10. Etter inokulering danner planktoniske celler aggregater som øker i størrelse gjennom ekspansjon. Enkeltceller (referert til som migranter) frigjøres fra aggregater, migrerer til ukoloniserte områder og danner nye aggregater10. Denne livshistorikken kan observeres ved hjelp av CLSM og bildeanalyse ved oppløsningen til en enkelt celle. Aggregater av Pa dannet i SCFM2 er av lignende størrelser som de som er observert i CF lunge10. Denne modellen tillater observasjon av flere aggregater av varierende størrelse i sanntid og i tre dimensjoner på mikronskalaen. Intervallmikroskopi gjør det mulig å spore tusenvis (~50 000) aggregater i ett eksperiment. Bruken av bildeanalyseprogramvare tillater kvantifisering av aggregerte fenotyper fra mikrografer, inkludert aggregert volum, overflateareal og posisjon i tre dimensjoner til nærmeste 0,1 μm, både på individnivå og befolkningsnivå. Å ha evnen til å gruppere aggregater etter fenotype og posisjon tillater differensiering av aggregater på forskjellige utviklingsstadier med presisjon, samt deres respons på et skiftende mikromiljø6,11.
Anvendelsen av SCFM2 for å studere Pa-aggregater i lavvolum- og høygjennomstrømningsanalyser gjør den til en fleksibel, kostnadseffektiv modell. Som et definert medium tilbyr SCFM2 ensartethet og reproduserbarhet på tvers av flere plattformer, og gir en ernæringsmessig og fysisk relevant metode for å studere Pa aggregater in vitro9. Anvendelser inkluderer bruk i kombinasjon med CLSM for å observere romlig organisering og antibiotikatoleranse ved høy oppløsning (som beskrevet i dette metodepapiret). Evnen til å utføre eksperimenter som gir sanntidsdata i mikronskala, gjør det mulig å studere intraarter og inter-arts interaksjoner som de kan forekomme in vivo. For eksempel har SCFM2 tidligere blitt brukt til å studere den romlige dynamikken i cellecellekommunikasjon i samlede populasjoner via et nettverk av systemer som brukes av Pa for å regulere flere gener som bidrar til virulens og patogenese6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Figur 1: Grafisk fremstilling av de viktigste eksperimentelle trinnene. (A) SCFM2 er inokulert med Pa-celler og har lov til å danne aggregater i en glassbunnet kulturrett. (B) Aggregater overføres til det konfiske mikroskopet, og antibiotika tilsettes. Avbildet er tre tekniske replikeringer (kamre 1-3) og en kontrollbrønn (4) inokulert SCFM2 uten antibiotikabehandling. Aggregater er avbildet ved hjelp av CLSM i løpet av 18 h. (C) Etter den første 18-timers avbildningen behandles aggregater med propidiumjodid for å visualisere døde celler og avbildet ved hjelp av CLSM (D) Aggregater med ønsket fenotype er skilt fra SCFM2 ved hjelp av FACS. Forkortelser: SCFM2 = syntetisk cystisk fibrose sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfekt laser skanning mikroskopi; FACS = fluorescensaktivert cellesortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Her demonstreres nytten av SCFM2 for å studere effekten av antibiotikabehandling på Pa-aggregater i sanntid, etterfulgt av bruk av en cellesorteringstilnærming for å isolere populasjoner av aggregater med distinkte fenotyper for nedstrømsanalyse (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) er et av de vanligste opportunistiske patogenene forbundet med cystisk fibrose (CF). Når Pa-koloniseringen er etablert, danner en stor del av de smittende bakteriene biofilmer i luftveissputum. Pa biofilmer isolert fra CF sputum har vist seg å vokse i små, tette aggregater på ~ 10-1000 celler som er romlig organisert og viser klinisk relevante fenotyper som antimikrobiell toleranse. En av de største utfordringene med å studere hvordan Pa aggregater reagerer på det skiftende sputummiljøet, er mangelen på ernæringsmessig relevante og robuste systemer som fremmer aggregert dannelse. Ved hjelp av et syntetisk CF-sputummedium (SCFM2) kan livshistorien til Pa-aggregater observeres ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) og bildeanalyse ved oppløsningen til en enkelt celle. Dette in vitro-systemet tillater observasjon av tusenvis av aggregater av varierende størrelse i sanntid, tre dimensjoner og i mikronskalaen. På individ- og befolkningsnivå legger det å ha evnen til å gruppere aggregater etter fenotype og posisjon observasjon av aggregater på ulike utviklingsstadier og deres respons på endringer i mikromiljøet, som antibiotikabehandling, å bli differensiert med presisjon.

Dette arbeidet beskriver metoder for å observere Pa aggregater med høy oppløsning og i et miljø som ligner på kronisk infeksjon i CF lunge9,10,12. SCFM2 gir et in vitro-system som fremmer naturlig aggregering av Pa-celler i størrelser som ligner de som observeres under faktisk infeksjon10. Tilpasningsevnen til SCFM2 som et definert medium kan utnyttes til å nærme seg man...

Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Syntetisk cystisk fibrose sputum medium (SCFM2) kan brukes i kombinasjon med både konfokal laser skanning mikroskopi og fluorescens-aktivert celle sortering for å observere bakterielle aggregater ved høy oppløsning. Denne artikkelen beskriver metoder for å vurdere aggregerte populasjoner under antimikrobiell behandling som en plattform for fremtidige studier.

Verktøy for sanntidsvurdering av en Pseudomonas aeruginosa infeksjonsmodell

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Vår protokoll gir oss en måte å studere antibiotikaresistente bakterier i et ernæringsmessig og fysisk miljø som ligner på hvordan de sannsynligvis eksisterer in vivo. En av de største fordelene med denne teknikken er evnen til å fange høyoppløselige bilder og fenotypiske data om bakterier i infeksjonsalevante populasjonsstørrelser. Det er aggregater på omtrent 10 til 1000 celler.Å demonstrere prosedyren vil være Alexa Gannon, en vitenskapelig assistent fra laboratoriet mitt. For å begynne med sterilisere mucinholdig medium under ultrafiolett lys i fire timer. Overfør den UV-behandlede mucinen til sterile 1,7 milliliterrør under sterile forhold og oppbevar rørene ved minus 20 grader Celsius.Etter å ha forberedt den bufrede basen, legg til lagerløsningen av mucin i den bufrede basen som inneholder DNA som beskrevet i tekstmanuskriptet. Kvelden før eksperimentet inokulerer fem milliliter LB-buljong med flere kolonier pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 fra et antibiotikum som inneholder LB agarplate og kultur bakteriene over natten ved 37 grader Celsius med agitasjon ved 250 omdreininger per minutt. Neste morgen, minst to timer før du starter eksperimentet, slår du på det kondole laserskanningsmikroskopet og åpner inkubasjonsmodulen i den tilknyttede bildebehandlingsprogramvaren.Fortynn 500 mikroliter av kulturen i fem milliliter fersk LB-buljong og inkuber bakteriell suspensjon ved 37 grader Celsius og 250 omdreininger per minutt i 60 til 90 minutter. Når bakteriene har kommet inn i loggfasen, pellet bakteriecellene ved sentrifugering og vask cellene tre ganger med filtersterilisert PBS. Etter den siste vasken, resuspend pellet i en milliliter PBS.Mål absorbansen av bakteriell cellefjæring ved 600 nanometer for å bestemme kulturvolumet som kreves for en optisk tetthet på 0,05 i fem milliliter syntetisk cystisk fibrose sputum medium to. Inokuler det beregnede volumet av bakteriell celleoppheng i mediet og virvelen forsiktig før du legger til en milliliter celler i hvert kammer av en firekammeret optisk kulturrett, og inkuber deretter bakteriene i fire timer under statiske forhold ved 37 grader Celsius. For å avbilde Pseudomonas aeruginosa aggregater ved konfokal laser skanning mikroskop, på slutten av inkubasjonen, betegne tre brønner av kulturplaten som antibiotika behandling replikerer og en samt ingen behandlingskontroll og plassere platen på oppvarmet stadium i mikroskopet.Velg et 63X olje nedsenkingsmål og åpne lokaliseringsfanen for å identifisere bakteriell aggregater i brightfield. Definer et område for avbildning i hver brønn, og bruk posisjonsmodulen til å lagre områdeposisjonen. Sett eksitasjonsbølgelengden til 488 nanometer og utslippsbølgelengden til 509 nanometer.I oppkjøpsmodulen velger du Z-stack-alternativet for å skaffe bildene og bruke linjegjennomsnittsmodulen for å redusere bakgrunnsfluorescensen i GFP-kanalen innenfor det totale volumet av Z-stack-bildene. Angi tidsseriealternativet for å fange opp 60 stykker i hver brønn med 15-minutters intervaller i 18 timer, og bruk den bestemte fokusstrategien til å lagre et fokusplan for hver posisjon som skal avbildes på nytt på hvert tidspunkt gjennom hele eksperimentet. 4-1/2 timer etter at du har satt opp bildebehandlingseksperimentet, må du bilde hver posisjon for å bestemme den samlede biomassen i hver av de fire brønnene før tilsetning av antibiotika.Etter seks timer, legg forsiktig til antibiotika to ganger under minimum hemmende konsentrasjon til midten av hver brønn bare blåse luftvæskegrensesnittet og klikk start eksperimentet for å starte post-antibiotika behandling avbildning. For å isolere levende celler, på slutten av 18-timers bildebehandlingsperioden, merk bakteriene i hver brønn med riktig volum propidiumjodid i henhold til produsentens anbefalinger. På slutten av inkubasjonen, bruk en isolert beholder for å overføre platen til strømningscytometeret og sett cytometeret for å oppdage GFP og propidiumjodid ved hjelp av en 70 mikron dyse, og kjør deretter en milliliter aliquots av hver kultur supernatant med lavest strømningshastighet for å sortere levedyktige GFP-positive og ikke-levedyktige propidium-jod negative Pseudomonas aeruginosa aggregater.For å kvantifisere den samlede dynamikken, last bildene inn i et passende bildeanalyseprogram og lag histogrammer av tellingene produsert for ubehandlet kontroll og antibiotikabehandlede kulturer i GFP-kanalen for å tillate kvantifisering av bakgrunnsfluorescensen. For å sikre at de oppdagede GFP-voxlene korrelerer med bakteriebiomassen, definerer du en GFP-positiv voxel som større enn eller lik 1,5 ganger GFP-bakgrunnstallverdien. Produser ISO-overflatene for alle gjenværende voxels og for å oppdage individuelle aggregater, aktiver alternativet for delte objekter og definer aggregatene som objekter.Bruk utsiktsmodulen til å beregne volumet XYZ og summen av GFP-vokseller for hvert enkelt objekt. Eksporter disse dataene til en ekstern statistisk plattform. Filtrer de eksporterte dataene etter størrelse for å definere objekter med volumer som er større enn eller lik fem kubikkmikrometer.Fjern objekter som er mindre enn 0,5 kubikkmikrometer, og bruk utsiktsmodulen til å beregne avstanden til hvert objekt i forhold til andre objekter i hvert bilde. Alternativt kan avstanden beregnes ved hjelp av formelen, og deretter bruke summen og gjennomsnittlige beregninger for å bestemme den totale biomassen i gjennomsnittlig aggregert volum. Selv om flere levedyktige bakteriemengder forblir etter fire timer med antibiotikapåføring, reduseres den totale biomassen til de samlede populasjonene i de antibiotikabehandlede kulturene betydelig sammenlignet med for ubehandlede kulturer.Tidsseriemikroskopi kan brukes til å bestemme de romlige mønstrene mellom sensitiv propidiumjodidpositiv og tolerant GFP-positive aggregater etter antibiotikabehandling. Ved å beregne hvordan aggregater av forskjellige størrelser bidrar til den totale populasjonen, kan mønstre for hvordan aggregater reagerer på antibiotikabehandling i forhold til størrelse, form og posisjon identifiseres. Etter antibiotikabehandling kan levedyktige og ikke-levedyktige aggregater skilles i henhold til deres fluorescerende signaluttrykk.Vi håper denne protokollen inspirerer andre forskere til å studere deres valgte organisme med en lignende oppløsning. Vårt mål er å finne felles biologiske tråder i disse komplekse samfunnene uavhengig av smittestedet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftveisinfeksjon i Mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studere mikrobielle samfunn<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av Host-mediert samhandling mellom<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: I Vivo overvåking av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infeksjoner i kroniske sår i en diabetiker Hairless Murine modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av bestilt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa belastning PA14 Transposon innsetting mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder for å oppdage cytotoksisk Amyloids følgende infeksjon av lunge endotelceller av Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...