Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

A S.E.D é apoiada por fundos iniciantes fornecidos pelo Departamento de Medicina Molecular da Universidade do Sul da Flórida, bem como uma bolsa de pesquisa CFF (DARCH19G0) o N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) e o UsF Institute on Microbiomes. Agradecemos ao laboratório whiteley pela colaboração contínua envolvendo conjuntos de dados relacionados a este manuscrito. Agradecemos ao Dr. Charles Szekeres por facilitar a classificação da FACS. Os números foram criados pela A.D.G e S.E.D usando Biorender.com.

1. Prepare o meio de fibrose cística sintética (SCFM2)
NOTA: A preparação do SCFM2 compreende três etapas principais descritas abaixo (Figura 2). Para obter detalhes e referências completos, consulte9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> <strong class="x...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

Este trabalho introduziu metodologias que podem ser combinadas para estudar populações bacterianas agregadas na presença e ausência de tratamento antibiótico. O CLSM de alta resolução permite a visualização de mudanças na biomassa agregada e a orientação estrutural dos agregados em tempo real quando expostos a antibióticos. Além disso, podem ser quantificadas as características físicas e estruturais da biomassa que permanecem após o tratamento com antibióticos, com o objetivo de correlacionar essas obse...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) é um patógeno oportunista que estabelece infecções crônicas em indivíduos imuno-comprometidos. Para aqueles com a doença genética fibrose cística (CF), essas infecções podem percorrer o curso de uma vida. Cf causa o acúmulo de uma escarro viscosa e rica em nutrientes nas vias aéreas, que se torna colonizada por uma variedade de patógenos microbianos ao longo do tempo. Pa é um dos patógenos cf mais prevalentes, colonizando as vias aéreas na primeira infância e estabelecendo infecções difíceis de tratar1. O pa continua sendo um problema clínico significativo e é considerado uma das principais causas de mortalidade naqueles com CF, apesar da melhoria dos regimes terapêuticos nos últimos anos2,3. Esse fenótipo de persistência e o aumento da tolerância a antibióticos têm conquistado ao Pa um lugar em um grupo de patógenos identificados tanto pelos Centros de Controle de Doenças (CDC) quanto pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como prioridades de pesquisa para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas - os patógenos ESKAPE4.
Como outros patógenos ESKAPE, a resistência a antibióticos adquirida é comum no Pa,mas também existem muitas propriedades intrínsecas que contribuem para a tolerância antimicrobiana pa. Entre eles está a capacidade do Pa de formar aglomerados agregados altamente densos de ~10-1.000 células, que podem ser observadas em múltiplas infecções, incluindo a escarro do paciente CF5,6. Semelhante ao Pa estudado em outros sistemas de biofilme, os agregados pa apresentam fenótipos clinicamente relevantes, como aumento da resistência a antibióticos e ativação da comunicação celular-célula (sensoriamento de quórum (QS). Por exemplo, agregados de Pa têm sido mostrados para usar comportamentos regulados por QS para combater outros micróbios, bem como tolerar tratamentos antimicrobianos, como a produção de pyocyanin7. A capacidade de estudar tais comportamentos oferece uma visão emocionante dos ecossistemas bacterianos em um ambiente semelhante ao em que eles existem no corpo humano.
Um dos maiores desafios para estudar como os agregados pa respondem à mudança do ambiente de escarro é a falta de sistemas nutricionalmente relevantes e robustos que promovam a formação agregada. Muito do que se sabe sobre pa foi descoberto usando sistemas in vitro nos quais as células crescem pltipicamente ou em uma arquitetura característica anexada à superfície, "cogumelo" que não foi observada in vivo8. Embora modelos clássicos de crescimento de biofilmes, como células de fluxo ou ágar sólido, tenham gerado amplo e valioso conhecimento sobre comportamentos bacterianos e mecanismos de tolerância a antibióticos, esses achados nem sempre se traduzem in vivo. Muitos modelos in vitro têm uma capacidade limitada de imitar o ambiente de crescimento do local de infecção humana, exigindo estudos in vivo caros. Por sua vez, muitos modelos in vivo carecem da flexibilidade e resolução proporcionadas por técnicas in vitro. 
A fibrose sintética sputum (SCFM2) foi projetada para fornecer um ambiente para o crescimento de Pa semelhante ao experimentado durante a infecção crônica no pulmão CF. O SCFM2 inclui fontes nutricionais identificadas em sputa cf gestante, além de mucina, lipídios e DNA. O crescimento de Pa no SCFM2 requer um conjunto genético quase idêntico ao necessário para o crescimento da escória real e suporta a formação agregada pa natural9,10. Após a inoculação, as células planctônicas formam agregados que aumentam de tamanho através da expansão. As células individuais (referidas como migrantes) são liberadas de agregados, migram para áreas não colonizadas e formam novos agregados10. Este histórico de vida pode ser observado usando CLSM e análise de imagem na resolução de uma única célula. Os agregados de Pa formados em SCFM2 são de tamanhos semelhantes aos observados no pulmãoCF 10. Este modelo permite a observação de múltiplos agregados de tamanho variável em tempo real e em três dimensões na escala de mícingos. A microscopia de lapso de tempo permite o rastreamento de milhares (~50.000) de agregados em um experimento. O uso de software de análise de imagens permite a quantificação de fenótipos agregados de micrografos, incluindo volume agregado, área de superfície e posição em três dimensões até os 0,1 μm mais próximos, tanto nos níveis agregado individual quanto populacional. Ter a capacidade de agrupar agregados por fenótipo e posição permite a diferenciação de agregados em diferentes estágios de desenvolvimento com precisão, bem como sua resposta a um microambiente em mudança6,11.
A aplicação do SCFM2 para estudar agregados pa em ensaios de baixo volume e alto rendimento torna-o um modelo flexível e econômico. Como um meio definido, o SCFM2 oferece uniformidade e reprodutibilidade em várias plataformas, fornecendo um método nutricional e fisicamente relevante para estudar agregados pa in vitro9. As aplicações incluem seu uso em combinação com o CLSM para observar a organização espacial e a tolerância a antibióticos em alta resolução (como descrito neste artigo de métodos). A capacidade de realizar experimentos que fornecem dados em tempo real, em escala de micron, permite o estudo de interações intra-espécies e interespécies, pois elas podem ocorrer in vivo. Por exemplo, o SCFM2 já foi usado para estudar a dinâmica espacial da comunicação celular em populações agregadas através de uma rede de sistemas utilizados pela Pa para regular múltiplos genes que contribuem para a virulência e a patogênese6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Figura 1: Representação gráfica dos principais passos experimentais. (A) SCFM2 é inoculado com células Pa e permitido formar agregados em um prato de cultura com fundo de vidro. (B) Os agregados são transferidos para o microscópio confocal, e o antibiótico é adicionado. São retratadas três réplicas técnicas (câmaras 1-3) e um poço de controle (4) de SCFM2 inoculado sem tratamento antibiótico. Agregados são imagens usando CLSM ao longo de 18 h. (C) Após a imagem inicial de 18h, os agregados são tratados com iodeto de propídio para visualizar células mortas e imagens usando CLSM (D) Agregados com fenótipo desejado são separados do SCFM2 usando FACS. Abreviaturas: SCFM2 = meio de escarro de fibrose cística sintética; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopia de varredura a laser confocal; FACS = classificação celular ativada por fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Aqui, demonstra-se a utilidade do SCFM2 para estudar o impacto do tratamento antibiótico nos agregados de pa em tempo real, seguida pelo uso de uma abordagem de classificação celular para isolar populações de agregados com fenótipos distintos para análise a jusante(Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) é um dos patógenos oportunistas mais comuns associados à fibrose cística (CF). Uma vez estabelecida a colonização pa, uma grande proporção das bactérias infectantes formam biofilmes dentro da escória das vias aéreas. Os biofilmes pa isolados da escarro cf têm se mostrado que crescem em pequenos agregados densos de ~10-1.000 células que são organizadas espacialmente e exibem fenótipos clinicamente relevantes, como a tolerância antimicrobiana. Um dos maiores desafios para estudar como os agregados pa respondem à mudança do ambiente de escarro é a falta de sistemas nutricionalmente relevantes e robustos que promovam a formação agregada. Utilizando um meio de escarro CF sintético (SCFM2), a história de vida dos agregados pa pode ser observada usando microscopia de varredura a laser confocal (CLSM) e análise de imagem na resolução de uma única célula. Este sistema in vitro permite a observação de milhares de agregados de tamanho variável em tempo real, três dimensões e na escala de mícingos. Nos níveis individual e populacional, ter a capacidade de agrupar agregados por fenótipo e posição facilita a observação de agregados em diferentes estágios de desenvolvimento e sua resposta a mudanças no microambiente, como o tratamento com antibióticos, para ser diferenciado com precisão.

Este trabalho detalha métodos para observar os agregados pa em alta resolução e em um ambiente semelhante ao da infecção crônica do pulmão CF9,10,12. O SCFM2 fornece um sistema in vitro que promove a agregação natural de células Pa em tamanhos semelhantes aos observados durante a infecção real10. A adaptabilidade do SCFM2 como um meio definido pode ser aproveitada pa...

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Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

O meio de escarro de fibrose cística sintética (SCFM2) pode ser utilizado em combinação com microscopia de varredura a laser confocal e classificação celular ativada por fluorescência para observar agregados bacterianos em alta resolução. Este artigo detalha métodos para avaliar populações agregadas durante o tratamento antimicrobiano como uma plataforma para estudos futuros.

Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Nosso protocolo fornece uma maneira de estudar bactérias resistentes a antibióticos em um ambiente nutricional e físico semelhante à forma como elas provavelmente existem in vivo. Uma das maiores vantagens dessa técnica é a capacidade de capturar imagens de alta resolução e dados fenotípicos de bactérias em tamanhos populacionais relevantes para infecções. Isso é agregado de aproximadamente 10 a 1.000 células.Demonstrando o procedimento estará Alexa Gannon, uma assistente de pesquisa de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, esterilize o meio contendo mucina sob luz ultravioleta por quatro horas. Transfira a mucina tratada por UV em tubos estéreis de 1,7 mililitros em condições estéreis e armazene os tubos a menos 20 graus Celsius.Após a preparação da base tamponada, adicione a solução de estoque de mucina na base tamponada contendo DNA, conforme descrito no manuscrito do texto. Na noite anterior ao experimento, inocularam cinco mililitros de caldo LB com várias colônias de Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 de um antibiótico contendo placa de ágar LB e cultura a bactéria durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 250 revoluções por minuto. Na manhã seguinte, pelo menos duas horas antes de iniciar o experimento, ligue o microscópio de varredura a laser confocal e abra o módulo de incubação no software de imagem associado.Diluir 500 microliters da cultura em cinco mililitros de caldo LB fresco e incubar a suspensão bacteriana a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto durante 60 a 90 minutos. Quando as bactérias entrarem na fase de tronco, pelota as células bacterianas por centrifugação e lave as células três vezes com pbs esterilizado por filtro. Após a última lavagem, resuspenja a pelota em um mililitro de PBS.Meça a absorção da suspensão celular bacteriana em 600 nanômetros para determinar o volume de cultura necessário para uma densidade óptica de 0,05 em cinco mililitros de fibrose sintética escarro de escarro dois. Inocular o volume calculado de suspensão celular bacteriana no meio e vórtice suavemente antes de adicionar um mililitro de células a cada câmara de um prato de cultura óptica de quatro câmaras, em seguida, incubar as bactérias por quatro horas em condições estáticas a 37 graus Celsius. Para imagem os agregados pseudomonas aeruginosa pelo microscópio de varredura a laser confocal, no final da incubação, designar três poços da placa de cultura como tratamento antibiótico se replica e um bem como o controle sem tratamento e colocar a placa no palco aquecido no microscópio.Selecione um objetivo de imersão em óleo 63X e abra a guia de localização para identificar os agregados bacterianos no campo brilhante. Defina uma área para imagem dentro de cada poço e use o módulo de posições para armazenar a posição da área. Defina o comprimento de onda de excitação para 488 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 509 nanômetros.No módulo de aquisição, selecione a opção Z-stack para adquirir as imagens e use o módulo de média de linha para reduzir a fluorescência de fundo no canal GFP dentro do volume total das imagens de pilha Z. Defina a opção de série temporal para capturar 60 fatias em cada poço em intervalos de 15 minutos por 18 horas e use a estratégia de foco definitiva para armazenar um plano focal para cada posição que será reimagem em cada ponto de tempo durante todo o experimento. 4-1/2 horas após a configuração do experimento de imagem, imagem cada posição para determinar a biomassa agregada dentro de cada um dos quatro poços antes da adição do antibiótico.Depois de seis horas, adicione suavemente antibiótico duas vezes abaixo da concentração inibitória mínima para o meio de cada poço basta explodir a interface líquida de ar e clicar em iniciar o experimento de início para iniciar a imagem de tratamento pós-antibiótico. Para isolar as células vivas, ao final do período de imagem de 18 horas, rotule as bactérias em cada poço com o volume adequado de iodeto de propídio de acordo com as recomendações do fabricante. No final da incubação, use um recipiente isolado para transferir a placa para o citómetro de fluxo e ajuste o cítmetro para detectar gfp e iodeto de propidium usando um bico de 70 mícrons, em seguida, execute uma alíquota mililitro de cada cultura supernante na menor taxa de fluxo para classificar o fFP-positivo e inviável propidium iodide negativo Pseudomonas aeruginosa agregados.Para quantificar a dinâmica agregada, carregue as imagens em um programa de software de análise de imagem adequado e crie histogramas das contagens produzidas para o controle não tratado e culturas tratadas com antibióticos no canal GFP para permitir a quantificação da fluorescência de fundo. Para garantir que os voxels GFP detectados se correlacionem com a biomassa bacteriana, defina um voxel GFP positivo como maior ou igual a 1,5 vezes o valor da contagem de fundo do GFP. Produza as superfícies ISO para todos os voxels restantes e para detectar agregados individuais, habilite a opção de objetos divididos e defina os agregados como objetos.Use o módulo de vantagem para calcular o volume XYZ e a soma dos voxels GFP para cada objeto individual. Exporte esses dados para uma plataforma estatística externa. Filtre os dados exportados por tamanho para definir objetos com volumes maiores ou iguais a cinco micrômetros cúbicos.Remova quaisquer objetos com menos de 0,5 micrômetros cúbicos e use o módulo de vantagem para calcular a distância de cada objeto em relação a outros objetos dentro de cada imagem. Alternativamente, a distância pode ser calculada utilizando a fórmula e, em seguida, utilizar a soma e os cálculos médios para determinar a biomassa total no volume agregado médio. Embora múltiplos agregados bacterianos viáveis permaneçam após quatro horas de aplicação de antibióticos, a biomassa total das populações agregadas dentro das culturas tratadas com antibióticos é significativamente reduzida em comparação com a de culturas não tratadas.A microscopia da série temporal pode ser usada para determinar os padrões espaciais entre agregados positivos de iodeto de propídio sensível e agregados positivos de GFP após o tratamento com antibióticos. Ao calcular como agregados de diferentes tamanhos contribuem para a população em geral, podem ser identificados padrões de como os agregados respondem ao tratamento com antibióticos em relação ao seu tamanho, forma e posição. Após o tratamento com antibióticos, agregados viáveis e inviáveis podem ser separados com sucesso de acordo com sua expressão de sinal fluorescente.Esperamos que este protocolo inspire outros pesquisadores a estudar seu organismo de escolha em uma resolução semelhante. Nosso objetivo é encontrar fios biológicos comuns nessas comunidades complexas, independentemente do local da infecção.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Imunologia e Infecção

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

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Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

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Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino

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Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

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Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

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Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

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Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

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Replicação do requisitado, biblioteca não redundante de estirpe Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon mutantes de inserção

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

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