Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.D stöds av start-up fonder som tillhandahålls av Institutionen för molekylär medicin, University of South Florida, samt ett CFF-forskningsanslag (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) och USF Institute on Microbiomes. Vi tackar Whiteley-labbet för det pågående samarbetet med datauppsättningar relaterade till detta manuskript. Vi tackar dr Charles Szekeres för att han underlättade FACS-sortering. Siffrorna skapades av A.D.G och S.E.D med hjälp Biorender.com.

1. Förbered syntetiskt cystiskt fibrosmedium (SCFM2)
ANM.: Beredningen av SCFM2 omfattar tre huvudsteg som beskrivs nedan(figur 2). Fullständig information och referenser finns i9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> Figur 2<str...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

Detta arbete har introducerat metoder som kan kombineras för att studera bakteriella aggregerade populationer i närvaro och frånvaro av antibiotikabehandling. Högupplöst CLSM möjliggör visualisering av förändringar i aggregerad biomassa och den strukturella orienteringen av aggregat över realtid när de utsätts för antibiotika. Dessutom kan fysiska och strukturella egenskaper hos biomassan som kvarstår efter behandling med antibiotika kvantifieras, med målet att korrelera dessa observationer med framtida ge...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) är en opportunistisk patogen som etablerar kroniska infektioner hos immunkomprometterade individer. För dem med den genetiska sjukdomen cystisk fibros (CF), kan dessa infektioner sträcka sig över en livstid. CF orsakar uppbyggnaden av en trögflytande, näringsrik sputum i luftvägarna, som koloniseras av en mängd olika mikrobiella patogener över tiden. Pa är en av de vanligaste CF patogenerna, kolonisera luftvägarna i tidig barndom och upprätta svårbehandlade infektioner1. Pa är fortfarande ett betydande kliniskt problem och anses vara en ledande orsak till dödlighet hos dem med CF, trots förbättrade terapiregimer under de senasteåren 2,3. Denna envishet fenotyp och ökande antibiotikatolerans har tjänat Pa en plats i en grupp patogener som identifierats av både Centers for Disease Control (CDC) och Världshälsoorganisationen (WHO) som forskningsprioriteringar för utveckling av nya terapeutiska strategier - ESKAPE patogener4.
Liksom andra ESKAPE patogener, förvärvade antibiotikaresistens är vanligt i Pa, men det finns också många inneboende egenskaper som bidrar till Pa antimikrobiell tolerans. Bland dessa är Pas förmåga att bilda aggregerade mycket täta kluster av ~ 10-1 000 celler, som kan observeras vid flera infektioner, inklusive CF patientens sputum5,6. I likhet med Pa som studerats i andra biofilmsystem uppvisar Pa-aggregat kliniskt relevanta fenotyper såsom ökad resistens mot antibiotika och aktivering av cellcellskommunikation (kvorumavkänning (QS)). Till exempel har aggregat av Pa visat sig använda QS-reglerade beteenden för att bekämpa andra mikrober samt tolerera antimikrobiella behandlingar som produktion av pyocyanin7. Förmågan att studera sådana beteenden ger en spännande inblick i bakteriella ekosystem i en miljö som liknar den där de finns i människokroppen.
En av de största utmaningarna med att studera hur Pa-aggregat svarar på den föränderliga sputummiljön är bristen på näringsmässigt relevanta och robusta system som främjar aggregerad bildning. Mycket av det som är känt om Pa har upptäckts med hjälp av in vitro-system där celler växer planktoniskt eller i en karakteristisk ytbundet "svamp" -arkitektur som inte har observerats in vivo8. Medan klassiska biofilm tillväxt modeller, såsom flödesceller eller fast agar, har gett omfattande och värdefull kunskap om bakteriella beteenden och mekanismer för antibiotikatolerans, översätter dessa resultat inte alltid in vivo. Många in vitro-modeller har en begränsad förmåga att efterlikna tillväxtmiljön på den mänskliga infektionsplatsen, vilket kräver kostsamma in vivo-studier. Många in vivo-modeller saknar i sin tur den flexibilitet och upplösning som in vitro-teknik ger. 
Syntetisk cystisk fibros sputum (SCFM2) är utformad för att ge en miljö för Pa tillväxt liknande den som upplevs under kronisk infektion i CF lungan. SCFM2 innehåller näringskällor som identifierats i expectorated CF sputa utöver mucin, lipider och DNA. Pa tillväxt i SCFM2 kräver en nästan identisk gen inställd på den som krävs för tillväxt i faktisk sputum och stöder naturlig Pa aggregeradbildande 9,10. Efter inokulering bildar planktoniska celler aggregat som ökar i storlek genom expansion. Enskilda celler (kallas migranter) frigörs från aggregat, migrerar till ofärgade områden och bildar nya aggregat10. Denna livshistoria kan observeras med CLSM och bildanalys vid upplösningen av en enda cell. Aggregat av Pa som bildas i SCFM2 är av liknande storlekar som de som observerats i CF lung10. Denna modell gör det möjligt att observera flera aggregat av varierande storlek i realtid och i tre dimensioner på mikronskalan. Timelapse-mikroskopi gör det möjligt att spåra tusentals (~ 50 000) aggregat i ett experiment. Användningen av programvara för bildanalys möjliggör kvantifiering av aggregerade fenotyper från mikrografer, inklusive aggregerad volym, yta och position i tre dimensioner till närmaste 0,1 μm, både på individaggregats- och befolkningsnivå. Att ha förmågan att gruppera aggregat efter fenotyp och position möjliggör differentiering av aggregat i olika utvecklingsstadier med precision, liksom deras svar på en föränderlig mikromiljö6,11.
Tillämpningen av SCFM2 för att studera Pa-aggregat i låg volym och hög genomströmningsanalyser gör det till en flexibel, kostnadseffektiv modell. Som definierat medium erbjuder SCFM2 enhetlighet och reproducerbarhet på flera plattformar, vilket ger en näringsmässigt och fysiskt relevant metod för att studera Pa-aggregat in vitro9. Applikationer inkluderar dess användning i kombination med CLSM för att observera rumslig organisation och antibiotikatolerans vid hög upplösning (som beskrivs i detta metodpapper). Förmågan att utföra experiment som ger data i mikronskala i realtid gör det möjligt att studera interaktioner mellan arter och mellan arter eftersom de kan förekomma in vivo. Till exempel har SCFM2 tidigare använts för att studera den rumsliga dynamiken i cellcellskommunikation i aggregerade populationer via ett nätverk av system som används av Pa för att reglera flera gener som bidrar till virulens och patogenes6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Figur 1: Grafisk skildring av deviktigaste experimentella stegen. B)Aggregat överförs till det konfokala mikroskopet och antibiotika tillsätts. Avbildade är tre tekniska replikat (kamrar 1-3) och en kontrollbrunn (4) av inokulerad SCFM2 utan antibiotikabehandling. Aggregat avbildas med CLSM under loppet av 18 h. (C) Efter den första 18-h imaging behandlas aggregat med propidium iodid för att visualisera döda celler och avbildas med CLSM (D) Aggregat med önskad fenotyp separeras från SCFM2 med FACS. Förkortningar: SCFM2 = syntetisk cystisk fibros sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokal laserskanningsmikroskopi; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Här demonstreras nyttan av SCFM2 för att studera effekten av antibiotikabehandling på Pa-aggregat i realtid, följt av användning av en cellsorteringsmetod för att isolera populationer av aggregat med distinkta fenotyper för nedströmsanalys ( figur1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) är en av de vanligaste opportunistiska patogenerna i samband med cystisk fibros (CF). När Pa kolonisering är etablerad bildar en stor del av de infekterande bakterierna biofilmer inom luftvägssputum. Pa biofilmer isolerade från CF sputum har visat sig växa i små, täta aggregat på ~ 10-1,000 celler som är rumsligt organiserade och uppvisar kliniskt relevanta fenotyper såsom antimikrobiell tolerans. En av de största utmaningarna med att studera hur Pa-aggregat svarar på den föränderliga sputummiljön är bristen på näringsmässigt relevanta och robusta system som främjar aggregerad bildning. Med hjälp av ett syntetiskt CF sputum medium (SCFM2) kan livshistoriken för Pa-aggregat observeras med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) och bildanalys i upplösningen av en enda cell. Detta in vitro-system gör det möjligt att observera tusentals aggregat av varierande storlek i realtid, tre dimensioner och på mikronskalan. På individ- och befolkningsnivå underlättar förmågan att gruppera aggregat efter fenotyp och position observation av aggregat i olika utvecklingsstadier och deras svar på förändringar i mikromiljön, såsom antibiotikabehandling, som ska differentieras med precision.

Detta arbete beskriver metoder för att observera Pa aggregat med hög upplösning och i en miljö som liknar den för kronisk infektion i CFlunga 9,10,12. SCFM2 tillhandahåller ett in vitro-system som främjar naturlig aggregering av Pa-celler i storlekar som liknar de som observerats under faktisk infektion10. SCFM2:s anpassningsförmåga som definierat medium kan utnyttjas f...

Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Syntetisk cystisk fibros sputum medium (SCFM2) kan användas i kombination med både confocal laser scanning mikroskopi och fluorescensaktiverad cell sortering för att observera bakteriella aggregat med hög upplösning. Detta dokument beskriver metoder för att bedöma aggregerade populationer under antimikrobiell behandling som en plattform för framtida studier.

Verktyg för realtidsbedömning av en Pseudomonas aeruginosa-infektionsmodell

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Vårt protokoll ger oss ett sätt att studera antibiotikaresistenta bakterier i en näringsmässig och fysisk miljö som liknar hur de sannolikt existerar in vivo. En av de största fördelarna med denna teknik är förmågan att fånga högupplösta bilder och fenotypiska data av bakterier i infektionsrelevanta populationsstorlekar. Det är aggregat på cirka 10 till 1 000 celler.Alexa Gannon, forskarassistent från mitt laboratorium, visar att proceduren kommer att vara alexa Gannon. För att börja sterilisera det mucinhaltiga mediet under ultraviolett ljus i fyra timmar. Överför det UV-behandlade mucinet till sterila 1,7 milliliter rör under sterila förhållanden och förvara rören vid minus 20 grader Celsius.Efter att ha förberett den buffrade basen, tillsätt lagerlösningen av mucin i den buffrade basen som innehåller DNA enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Kvällen före experimentet inokulerar fem milliliter LB-buljong med flera kolonier av Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 från ett antibiotikum som innehåller LB agarplatta och odlar bakterierna över natten vid 37 grader Celsius med agitation vid 250 varv per minut. Nästa morgon, minst två timmar innan experimentet påbörjas, slå på det konfokala laserskanningsmikroskopet och öppna inkubationsmodulen i tillhörande bildframställningsprogram.Späd 500 mikroliter av kulturen i fem milliliter färsk LB-buljong och inkubera bakteriesuspensionen vid 37 grader Celsius och 250 varv per minut i 60 till 90 minuter. När bakterierna har kommit in i timmerfasen pelletar bakteriecellerna genom centrifugering och tvättar cellerna tre gånger med filtersteriliserad PBS. Efter den sista tvätten, återanvänd pelleten i en milliliter PBS.Mät absorbansen av bakteriecellsupphängningen vid 600 nanometer för att bestämma den odlingsvolym som krävs för en optisk densitet på 0, 05 i fem milliliter syntetisk cystisk fibros sputum medium två. Inokulera den beräknade volymen bakteriecellsupphängning i mediet och virveln försiktigt innan du lägger till en milliliter celler till varje kammare i en fyrakammaroptisk odlingsrätt och inkubera sedan bakterierna i fyra timmar under statiska förhållanden vid 37 grader Celsius. För att avbilda Pseudomonas aeruginosaaggregaten med konfokal laserskanningsmikroskop, i slutet av inkubationen, beutser tre brunnar av odlingsplattan som antibiotikabehandling replikat och en samt ingen behandlingskontroll och placera plattan på det uppvärmda stadiet i mikroskopet.Välj ett 63X oljesänkningsmål och öppna fliken hitta för att identifiera bakterieaggregaten i det ljusa fältet. Definiera ett område för avbildning inom varje brunn och använd positionsmodulen för att lagra områdespositionen. Ställ excitationsvåglängden till 488 nanometer och utsläppsvåglängden till 509 nanometer.I anskaffningsmodulen väljer du alternativet Z-stack för att hämta bilderna och använder modulen för linjesnitt för att minska bakgrundsflödet i GFP-kanalen inom den totala volymen av Z-stack-avbildningarna. Ställ in tidsseriealternativet för att fånga 60 segment i varje brunn med 15 minuters intervall i 18 timmar och använd den bestämda fokusstrategin för att lagra ett fokusplan för varje position som kommer att avbildas igen vid varje tidpunkt under hela experimentet. 4-1/2 timmar efter att avbildningsexperimentet har inrättats, avbilda varje position för att bestämma den aggregerade biomassan i var och en av de fyra brunnarna före tillsats av antibiotikumet.Efter sex timmar, tillsätt försiktigt antibiotika två gånger under den minsta hämmande koncentrationen till mitten av varje brunn bara blåsa luft flytande gränssnittet och klicka på starta experimentet för att börja post-antibiotiska behandling imaging. För att isolera levande celler, i slutet av 18-timmars avbildningsperioden, märka bakterierna i varje brunn med lämplig volym propidiumid enligt tillverkarens rekommendationer. I slutet av inkubationen, använd en isolerad behållare för att överföra plattan till flödescytometern och ställ cytometern för att upptäcka GFP- och propidiumjodid med ett 70 mikronmunstycke, kör sedan en milliliter alikvoter av varje kultur supernatant vid lägsta flödeshastighet för att sortera de livskraftiga GFP-positiva och icke-livskraftiga propidium iodide negativa Pseudomonas aeruginosa aggregaten.För att kvantifiera den aggregerade dynamiken, ladda bilderna i ett lämpligt bildanalysprogram och skapa histogram av de räkningar som produceras för obehandlad kontroll och antibiotikabehandlade kulturer i GFP-kanalen för att möjliggöra kvantifiering av bakgrundsfluorescensen. För att säkerställa att de detekterade GFP-voxelsna korrelerar med bakteriebiomassan, definiera en GFP-positiv voxel som större än eller lika med 1,5 gånger GFP-bakgrundsräkningsvärdet. Producera ISO-ytorna för alla återstående voxels och för att upptäcka enskilda aggregat, aktivera alternativet dela objekt och definiera aggregaten som objekt.Använd utsiktsmodulen för att beräkna volymen XYZ och summan av GFP-voxels för varje enskilt objekt. Exportera dessa data till en extern statistisk plattform. Filtrera exporterade data efter storlek för att definiera objekt med volymer som är större än eller lika med fem kubikmikrometrar.Ta bort alla objekt som är mindre än 0,5 kubikmeter och använd utsiktsmodulen för att beräkna avståndet för varje objekt i förhållande till andra objekt i varje bild. Alternativt kan avståndet beräknas med hjälp av formeln och sedan använda summan och genomsnittsberäkningarna för att bestämma den totala biomassan i den genomsnittliga aggregerade volymen. Även om flera livskraftiga bakterieaggregat kvarstår efter fyra timmars antibiotikaanvändning, reduceras den totala biomassan hos de aggregerade populationerna inom de antibiotikabehandlade kulturerna avsevärt jämfört med den för obehandlade kulturer.Tidsseriemikroskopi kan användas för att bestämma de rumsliga mönstren mellan känsliga propidiumididpositiva och toleranta GFP-positiva aggregat efter antibiotikabehandling. Genom att beräkna hur aggregat av olika storlekar bidrar till den totala populationen kan mönster för hur aggregat svarar på antibiotikabehandling i förhållande till deras storlek, form och position identifieras. Efter antibiotikabehandling kan livskraftiga och icke-livskraftiga aggregat framgångsrikt separeras enligt deras fluorescerande signaluttryck.Vi hoppas att detta protokoll inspirerar andra forskare att studera sin organism efter en liknande upplösning. Vårt mål är att hitta gemensamma biologiska trådar i dessa komplexa samhällen oavsett infektionsplats.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kultur modeller av Pseudomonas aeruginosa Biofilmer odlas på levande mänskliga Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa och Saccharomyces cerevisiae biofilm i Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolering av Pseudomonas aeruginosa Kolonisera Murine mag-tarmkanalen

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Långsiktig Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway infektion hos möss

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studera Microbial gemenskaperna<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av Host-medierad interaktion mellan<em&gt; Candida albicans</em&gt; Och<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Komma till den ljus sidan: In Vivo övervakning av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniska sår i en diabetiker hårlösa murina modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av beställt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon införande mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder för att upptäcka cytotoxiska amyloid följande infektion av pulmonell Endothelial celler av Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...