Name: tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

S.E.D, Güney Florida Üniversitesi Moleküler Tıp Bölümü tarafından sağlanan başlangıç fonlarının yanı sıra CFF araştırma hibesi (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) ve USF Mikrobiyom enstitüsü tarafından desteklenmektedir. Whiteley laboratuvarına bu makaleyle ilgili veri setlerini içeren devam eden işbirliği için teşekkür ederiz. Dr. Charles Szekeres'e FACS sıralamasını kolaylaştıran için teşekkür ederiz. Rakamlar A.D.G ve S.E.D tarafından Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

1. Sentetik kistik fibrozis ortamı (SCFM2) hazırlayın
NOT: SCFM2'nin hazırlanması aşağıda özetlenen üç ana aşamadan oluşur (Şekil 2). Tüm ayrıntılar ve referanslar içinbkz.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> Şekil 2<...

<ol>
	<li>Ramsay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+prevalence+of+pulmonary+infection+in+with+fibrosis:+A+longitudinal+analysis.">The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).</li><li>Bessonova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+the+US+and+UK+cystic+fibrosis+registries+support+disease+modification+by+CFTR+modulation+with+ivacaftor.">Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor.</a> Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).</li><li>Breuer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+prevalence+of+lower+airway+infections+in+young+children+with+cystic+fibrosis.">Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).</li><li>O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+the+treatment+of+patients+with+serious+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections.</a> Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+determinants+of+quorum+signaling+in+a+Pseudomonas+aeruginosa+infection+model.">Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).</li><li>Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibiotic+tolerance+arising+from+antibiotic-triggered+accumulation+of+pyocyanin+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+to+antimicrobial+agents-how+P.+aeruginosa+can+escape+antibiotics.">Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum.">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+inhibit+pathogen+dissemination+by+targeting+bacterial+migrants+in+a+chronic+infection+model.">Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model.</a> MBio. 8 (2), 00240 (2017).</li><li>Jorth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+isolation+drives+bacterial+diversification+within+cystic+fibrosis+lungs.">Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs.</a> Cell Host &amp; Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Davies, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cell-to-cell+signals+in+the+development+of+a+bacterial+biofilm.">The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.</a> Science. 280 (5361), 295-298 (1998).</li><li>Hartmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+microbial+communities+with+BiofilmQ.">Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ.</a> Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).</li><li>Stacy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+fight-and-flight+responses+enhance+virulence+in+a+polymicrobial+infection.">Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).</li></ol>

Bu çalışma, antibiyotik tedavisinin varlığında ve yokluğunda bakteriyel agrega popülasyonlarını incelemek için birleştirilebilen metodolojileri getirmiştir. Yüksek çözünürlüklü CLSM, agrega biyokütleslerindeki değişikliklerin görselleştirilmesine ve antibiyotiklere maruz kaldığında agregaların gerçek zamanlı olarak yapısal yönelimine olanak tanır. Ek olarak, antibiyotiklerle tedaviden sonra kalan biyokütlenin fiziksel ve yapısal özellikleri, bu gözlemleri RNA-seq kullanarak gelecekte...

Pseudomonas aeruginosa (Pa), bağışıklık sistemi zayıf bireylerde kronik enfeksiyonlar oluşturan fırsatçı bir patojendir. Genetik hastalığı kistik fibrozis (CF) olanlar için, bu enfeksiyonlar ömür boyu sürebilir. CF, zaman içinde çeşitli mikrobiyal patojenler tarafından kolonize edilen hava yollarında viskoz, besin bakımından zengin bir balganın birikmesine neden olur. Pa, erken çocukluk döneminde hava yollarını kolonlaştıran ve tedavisi zor enfeksiyonlar kuran en yaygın CF patojenlerinden biridir1. Pa önemli bir klinik sorun olmaya devam ediyor ve son yıllarda iyileştirilmiş tedavi rejimlerine rağmen CF'lilerde önde gelen bir ölüm nedeni olarak kabul ediliyor2,3. Bu kalıcılık fenotipi ve artan antibiyotik toleransı, Pa'ya hem Hastalık Kontrol Merkezleri (CDC) hem de Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi için araştırma öncelikleri olarak tanımlanan bir grup patojende yer kazandırdı-ESKAPE patojenleri4.
Diğer ESKAPE patojenleri gibi, edinilmiş antibiyotik direnci Pa'da yaygındır, ancak Pa antimikrobiyal toleransa katkıda bulunan birçok içsel özellik de vardır. Bunlar arasında Pa'nın CF hasta balgam 5,6dahil olmak üzere birden fazla enfeksiyonda gözlemlenebilen ~ 10-1.000 hücreden oluşan agregalar-son derece yoğun kümeler oluşturma yeteneği vardır. Diğer biyofilm sistemlerinde çalışılan Pa'ya benzer şekilde, Pa agregaları antibiyotiklere karşı direncin artması ve hücre-hücre iletişiminin aktivasyonu (çekirdek algılama (QS)) gibi klinik olarak ilgili fenotipler gösterir. Örneğin, Pa agregalarının diğer mikroplarla mücadele etmek ve piocyanin üretimi gibi antimikrobiyal tedavileri tolere etmek için QS tarafından düzenlenmiş davranışları kullandığı gösterilmiştir7. Bu tür davranışları inceleme yeteneği, insan vücudunda var olduklarına benzer bir ortamda bakteri ekosistemleri hakkında heyecan verici bir içgörü sunar.
Pa agregalarının değişen balgam ortamına nasıl tepki verdiğini incelemenin en büyük zorluklarından biri, agrega oluşumunu destekleyen besinsel olarak alakalı ve sağlam sistemlerin olmamasıdır. Pa hakkında bilinenlerin çoğu, hücrelerin planktonik olarak büyüdüğü in vitro sistemler kullanılarak veya in vivo8'degözlemlenmeyen karakteristik bir yüzeye bağlı "mantar" mimarisi kullanılarak keşfedilmiştir. Akış hücreleri veya katı agar gibi klasik biyofilm büyüme modelleri bakteriyel davranışlar ve antibiyotik tolerans mekanizmaları hakkında kapsamlı ve değerli bilgiler vermiş olsa da, bu bulgular her zaman in vivo olarak çevrilmez. Birçok in vitro model, insan enfeksiyon bölgesinin büyüme ortamını taklit etme yeteneğine sahiptir ve pahalı in vivo çalışmalar gerektirir. Buna karşılık, birçok in vivo model in vitro tekniklerin sağladığı esneklik ve çözünürlükten yoksundur.
Sentetik kistik fibrozis balgam (SCFM2), CF akciğerinde kronik enfeksiyon sırasında yaşananlara benzer pa büyümesi için bir ortam sağlamak üzere tasarlanmıştır. SCFM2, müsin, lipitler ve DNA'ya ek olarak balgam sputasında tanımlanan besin kaynaklarını içerir. SCFM2'deki pa büyümesi, gerçek balgamda büyüme için gerekene ayarlanmış neredeyse aynı geni gerektirir ve doğal Pa agrega oluşumunudestekler 9,10. Aşılamadan sonra, planktonik hücreler genişleme yoluyla boyutu artan agregalar oluşturur. Tek tek hücreler (göçmenler olarak adlandırılır) agregalardan serbest bırakılır, kavunlanmamış alanlara geçirilir ve yeni agregalaroluşturur 10. Bu yaşam öyküsü, tek bir hücrenin çözünürlüğünde CLSM ve görüntü analizi kullanılarak gözlemlenebilir. SCFM2'de oluşan Pa agregaları CF akciğer10'dagözlenenlere benzer boyutlardadır. Bu model, mikron ölçeğinde gerçek zamanlı ve üç boyutta değişen boyutta birden fazla agreganın gözlemlenmesine izin verir. Zaman atlamalı mikroskopi, bir deneyde binlerce (~50.000) agreganın izlenmesini sağlar. Görüntü analizi yazılımının kullanımı, toplam hacim, yüzey alanı ve konum dahil olmak üzere mikrograflardan agrega fenotiplerinin hem bireysel toplam hem de popülasyon seviyelerinde en yakın 0,1 μm'ye kadar üç boyutta ölçülmesine olanak tanır. Agregaları fenotip ve konuma göre gruplandırma yeteneğine sahip olmak, farklı gelişim aşamalarındaki agregaların hassasiyetle farklılaştırılmasına ve değişen bir mikroçevreme6,11'eyanıt vermelerine izin verir.
SCFM2'nin Pa agregalarını düşük hacimli ve yüksek verimli testlerde incelemek için uygulanması, onu esnek, uygun maliyetli bir model haline getirir. Tanımlanmış bir ortam olarak SCFM2, birden fazla platformda homojenlik ve tekrarlanabilirlik sunarak Pa agregalarını in vitro9'daincelemek için besinsel ve fiziksel olarak alakalı bir yöntem sağlar. Uygulamalar, mekansal organizasyonu ve antibiyotik toleransını yüksek çözünürlükte gözlemlemek için CLSM ile birlikte kullanılmasını içerir (bu yöntem makalesinde açıklandığı gibi). Gerçek zamanlı, mikron ölçeğinde veriler sağlayan deneyler yapabilme yeteneği, tür içi ve türler arası etkileşimlerin vivo olarak ortaya çıkabileceği şekilde incelenmesineizin verir. Örneğin, SCFM2 daha önce virülans ve patogenez6'yakatkıda bulunan birden fazla geni düzenlemek için Pa tarafından kullanılan bir sistem ağı aracılığıyla hücre-hücre iletişiminin toplam popülasyonlardaki mekansal dinamiklerini incelemek için kullanılmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Şekil 1: Ana deneysel adımların grafiksel tasviri. (A) SCFM2 Pa hücreleri ile aşılanır ve cam tabanlı bir kültür çanağı içinde agrega oluşturmasına izin verilir. (B) Agregalar konfokal mikroskopa aktarılır ve antibiyotik eklenir. Antibiyotik tedavisi olmadan üç teknik kopya (oda 1-3) ve aşılanmış SCFM2 kontrol kuyusu (4) tasvir edilir. Toplamlar 18 saat boyunca CLSM kullanılarak görüntülenir. Kısaltmalar: SCFM2 = sentetik kistik fibrozis balgam ortamı; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokal lazer tarama mikroskopisi; FACS = floresanla etkinleştirilen hücre sıralama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Burada, SCFM2'nin antibiyotik tedavisinin Pa agregaları üzerindeki etkisini gerçek zamanlı olarak incelemek için faydası gösterilmiştir, ardından aşağı akış analizi için farklı fenotiplere sahip agrega popülasyonlarını izole etmek için bir hücre sıralama yaklaşımının kullanılması (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-41-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine HCl</td>
			<td>MP</td>
			<td>1119-34-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Prepared in 0.5 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid HCl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>138-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine HCl H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-32-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ornithine HCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>63-91-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>73-22-3</td>
			<td>Prepared in 0.2 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11141</td>
			<td>Prepared in 1.0 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>72-18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J6194903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day-of Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td>
			<td>4235-95-4</td>
			<td>shake 15-20 min at 37 &#176;C to evaporate chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 * 7H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7782-63-0</td>
			<td>this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13242</td>
			<td>pH stock to 7 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 * 6H2O</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucosamine</td>
			<td>&#160;TCI</td>
			<td>A0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepared solids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1778-100G</td>
			<td>UV-sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66764MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64189</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>7757-79-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23100-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23120-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acr<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62420/62420eq1v10.png" />s Organics</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td>add solid directly to buffered base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes w/air flow cap</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>21-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm four chamber glass-bottom dish</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>NC0600518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) broth</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>11-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p200)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips (p1000)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>23-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (25 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (50 mL)</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>18-194</td>
			<td>Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10&#160; mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>794412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (50 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm PES syringe filter</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS cuvette semi-mico</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>91-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare the figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsDiva6.1.3</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>version 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FacsAriallu</td>
			<td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools for the real-time assessment of a pseudomonas aeruginosa infection model

Pseudomonas aeruginosa (Pa), kistik fibrozis (CF) ile ilişkili en yaygın fırsatçı patojenlerden biridir. Pa kolonizasyonu kurulduktan sonra, enfekte olan bakterilerin büyük bir kısmı hava yolu balgamının içinde biyofilmler oluşturur. CF balgamından izole edilen pa biyofilmlerinin, mekansal olarak organize edilmiş ve antimikrobiyal tolerans gibi klinik olarak ilgili fenotipler sergileyen ~10-1.000 hücrenin küçük, yoğun agregalarında büyüdüğü gösterilmiştir. Pa agregalarının değişen balgam ortamına nasıl tepki verdiğini incelemenin en büyük zorluklarından biri, agrega oluşumunu destekleyen besinsel olarak alakalı ve sağlam sistemlerin olmamasıdır. Sentetik bir CF balgam ortamı (SCFM2) kullanılarak, Pa agregalarının yaşam öyküsü konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) ve tek bir hücrenin çözünürlüğünde görüntü analizi kullanılarak gözlemlenebilir. Bu in vitro sistem, değişen büyüklükteki binlerce agreganın gerçek zamanlı, üç boyutlu ve mikron ölçeğinde gözlemlenmesine izin verir. Birey ve nüfus düzeylerinde, agregaları fenotip ve pozisyona göre gruplama yeteneğine sahip olmak, agregaların farklı gelişim aşamalarında gözlemlenmesine ve antibiyotik tedavisi gibi mikroçevrimdeki değişikliklere yanıtlarının hassasiyetle ayırt edilmesine kolaylaştırır.

Bu çalışma, Pa agregalarını yüksek çözünürlükte ve CF akciğer 9 ,10,12'nin kronik enfeksiyonuna benzer bir ortamda gözlemleme yöntemlerinidetaylandırıyor. SCFM2, Pa hücrelerinin gerçek enfeksiyon sırasında gözlemlenenlere benzer boyutlarda doğal olarak toplanmasını destekleyen bir in vitro sistem sağlar10. SCFM2'nin tanımlanmış bir ortam olarak uyarla...

Watch this Scientific Journal Video about Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model at JoVE.com

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Sentetik kistik fibrozis balgam ortamı (SCFM2), bakteriyel agregaları yüksek çözünürlükte gözlemlemek için hem konfokal lazer tarama mikroskopisi hem de floresan ile aktive hücre sıralama ile birlikte kullanılabilir. Bu makalede, antimikrobiyal tedavi sırasında toplam popülasyonları gelecekteki çalışmalar için bir platform olarak değerlendirme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar.

Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Protokolümüz, antibiyotiğe dirençli bakterileri, muhtemelen in vivo olarak var olduklarına benzer bir beslenme ve fiziksel ortamda incelememiz için bir yol sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajlarından biri, enfeksiyonla ilgili popülasyon boyutlarında bakterilerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini ve fenotipik verilerini yakalama yeteneğidir. Bu yaklaşık 10 ila 1.000 hücreden oluşan bir agrega.Prosedürü gösteren alexa Gannon olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans araştırma asistanı. Başlamak için, dil içeren ortamı dört saat boyunca ultraviyole ışık altında sterilize edin. UV ile işlenmiş mücin steril koşullarda steril 1.7 mililitre tüplere aktarın ve tüpleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.Tamponlu tabanı hazırladıktan sonra, metin el yazmasında açıklandığı gibi DNA içeren tamponlu tabana mucin stok çözeltisini ekleyin. Deneyden önceki akşam, LB agar plakası içeren bir antibiyotikten pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91'in birkaç kolonisi ile beş mililitre LB suyu aşıla ve bakterileri dakikada 250 devirde ajitasyonla 37 santigrat derecede bir gecede kültüre edin. Ertesi sabah, deneye başlamadan en az iki saat önce, konfokal lazer tarama mikroskobu açın ve ilişkili görüntüleme yazılımındaki inkübasyon modülunu açın.Kültürün 500 mikrolitresini beş mililitre taze LB suyunda seyreltin ve bakteri süspansiyonu 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde 60 ila 90 dakika kuluçkaya bırakın. Bakteriler kütük fazı içine girdiğinde, bakteri hücrelerini santrifüjleme ile peletleyin ve filtre sterilize PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, peleti bir mililitre PBS'de yeniden ıslatır.Beş mililitre sentetik kistik fibrozis orta ikisinde 0,05 optik yoğunluk için gereken kültür hacmini belirlemek için bakteri hücresi süspansiyonunun emiciliğini 600 nanometrede ölçün. Dört odalı bir optik kültür çanağının her odasına bir mililitre hücre eklemeden önce orta ve girdaptaki bakteri hücre süspansiyonunun hesaplanan hacmini hafifçe aşılayın, ardından bakterileri 37 santigrat derecede statik koşullar altında dört saat kuluçkaya yatırın. Pseudomonas aeruginosa agregalarını konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülemek için, inkübasyonun sonunda, antibiyotik tedavisi çoğalırken kültür plakasının üç kuyusunu ve bir tedavi kontrolünün olmamasını belirleyin ve plakayı mikroskoptaki ısıtmalı aşamaya yerleştirin.Bir 63X yağ daldırma hedefi seçin ve parlak alanda bakteriyel agregaları tanımlamak için bulma sekmesini açın. Her kuyuda görüntüleme için bir alan tanımlayın ve alan konumunu depolamak için konumlar modülunu kullanın. Heyecan dalga boyunu 488 nanometreye, emisyon dalga boyunu 509 nanometreye ayarlayın.Alma modülünde, görüntüleri elde etmek için Z yığını seçeneğini seçin ve Z yığını görüntülerinin toplam hacmi içinde GFP kanalındaki arka plan floresanını azaltmak için çizgi ortalama modülini kullanın. 18 saat boyunca her kuyuda 15 dakikalık aralıklarla 60 dilim yakalamak için zaman serisi seçeneğini ayarlayın ve deneme boyunca her zaman noktasında yeniden görüntülenecek her konum için bir odak düzlemi depolamak için kesin odak stratejisini kullanın. Görüntüleme deneyini kurduktan 4-1/2 saat sonra, antibiyotik eklenmeden önce dört kuyunun her birinde toplam biyokütleyi belirlemek için her pozisyonu görüntüleyin.Altı saat sonra, her kuyunun ortasına minimum inhibitör konsantrasyonun iki kat altında yavaşça antibiyotik ekleyin, sadece hava sıvı arayüzünü üfleyin ve antibiyotik sonrası tedavi görüntülemeye başlamak için deneye başlayın. Canlı hücreleri izole etmek için, 18 saatlik görüntüleme süresinin sonunda, her kuyudaki bakterileri üreticinin önerilerine göre uygun miktarda propidium iyodür ile etiketleyin. Kuluçkanın sonunda, Plakayı akış sitometresine aktarmak için yalıtımlı bir kap kullanın ve 70 mikron nozul kullanarak GFP ve propidium iyodürü tespit etmek için sitometreyi ayarlayın, ardından uygulanabilir GFP pozitif ve uygun olmayan propidium iyodür negatif Pseudomonas aeruginosas agregalarını sıralamak için her kültür süpernatantının bir mililitre aliquots'ını en düşük akış hızında çalıştırın.Toplama dinamiklerini ölçmek için görüntüleri uygun bir görüntü analizi yazılım programına yükleyin ve arka plan floresanının ölçülmesine izin vermek için GFP kanalındaki işlenmemiş kontrol ve antibiyotik tedavi edilen kültürler için üretilen sayıların histogramlarını oluşturun. Tespit edilen GFP voksellerinin bakteriyel biyokütle ile ilişkili olduğundan emin olmak için, GFP pozitif bir voksel'i GFP arka plan sayısı değerinin 1,5 katından büyük veya buna eşit olarak tanımlayın. Kalan tüm vokseller için ISO yüzeyleri üretin ve tek tek agregaları algılamak için bölünmüş nesneler seçeneğini etkinleştirin ve toplamları nesne olarak tanımlayın.Her bir nesne için XYZ birimini ve GFP voksellerinin toplamını hesaplamak için bakış modülünü kullanın. Bu verileri harici bir istatistik platformuna verin. Beş metreküp mikrometreden büyük veya buna eşit birimlere sahip nesneleri tanımlamak için dışa aktarılan verileri boyuta göre filtreleyin.0,5 kübik mikrometreden küçük nesneleri kaldırın ve her nesnenin her görüntüdeki diğer nesnelerle ilgili mesafesini hesaplamak için bakış modülünü kullanın. Alternatif olarak, mesafe formül kullanılarak hesaplanabilir, daha sonra ortalama toplam hacimdeki toplam biyokütleyi belirlemek için toplam ve ortalama hesaplamaları kullanabilirsiniz. Dört saatlik antibiyotik uygulamasından sonra birden fazla canlı bakteriyel agrega kalsa da, antibiyotikle tedavi edilen kültürlerdeki toplam popülasyonların toplam biyokütlesi, tedavi edilmemiş kültürlere kıyasla önemli ölçüde azalır.Zaman serisi mikroskopisi antibiyotik tedavisinden sonra hassas propidium iyodür pozitif ve hoşgörülü GFP-pozitif agregalar arasındaki mekansal kalıpları belirlemek için kullanılabilir. Farklı boyutlardaki agregaların genel popülasyona nasıl katkıda bulunduğunu hesaplayarak, agregaların antibiyotik tedavisine boyutlarına, şekillerine ve konumlarına göre nasıl yanıt verdiklerine dair kalıplar tanımlanabilir. Antibiyotik tedavisinden sonra, canlı ve canlı olmayan agregalar floresan sinyal ifadelerine göre başarıyla ayrılabilir.Umarız bu protokol diğer araştırmacılara da benzer bir çözünürlükte seçtikleri organizmayı incelemeleri için ilham verir. Amacımız, enfeksiyon bölgesinden bağımsız olarak bu karmaşık topluluklarda ortak biyolojik iplikler bulmaktır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...